nghiên cứu bảo tồn quỹ gen virus cường độc dịch tả vịt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - NGUYỄN THỊ VINH THỦY NGHIÊN CỨU BẢO TỒN QUỸ GEN VIRUS CƯỜNG ĐỘC DỊCH TẢ VỊT CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS SỬ THANH LONG HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu trực tiếp thực với hướng dẫn TS Sử Thanh Long– Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Mọi giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Vinh Thủy Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nỗ lực thân, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ cá nhân tập thể Lời đầu tiên, xin nói lời cảm ơn chân thành tới TS Sử Thanh Long, PGS.TS Nguyễn Bá Hiên – người Thầy tận tình giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài, trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp Đồng thời, xin chân thành cảm ơn thầy, cô môn Ngoại sản, môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm thầy, cô khoa Thú y tạo điều kiện giúp hoàn thành đề tài nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy, cô giáo giảng dạy suốt trình học tập nghiên cứu trường Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ Trạm Thú y huyện Mê Linh, Cán lãnh đạo nhân dân xã, thị trấn thuộc huyện Mê nơi tiến hành điều tra nghiên cứu đề tài, nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Vinh Thủy Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích, yêu cầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh dịch tả vịt 1.1.1 Lịch sử phân bố bệnh 1.1.2 Truyền nhiễm học 1.1.3 Triệu chứng bệnh tích 1.1.4 Chẩn đoán 1.1.5 Biện pháp can thiệp phòng bệnh dịch tả vịt 11 1.2 Virus gây bệnh dịch tả vịt 13 1.2.1 Hình thái, kích thước 14 1.2.2 Sức đề kháng 14 1.2.3 Độc lực 15 1.2.4 Đặc tính nuôi cấy 15 1.3 Miễn dịch chống virus dịch tả vịt 16 1.3.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 16 1.3.2 Các loại kháng thể chống virus dịch tả vịt 17 1.3.3 Độ dài miễn dịch 19 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii Chương NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nội dung nghiên cứu 22 2.1.1 Thu thập phân lập virus dịch tả vịt cường độc từ vịt nhiễm bệnh tự nhiên 2.1.2 22 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủng virus dịch tả vịt cường độc thu thập phân lập 22 2.1.3 Đánh giá lại chất lượng chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-O4 22 2.2 Nguyên liệu 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp điều tra bệnh dịch tả vịt 23 2.3.2 Phân lập virus dịch tả vịt 23 2.3.3 Phương pháp xác định đặc tính sinh học virus dịch tả vịt 23 2.3.3 Phương pháp xác định số EID50 (liều gây nhiễm 50% phôi) chủng virus dịch tả vịt 2.3.4 24 Phương pháp xác định số LD50 (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) chủng virus cường độc dịch tả vịt cần kiểm tra 25 2.3.5 Phương pháp giám định chủng virus dịch tả vịt kỹ thuật PCR 25 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 29 Kết thu thập phân lập virus dịch tả vịt cường độc lấy từ bệnh phẩm tự nhiên 3.1.1 29 Tình hình dịch bệnh Dịch tả vịt huyện Mê Linh năm gần 29 3.1.2 Phân lập virus cường độc dịch tả vịt địa phương 39 3.1.3 Phân lập virus cường độc dịch tả vịt phôi vịt 41 3.2 Khảo sát số đặc tính sinh học virus dịch tả vịt cường độc 44 3.2.1 Khả thích ứng ổn định chủng virus dịch tả vịt phôi vịt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 44 Page iv 3.2.2 Kết xác định số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt 52 3.2.3 Kết xác định số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt 55 3.2.4 Kết xác định số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt 58 3.3 Giám định chủng virus cường độc dịch tả vịt ML- 14 kỹ thuật PCR 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 Kết luận 64 Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 66 Page v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CPE : Cytopathic pathogene effect Cs : cộng DEF : Duck Embryo Fibroblast DEV : Duck enteritis virus DNA : Dezoxy nucleic acid DVE : Duck virus enteritis ELD50 : 50 percent Embryo Lethal Dose EID50 : 50 percent Embryo Infective Dose KIR : Killer cell Inhibitory Receptor LD50 : 50 percent Lethal Dose MHC : Major Histocompatibility Complex OIE : Office International des Epizooties PBS : Phosphate Buffered Saline PCR : Polymerase chain reaction p : page SN : Serum Neutralization Tr : trang VSV-TN : Vi sinh vật - Truyền nhiễm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Tình hình bệnh dịch tả vịt số nước Châu Á 3.1 Kết điều tra tình hình bệnh Dịch tả vịt năm 2012 huyện Mê Linh 32 3.2 Kết điều tra tình hình mắc bệnh Dịch tả vịt năm 2013 33 3.3 Kết điều tra tình hình mắc bệnh Dịch tả vịt tháng đầu năm 2014 35 3.4 Kết phân lập virus cường độc dịch tả vịt vịt 41 3.5 Kết phân lập virus cường độc dịch tả vịt phôi vịt 43 3.6 Kết cấy truyền virus cường độc dịch tả vịt ML-14 phôi vịt 46 3.7 Kết cấy truyền virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 phôi vịt 3.8 49 Kết kiểm tra bệnh tích đại thể phôi sau gây nhiễm virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 3.9 51 Kết kiểm tra bệnh tích đại thể phôi sau gây nhiễm virus cường độc dịch tả vịt phân lập Mê Linh 3.10 51 Kết xác định số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 3.11 53 Kết xác định số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt phân lập Mê Linh 3.12 54 Kết xác định số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 3.13 56 Kết xác định số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt ML-14 3.14 57 Kết xác định số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 3.15 59 Kết xác định số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt ML-14 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 60 Page vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Bản đồ phân bố bệnh dịch tả vịt TG (2011) 1.2 Cấu trúc virus Herpesviridae 3.1 Biểu đồ so sánh tỷ tệ vịt chết mắc dịch tả vịt lứa tuổi 14 qua năm huyện Mê Linh 36 3.2 Triệu chứng vịt bị mắc bệnh Dịch tả vịt 38 3.4 Triệu chứng vịt bị liệt chân mắc bệnh Dịch tả vịt 38 3.5 Bệnh tích vịt bị mắc bệnh Dịch tả vịt: 39 3.6 Bệnh tích vịt bị mắc bệnh Dịch tả vịt gan, lách xuất huyết, hoại tử 39 3.7 Bệnh tích vịt bị mắc bệnh Dịch tả vịt màng bao tim xuất huyết, hậu môn xuất huyết 39 3.7 Ruột xuất huyết, loét, đóng vảy 40 3.8 Ruột xuất huyết hình vòng nhẫn 40 3.9 Phôi vịt bị nhiễm virus dịch tả vịt (bên trái) xuất huyết, còi cọc 42 3.10 Sản phẩm PCR đoạn gen AND- polymerase virus dịch tả vịt cường độc phân lập huyện Mê Linh, TP Hà Nội, có sử dụng cặp mồi đặc hiệu DEV-7F/ DEV-7R (OIE – 2012) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 62 Page viii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Dịch tả vịt bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan mạnh loài thủy cầm loại ADN virus thuộc nhóm Herpesvirus gây Đây bệnh gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi vịt Bệnh gây nên tình trạng bại huyết, xuất huyết cho vịt với tỷ lệ chết cao lên đến 90% Theo Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN Quyết định số 64/2005/QĐ–BNN Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn ban hành ngày 13/10/2005 bệnh dịch tả vịt coi bệnh nguy hiểm động vật, phải áp dụng biện pháp phòng bệnh bắt buộc Bệnh dịch tả vịt bệnh phải tiêm phòng bắt buộc yêu cầu tỷ lệ tiêm phòng phải đạt 100% Để phòng chống có hiệu bệnh dịch tả vịt, việc thu thập lưu giữ nguồn gen virus gây bệnh với mục đích cung cấp giống cho việc chế tạo kháng huyết thanh, kháng nguyên dùng chẩn đoán nhanh bệnh lựa chọn chủng cường độc tiêu chuẩn phục vụ cho nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin Nhiều loại vacxin dịch tả vịt sản xuất lưu hành thị trường Việt Nam Song việc sử dụng vacxin chủ yếu lại người chăn nuôi định Hơn khâu chăn nuôi chưa hợp lý, vệ sinh phòng bệnh chưa triệt để ảnh hưởng nhiều đến hiệu bảo hộ vacxin Theo số tài liệu công bố, virus dịch tả vịt có serotype giới Việt Nam có subtype virus dịch tả vịt Việc phân lập, nghiên cứu virus dịch tả vịt từ thực địa Việt Nam công việc cấp thiết nhằm làm rõ loại virus lưu hành, mức độ độc lực tiến tới phục vụ cho công tác nghiên cứu sản xuất vacxin phù hợp Hiện môn Vi Sinh Vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam có giống virus cường độc dịch tả vịt VG-04 Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I - Cục Thú y lưu giữ giống Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Bảng 3.11 Kết xác định số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt phân lập Mê Linh Lần TN I II III Độ pha loãng virus 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 Liều gây nhiễm (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Số phôi TN 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Số thực tế Số Sô phôi phôi chết sống 5 4 3 2 5 5 5 4 2 4 5 5 3 2 4 5 ELD = 10-6,6/0,2 ml Số tính toán Số Số phôi phôi chết sống 34 29 24 20 16 12 6 11 15 20 25 30 31 26 21 16 12 11 15 19 24 29 29 24 19 14 11 13 17 21 26 31 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Tỷ lệ phôi chết (%) 100 100 96 90,9 84,2 66,7 42,3 21,4 6,25 0 100 100 100 94,1 85,7 66,7 41,7 21,4 11,8 5,0 0 100 100 100 87,5 73,3 57,1 35,7 18,8 10,5 4,5 0 ELD50 10-6,8 10-6,7 10-6,3 Page 54 Chỉ số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt ML-14 phôi vịt biến động khoảng từ 10-6,3 đến 10-6,8/0,2 ml ELD50 trung bình chủng 10-6,6/0,2 ml Như kết số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt phân lập huyện Mê Linh phù hợp với đặc tính sinh học chủng virus cường độc dịch tả vịt công bố trước 3.2.3 Kết xác định số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt Để xác định số EID50 chủng virus phân lập huyện Mê Linh, thực 03 lần chuẩn độ phôi vịt 11 ngày tuổi Virus pha loãng theo số 10 (từ 10-1 đến 10-12) Mỗi độ pha loãng tiêm vào xoang niệu mô phôi với liều 0,2 ml/phôi Tương tự tiến hành thí nghiệm xác định số EID50 chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04 lưu trữ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y Sau 96 theo dõi, ghi số liệu tính kết EID50 theo công thức Read Muench Kết trình bày bảng 3.12 bảng 3.13 Qua bảng 3.12 thấy y kết xác định số EID50 với chủng Virus dịch tả vịt cường độc VG-04 sau: - Ở lần chuẩn độ thứ nhất, EID50 chủng đạt 10-7,83/0,2 ml - Ở lần chuẩn độ thứ hai, EID50 chủng đạt 10-8,50/0,2 ml - Ở lần chuẩn độ thứ ba, EID50 chủng đạt 10-8,81/0,2 ml Chỉ số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 phôi vịt biến động khoảng từ 10-7,3 đến 10-8,81/0,2 ml EID50 trung bình chủng 10-8,38/0,2 ml Khảo sát trước Nguyễn Bá Hiên (2006) cho biết EID50 trung bình chủng virus cường độc dịch tả vịt chủng VG-2004 10-8,74/0,2 ml Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 Bảng 3.12 Kết xác định số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 Lần TN I II III Độ pha loãng virus Liều gây nhiễm (ml) Số phôi TN 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Số thực tế Số tính toán Sô Số Số Số phôi phôi phôi phôi nhiễm không không nhiễm nhiễm nhiễm 37 32 27 22 17 13 10 14 18 23 40 35 30 25 20 16 12 3 5 3 11 15 20 41 36 31 26 21 17 13 4 10 3 10 14 19 -8,38 EID 50 = 10 /0,2 ml Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Tỷ lệ phôi nhiễm (%) 100 100 100 100 94,44 86,67 69,23 46,15 28,57 12,5 5,26 100 100 100 100 95,2 88,9 80,0 61,5 38,5 21,4 6,3 100 100 100 100 95,5 89,5 76,5 66,7 46,2 23,1 6,7 EID50 10-7,83 10-8,50 10-8,81 Page 56 Bảng 3.13 Kết xác định số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt ML-14 Lần TN I II III Độ pha loãng virus Liều gây nhiễm (ml) Số phôi TN 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Số thực tế Số tính toán Sô Số Số Số phôi phôi phôi phôi không không nhiễm nhiễm nhiễm nhiễm 39 34 29 24 19 15 11 2 10 5 20 39 34 29 24 19 15 11 3 12 16 21 41 36 31 26 21 16 12 3 10 14 19 EID = 10-8,5/0,2 ml Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Tỷ lệ phôi nhiễm (%) 100 100 100 100 100 93,8 84,6 63,6 40 16,7 16,7 100 100 100 100 95 88,2 73,3 57,1 35,7 20 5,9 100 100 100 100 100 94,1 85,7 66,7 41,7 23,1 6,7 EID50 10-8,58 10-8,33 10-8,7 Page 57 Qua bảng 3.13 thấy kết xác định số EID50 chủng virus Dịch tả vịt cường độc ML-14 sau: - Ở lần chuẩn độ thứ nhất, EID50 chủng đạt 10-8,58 /0,2 ml - Ở lần chuẩn độ thứ hai, EID50 chủng 10-8,33/0,2 ml - Ở lần chuẩn độ thứ ba, EID50 chủng 10-8,7/0,2 ml Chỉ số EID50 chủng virus cường độc dịch tả ML-14 phôi vịt biến động khoảng từ 10-8,33 đến 10-8,7/0,2 ml ELD50 trung bình chủng 10-8,5/0,2 ml Như chủng virus cường độc dịch tả vịt ML-14 chủng VG-2004 ổn định đặc tính sinh học nuôi cấy phôi vịt 3.2.4 Kết xác định số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt Chúng sử dụng giống virus cường độc dịch tả vịt ML-14 pha loãng với nước sinh lý thành nồng độ 10-1 đến 10-12 Sau tiêm nồng độ cho vịt 25 ngày tuổi với liều 0,5ml/con Trong có làm đối chứng Theo dõi vịt chết đem mổ khám, thu lấy gan để làm nguyên liệu phân lập virus giám định virus Đếm số vịt chết tính số LD50 theo công thức Reed Muench Tương tự tiến hành thí nghiệm xác định số LD50 chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04 lưu trữ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y Kết trình bày qua bảng 3.14 bảng 3.15 Qua bảng 3.14 cho thấy: Chỉ số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 biến động khoảng từ 10-9,00 đến 10-9,17/0,5 ml LD50 trung bình chủng 10-9,09/0,5 ml Chủng virus khảo sát số LD50 từ năm 2004 có kết trung bình 10-9,69/0,5 ml (Nguyễn Bá Hiên, 2006) Trần Minh Châu (1980) công bố chủng virus cường độc dịch tả vịt 769 có LD50 = 10-9,58/ml với vịt ngày tuổi LD50 = 10-6,73 với vịt trưởng thành Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 Bảng 3.14 Kết xác định số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 Độ Liều Lần pha gây TN loãng nhiễm virus (ml) Số tính toán vịt Số vịt Số vịt Số vịt Số vịt TN chết sống chết sống Tỷ lệ vịt chết 0,5 5 42 100 10 -2 0,5 5 37 100 10-3 0,5 5 32 100 -4 0,5 5 27 100 10-5 0,5 22 95,65 10 -6 0,5 18 90,0 10 -7 0,5 14 82,35 10 -8 0,5 10 71,43 10 -9 0,5 6 50 10 -10 0,5 3 25 10 -11 0,5 13 7,14 10 -12 0,5 5 18 -1 0,5 5 43 100 10-2 0,5 5 38 100 -3 0,5 5 33 100 10-4 0,5 5 28 100 10 -5 0,5 5 23 100 10 -6 0,5 18 90,0 10 -7 0,5 14 87,5 10 -8 0,5 10 71,43 10 -9 0,5 53,84 10 -10 0,5 30,76 10 -11 0,5 13 13,33 10 -12 0,5 17 5,56 10 LD50 (%) 10 10 II Số thực tế -1 10 I Số 10-9,0 10-9,17 LD 50 = 10-9,09/0,5ml Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 Bảng 3.15 Kết xác định số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt ML-14 Độ Liều Lần pha gây Số vịt TN loãng nhiễm TN virus (ml) Tỷ lệ Số vịt Số vịt Số vịt Số vịt chết sống chết sống vịt chết 0,5 5 45 100 10 -2 0,5 5 40 100 10-3 0,5 5 35 100 -4 0,5 5 30 100 10-5 0,5 5 25 100 10 -6 0,5 5 20 100 10 -7 0,5 15 93,8 10 -8 0,5 11 84,6 10 -9 0,5 63,6 10 -10 0,5 36,4 10 -11 0,5 11 15,4 10 -12 0,5 15 6,3 -1 0,5 5 44 100 10-2 0,5 5 39 100 -3 0,5 5 34 100 10-4 0,5 5 29 100 10 -5 0,5 5 24 100 10 -6 0,5 19 95,0 10 -7 0,5 15 88,2 10 -8 0,5 11 78,6 10 -9 0,5 58,3 10 -10 0,5 33,3 10 -11 0,5 11 15,4 10 -12 0,5 5 16 10 LD50 (%) 10 10 II Số tính toán -1 10 I Số thực tế 10-9,5 10-9,33 LD50 = 10-9,41/0,5ml Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 Qua bảng 3.15 cho thấy: Chỉ số LD50 chủng virus cường độc dịch tả ML-14 biến động khoảng từ 10-9,33 đến 10-9,5/0,5 ml LD50 trung bình chủng 10-9,41/0,5 ml Như vậy, chủng virus dịch tả vịt phân lập đạt yêu cầu chủng virus dịch tả vịt cường độc Chủng virus cường độc dịch tả vịt phân lập năm 2014 Mê Linh có số sinh học tương đương với số sinh học chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 Những chủng nghiên cứu thêm số đặc tính sinh học phân tử nhằm phục vụ trình sản xuất vacxin phòng bệnh dịch tả vịt Việt Nam 3.3 Giám định chủng virus cường độc dịch tả vịt ML- 14 kỹ thuật PCR Để giám định chủng virus cường độc ML-14 kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi (primer) bám đặc hiệu hệ gen DNApolymerase hệ gen virus dịch tả vịt theo quy định OIE, 2012 sau: Mồi xuôi (DEV-7F): 5’- GAAGGCGGGTATGTAATGTA -3’ Mồi ngược (DEV-7R): 5’- CAAGGCTCTATTCGGTAATG -3’ Kích TT Mục đích chẩn đoán Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) thước sản phẩm Nguồn (bp) Dịch tả vịt (Duck Enteritis DEV-7F: GAAGGCGGGTATGTAATGTA DEV-7R: CAAGGCTCTATTCGGTAATG 446 (OIE – 2012) Virus) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 *Kết chẩn đoán dịch tả vịt phản ứng PCR M 500 bp 446 bp 250 bp Hình 3.10 Sản phẩm PCR đoạn gen AND- polymerase virus dịch tả vịt cường độc phân lập huyện Mê Linh, TP Hà Nội, có sử dụng cặp mồi đặc hiệu DEV-7F/ DEV-7R (OIE – 2012) M DNA marker (1Kb DNA ladder, INtRON Biotechnology) Giếng – 4: mẫu bệnh phẩm tương ứng với mẫu Giêng1: DTV cường độc chủng VG-04 Giếng 2.3.4 bệnh phẩm thu từ đàn vịt nghi bị Dịch tả vịt huyện Mê Linh – Hà Nội Giếng 5: Đối chứng âm Qua ảnh 3.10, nhận thấy hai cặp mồi bám đặc hiệu vùng gen DNA-polymerase hệ gen hai chủng virus dịch tả vịt Điều thể việc đoạn gen đặc hiệu nhân lên với số lượng lớn sau chạy điện di, chụp ảnh lên vạch sáng (band) Như vậy, sản phẩm PCR thu có kích thước 446 bp cho thấy cặp mồi đặc hiệu virus dịch tả vịt nhân đoạn AND có độ dài 446 bp dự kiến (đúng thông báo OIE, 2012) Qua kết luận mẫu bệnh phẩm lấy từ đàn vịt bị bệnh huyện Mê Linh, TP Hà Nội có chứa virus cường độc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62 dịch tả vịt chủng virus VG-04 virus dịch tả vịt, chủng cung cấp khuôn hệ gen AND để thực phản ứng PCR đặc hiệu trình bày Về nguyên tắc, PCR phản ứng có tính đặc hiệu cao nhạy Cho dù khuôn chứa nhiều loại ADN (gọi ADN tổng số), cặp mồi đặc hiệu vùng gen bám vào vùng gen cho sản phẩm đặc hiệu Khi thực với khuôn ADN tổng số tách từ mẫu bệnh phẩm có chứa hệ gen virus dịch tả vịt, cặp mồi đặc hiệu dịch tả vịt cho sản phẩm PCR có độ dài dự đoán (446bp) Từ kết kết luận virus bệnh phẩm giám định xác virus dịch tả vịt (duck enteritis virus = DEV) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1.Trên đàn vịt nuôi xã, thị trấn huyện Mê Linh có lưu hành bệnh dịch tả vịt Bệnh xảy giống vịt lứa tuổi (vịt thịt vịt đẻ) với tỷ lệ chết cao 1.2 Từ vịt bệnh phân lập chủng virus dịch tả vịt cường độc thông qua phương pháp phân lập qua vịt, phôi trứng vịt ấp 11 ngày khẳng định phương pháp PCR Chủng đại diện chọn lọc ML-14 có độc lực cao, gây chết vịt với tỷ lệ 98,3% thích ứng phôi vịt với tỷ lệ chết phôi 91,6% gây nhiễm 100% phôi vịt, số ELD50 10-6,6/0,2 ml, số EID50 10-8,5/0,2 ml, LD50 = 10-9,41/0,5ml 1.3 Với chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04 bảo quản 860C dạng nước trứng tươi sau năm lấy kiểm tra đặc tính sinh học cho thấy chủng virus cường độc có đặc tính sinh học ổn định Cụ thể là: - Khả nhân lên ổn định phôi trứng vịt với tỷ lệ chết phôi cao có bệnh tích phôi điển hình - Các số sinh học phôi ổn định: số ELD50 10-6,94/0,2ml, số EID50 10-8,38/0,2 ml, LD50 = 10-9,09/0,5ml - Khả gây chết phôi vịt cao, số ELD50= 10-6,94/0,2ml phù hợp với đặc tính sinh học chủng trước bảo quản -860C Như vậy, hai chủng virus cường độc dịch tả vịt ML-14 phân lập chủng virus VG-04 bảo quản sử dụng làm chủng virus cường đôc tiêu chuẩn để phục vụ nghiên cứu vacxin phòng bệnh dịch tả vịt đàn vịt Việt Nam Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 Đề nghị 2.1 Sử dụng chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 làm chủng cường độc tiêu chuẩn nghiên cứu vacxin nghiên cứu bệnh lý bệnh dịch tả vịt 2.2 Chủng virus cường độc dịch tả vịt ML-14 nghiên cứu thêm số đặc tính sinh học phân tử nhằm phục vụ trình sản xuất vacxin phòng bệnh dịch tả vịt Việt Nam 2.3 Nghiên cứu điều kiện tối ưu để bảo tồn giống virus dịch tả vịt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Archie Hunter (2002), Sổ tay dịch bệnh động vật (TS Phạm Gia Ninh Nguyễn Đức Tâm dịch), NXB LD Ringer Thống Nhất, Hà Nội Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2005), Quyết định Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn số 63/2005/QĐ - BNN ngày 13 tháng 10 năm 2005 việc Ban hành Quy định tiêm phòng bắt buộc vacxin cho gia súc, gia cầm Trần Minh Châu (1980), Chủng virus cường độc 769 sử dụng vacxin để phòng bệnh, Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội Trần Minh Châu (1987), Bệnh dịch tả vịt, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Trần Minh Châu (1996), 100 câu hỏi bệnh chăn nuôi gia súc, gia cầm, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Ngọc Điểm (2005), Tình hình bệnh dịch tả vịt đàn vịt nuôi ngoại thành Hà Nội số tỉnh lân cận Phân lập, khảo sát đặc tính sinh học chủng virus cường độc, Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn Ngọc Điểm, Đặng Hữu Anh (2006), “Phân lập khảo sát số đặc tính sinh học chủng virus cường độc dịch tả vịt để phục vụ việc nghiên cứu vacxin phòng bệnh”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, XIII, số 4-2006, Hội Thú y Việt Nam Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương Đặng Hữu Anh (2009), "Khảo sát đặc tính sinh học chủng virus vacxin nhược độc DP-EG-2000" Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XVI, số 5, tr 5-10 Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương Đặng Hữu Anh (2010), “Kiểm tra số đặc tính sinh học chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 để phục vu việc nghiên cứu vacxin phòng bệnh” Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập 7, số 1, tr 5-10 Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh Đỗ Ngọc Thúy (2011), "Giáo trình Bệnh truyền nhiễm thú y, NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Đức Hiền (1999), “Nghiên cứu hiệu lực miễn dịch phòng bệnh vacxin dịch tả vịt áp dụng quy trình tiêm chủng khác nhau, điều kiện sản xuất, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 5, Hội Thú y Việt Nam, tr 37-41 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 Nguyễn Đức Hiền (1999), “Chẩn đoán xác định virus gây bệnh dịch tả vịt Cần Thơ”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, (1), Hội Thú y Việt Nam, tr 24-31 Nguyễn Đức Hiền (2005), “Bệnh tích đại thể, vi thể siêu vi thể bệnh dịch tả vịt thuỷ cầm gây bệnh thực nghiệm”, Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 3/2005, Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh Nguyễn Ngọc Huân (2006), Quy trình thú y an toàn dịch bệnh áp dụng cho gà, vịt nông hộ, Báo Nông nghiệp Việt Nam số 17 ngày 24/1/2006 Phạm Quang Hùng (2003), Con vịt với người nông dân, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Hồng Mận (1999), Bệnh vịt biện pháp phòng trị, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Hồng Mận (2005), Nuôi ngan vịt siêu thịt, NXB Thanh Hoá Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Bá Hiên, Trần Xuân Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đỗ Ngọc Thúy, Phạm Ngọc Thạch Phạm Quang Thái (2011), " Bệnh gia cầm Việt Nam", Sách Nhà nước đặt hàng - NXB Nông nghiệp Nguyễn Vĩnh Phước, Hồ Đình Chúc, Nguyễn Văn Hanh, Đặng Thế Huynh (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2001), Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Phạm Thị Lan Thu Thân Thị Hạnh (1989), “Kết bước đầu phân lập virus dịch tả vịt Phú Khánh”, Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y (1985-1989), Viện Thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr.40-41 Tiếng Anh Baudet A.E.R.F (1923), “Mortality in ducks in the Netherland caused by a filtertable virus, fowl plague”, Tijdschr Diergeneeskd 50, pp 455-459 Brand C.J., and D.E Docherty (1984), “A survay of North American migratory waterfowl for duck plague virus”, J Wildl Dis 20, pp 261-266 Burgess E.C & T.M Yuill (1981), “Increased cell culture incubation temperatures for duck plague virus isolation” Avian Dis 25, pp 222-224 Docherty D.E & Franson C.J (1992) Duck Virus Enteritis In : Veterinary Diagnostic Virology, Castro A.E & Heuschele W.P., eds Mosby Year Book, St Louis, Missouri, USA, 25-28 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 Friend M and G.L Pearson (1973), “Duck plague in wild waterfowl” US Dep Int Sport Fish Wild Bull Washington D.C Guiping Y., Anchun C., Mingshu W., Xiaoying H., Yi Z., Fei L (2007), “Preliminary study on duck enteritis virus induced lymphocyte apoptosis in vivo”, Avian Dis 2007 Jun; 51(2): 546-9 Jansen J (1968), “Duck plague”, J Am Vet Med Assoc 152, pp 1009-1016 Kaleta E.F., Kuczka A., Kuhnhold A., Bunzenthal C., Bonner B.M., Hanka K., Redmann T., Yilmaz A (2007), “Outbreak of duck plague (duck herpesvirus enteritis) in numerous species of captive ducks and geese in temporal conjunction with enforced biosecurity (inhouse keeping) due to the threat of avian influenza A virus of the subtype Asia H5N1” Dtsch Tierarztl Wochenschr 2007 Jan; 114(1): 3-11 Leibovitz L (1991), Duck virus enteritis in disease of poultry, Iowa State University Press, pp 609-618 Li H., Liu S., Kong X (2006), “Characterization of the genes encoding UL24, TK and gH proteins from duck enteritis virus (DEV): a proof for the classification of DEV”, Virus Genes 2006 Oct; 33(2): 221-7 OIE (2000), Manual of Standards for diagnostic test and vaccines, http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00111.htm OIE (2006), Annual animal disease status, http://www.oie.int/hs2/report.asp Woolcock P.R and J Fabricant (1991), Diseases of Poultry Nainth, Iwoa State University Press, Ames, Iwoa USA Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 [...]... chất lượng chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-O4 - Nghiên cứu phục hồi nhân giống virus dịch tả vịt cường độc VG-O4 trên phôi vịt - Nghiên cứu đánh giá chỉ số sinh học ELD50, EID50 của virus dịch tả vịt cường độc VG-O4 - Nghiên cứu khảo sát lại độc lực của virus dịch tả vịt cường độc VG-O4 trên bản động vật (xác định chỉ số LD 50 ) 2.2 Nguyên liệu - Chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 do Bộ môn... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Thu thập và phân lập virus dịch tả vịt cường độc từ vịt nhiễm bệnh trong tự nhiên 2.1.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng virus dịch tả vịt cường độc đã thu thập và phân lập được - Nghiên cứu xác định các chỉ số ELD50, EID50 của chủng virus dịch tả vịt đã thu thập và phân lập được - Nghiên cứu xác định độc lực của chủng virus dịch tả vịt đã thu... vậy chủng virus tuyển chọn này cần được lưu giữ và bảo tồn trong điều kiện tối ưu nhất, đảm bảo sự ổn định lâu dài các đặc tính sinh học để phục vụ yêu cầu nghiên cứu Xuất phát từ tình hình thực tế, từ vấn đề cấp bách của thực tiễn sản xuất chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu bảo tồn quỹ gen virus cường độc Dịch tả vịt 2 Mục đích, yêu cầu - Phân lập được chủng virus cường độc từ các... đàn vịt nhiễm bệnh ngoài tự nhiên Đánh giá đặc tính sinh học và đưa ra kết luận về việc chọn lọc và bảo tồn chủng virus mới phân lập có khả năng sản xuất chế phẩm sinh học, có ý nghĩa trong việc nghiên cứu khoa học về thú y - Đánh giá được tính ổn định đặc tính sinh học, sinh học phân tử của chủng giống virus dịch tả vịt cường độc VG-04 - Bảo tồn được nguồn gen của chủng virus dịch tả vịt cường độc. .. đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của bệnh dịch tả vịt Đáp ứng miễn dịch tế bào có vai trò quan trọng trong miễn dịch của cơ thể với virus dịch tả vịt Qua kết quả nghiên cứu của Jansen thấy rằng: Một số vịt sau khi được tiêm vacxin có hàm lượng kháng thể dịch thể rất thấp nhưng khi đem thử thách với virus dịch tả vịt cường độc thì vẫn được bảo hộ Jansen cho rằng trường hợp này rõ ràng có vai... của virus bằng cách giải thoát sự khống chế việc tổng hợp protein kháng virus Protein này có khả năng khống chế sự phiên dịch các thông điệp của virus ở Ribosome của tế bào Jansen khi nghiên cứu về vai trò của Interferon và hiện tượng cản nhiễm đã chứng minh vacxin còn phát huy tác dụng ngay cả khi vịt đã bị nhiễm virus dịch tả vịt cường độc trước khi tiêm vacxin Nếu nhiễm virus cường độc dịch tả vịt. .. bố bệnh dịch tả vịt trên TG (2011) * Bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam Năm 1999, Nguyễn Đức Hiền (2005) đã mổ khám trên 1176 vịt trong đó 455 vịt được chẩn đoán là mắc bệnh dịch tả vịt Theo thống kê của OIE (2006); Việt Nam là một trong những nước bị bệnh dịch tả vịt gây thiệt hại nặng nề nhất Năm 1999, bệnh đã làm chết 51.752 trong tổng số 123.851 vịt Năm 2000, có 2.964 vịt chết vì bệnh dịch tả vịt trong... tính sinh học của chủng virus này tác giả cho biết virus dịch tả vịt chủng VG-2004 có độc lực mạnh hơn virus dịch tả vịt chủng 769 do tác giả Trần Minh Châu phân lập 1.2.4 Đặc tính nuôi cấy Virus dịch tả vịt không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, không hấp thụ hồng cầu Trong tế bào phôi gà, vịt bị nhiễm virus, virus hình thành tiểu thể bao hàm Trong môi trường nuôi cấy tế bào, virus có khả năng hình... thụ Có thể dùng vịt con 1 ngày tuổi để nuôi cấy virus 3-12 ngày sau vịt chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh Ngoài vịt con có thể dùng ngan con, ngỗng con, gà con mới nở để gây bệnh 1.3 Miễn dịch chống virus dịch tả vịt 1.3.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của vịt đối với virus dịch tả vịt thể hiện bằng sự sản sinh các chất miễn dịch không đặc... miễn dịch ngắn, 3-9 tháng Vacxin nhược độc, nhất là các vacxin virus thường cho đáp ứng miễn dịch mạnh, ổn định và thời gian miễn dịch kéo dài, có thể được một năm, thậm chí suốt đời Trần Minh Châu (1987) nghiên cứu về độ dài miễn dịch của vịt được tiêm phòng vacxin dịch tả vịt nuôi cấy trên phôi vịt cho biết: Vịt con của vịt mẹ chưa được miễn dịch, khi được tiêm vacxin có khả năng sản sinh miễn dịch