trung gian vào Ti plasmid
Để thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp, vector pCAMBIA1300 được sử dụng làm vector nhận và đoạn chèn được thu nhận lại từ vector trung gian có kí hiệu
~ 0,7 kb ~ 0,6 kb Kb M 1 2
pKS_xylB_hph cùng được cắt bằng enzyme Kpn I. Kpn I có vị trí cắt ở hai đầu của hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph nằm trên vector trung gian, do đó khi xử lý vector trung gian bằng Kpn I, chúng tôi sẽ thu được đoạn gen mong muốn để nối ghép với vector pCB1300, tạo thành vector biểu hiện. Vector này có cấu trúc bao gồm: (đoạn khởi đầu GpdA + xylB + đoạn kết thúc TrypC) và (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC). Đoạn DNA chèn và vector nhận sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn Kpn I và thu lại nhờ tinh chế sản phẩm trên gel agarose sẽ được nối ghép với nhau bằng phản ứng lai dưới sự hỗ trợ của enzyme T4 DNA ligase. Ti plasmid tái tổ hợp tạo thành mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B, có kích thước phân tử khoảng 15,4 kb. Kích thước này lớn hơn so với kích thước của vector pCB1300 do vậy, dưới điện trường, DNA plasmid của Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph sẽ di chuyển chậm hơn so với DNA plasmid của vector pCB1300. Một số khuẩn lạc được nhặt nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/ml) ở 37°C qua đêm, sau đó kiểm tra DNA plasmid để lựa chọn các dòng cao hơn trên hình ảnh điện ảnh di để tiến hành kiểm tra sự có mặt của xylB trong Ti plasmid tái tổ hợp.