* Biến nạp vào tế bào E. coli
Nguyên tắc:
Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hoá chất hoặc điện trường sẽ bị thay đổi trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ khiến cho các phân tử DNA có thể chui vào. Sau đó, các tế bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp sẽ được phát hiện trên môi trường chọn lọc.
Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E. coli H10b hoặc E. coli DH5α:
Nhặt một khuẩn lạc cấy ria lên đĩa LB đặc, ủ ở 37°C qua đêm.
Nhặt 1 khuẩn lạc trên đĩa ủ qua đêm và nuôi trong 2 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C qua đêm.
Chuyển 300 µl dịch nuôi cấy sang 30 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C trong 3 giờ.
Chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã được làm lạnh trên đá, ly tâm 5000 v/p, 4°C trong 10 phút để thu cặn.
Hòa tan cặn nhẹ nhàng (có thể dùng đầu côn để làm tan tế bào) trong 0.7 đến 1.5 ml dung dịch CaCl2 (tùy theo lượng tế bào nhiều hay ít), ly tâm 5.000 v/p, 4°C, 10 phút để thu cặn.
Tiếp tục lặp lại bước trên 1–2 lần.
Bổ sung glycerol 60% theo tỷ lệ 1 : 2 so với lượng CaCl2 dùng để rửa, dùng pipet trộn đều nhẹ nhàng.
Hút 80 µl – 100 µl vào ống Eppendorf 1.5 ml đã được giữ lạnh trên đá và cất ngay trên đá hoặc bảo quản ở tủ –80°C.
Tế bào khả biến có thể dùng ngay hoặc để trên bình đá hay cất vào tủ lạnh dùng trong 3 ngày hoặc làm lạnh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở –80°.
Quy trình biến nạp:
Đặt tế bào khả biến E. coli DH10b hoặc E.coli DH5α vào đá khoảng 30 phút nếu tế bào khả biến cất giữ ở – 80°C.
Bổ sung 5µl sản phẩm của phản ứng ghép nối ở trên vào mỗi ống tế bào E. coli DH10b hoặc E. coli DH5α, đảo nhẹ và ủ trong đá 15 phút.
Sốc nhiệt ở 42°C trong 70 giây, đặt ngay vào đá 5 phút.
Bổ sung 300 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C trong 1 giờ.
Cấy trải toàn bộ dịch nuôi ra đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin hoặc kanamycin (50mg/ml).
Nuôi ở 37°C qua đêm, chọn các khuẩn lạc.
* Phương pháp biến nạp vào tế bào A. tumefaciens Chuẩn bị tế bào khả biến A. tumefaciens
Làm mới giống trên môi trường thạch YEB có bổ sung kháng sinh thích hợp.
Nuôi cấy lắc vi khuẩn trong 2 ml môi trường LB ở 28°C, 6 – 8 giờ.
Lấy 1 ml dịch vi khuẩn trên nuôi cấy tiếp ở 28°C qua đêm trên 100 ml môi trường LB lỏng + 0,1% glucose đến khi OD660nm đạt 1– 1,5.
Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5000 v/p, 20 phút để thu cặn tế bào Rửa cặn 3 lần trong 10 ml 1 mM HEPES (N–2–hydroxyethylpiperazine–N’–2– ethanesulfonic acid) pH 7,0; 1 lần trong 10 ml 10% glycerol.
Cặn hòa lại trong 500 – 700 µl 10% glycerol.
Chia 100 µl dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và bảo quản ở – 80°C.
Quy trình biến nạp vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện
Vector được đưa qua cột thôi gel để tinh sạch, nồng độ sau khi qua cột tinh sạch là 40 – 50 ng/µl.
Làm tan tế bào khả biến (TBKB) trên đá 30 phút.
Thêm 5 – 10 µl sản phẩm DNA ngoại lai.
Để trên đá 10 phút, cuvet được ngâm cồn, chiếu đèn tím khử trùng rồi làm lạnh trong đá 5 phút, sau đó bổ sung dịch TBKB vào trong cuvet.
Xung điện ở 25F, 2,5kV, 400Ω.
Bổ sung 800 µl SOC vào cuvet, chia ra 3 ống Eppendorf, lắc ở 28°C trong 2 giờ.
Trải đĩa với lượng lần lượt là 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl lên đĩa môi trường đặc YEB có bổ sung rifamycin, kanamycin, ampicillin và nuôi ở 28°C trong 2 ngày.
Nhặt nuôi một số khuẩn lạc trong 5 ml – 7 ml YEB bổ sung kháng sinh thích hợp.