Phương pháp giám định chủng virus dịch tả vịt bằng kỹ thuật PCR
* Tách chiết DNA tổng số của virus
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số, mô tả tóm tắt như sau: mẫu bảo quản ở -200C được lấy ra và để ở nhiệt độ phòng cho tan. Nếu mẫu vật là mô cơ quan thì cần được nghiền kỹ rồi mới xử lý, nếu mẫu là nước trứng chứa virus dịch tả vịt đã tiếp truyền (sử dụng trong nghiên cứu này của chúng tôi) thì trực tiếp xử lý với các dung môi của Kit, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết DNA theo qui trình tách chiết của
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
hãng sản xuất như sau:
1. Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 560C trong 3 giờ.
2. Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. Ủ ở 700C trong 30 phút. 3. Thêm 200 µl Ethanol (96 – 100%), trộn đều.
4. Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch ở dưới.
5. Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới.
6. Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch dưới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
7. Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của virus trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 µl Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, đó là ADN tổng số trong đó có hệ gen ADN của virus dịch tả vịt. Ký hiệu mẫu, bảo quản ở -200C.
ADN tổng số tách chiết ra được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 0,8%. Chạy điện di ở hiệu thế 100V trong 25 phút. Chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel Dolphin – Doc (WEALTEC, USA).
* Thiết kế và tổng hợp các cặp mồi
Cặp mồi (primer) sử dụng trong nghiên cứu này gồm có: DEV-7F: 5’- GAAGGCGGGTATGTAATGTA -3’ (xuôi) DEV-7R: 5’- CAAGGCTCTATTCGGTAATG -3’ (ngược)
Các cặp mồi này được tổng hợp dựa trên cơ sở các trình tự cặp mồi đã có của Tổ chức quản lý dịch tễ quốc tế OIE (http://www.oie.int/) và trình tự gen của virus dịch tả vịt đã công bố trên Ngân hàng gen (www.ncbi.nlm.nih.gov). Những cặp mồi này bám đặc hiệu trên vùng gen DNA-polymerase của hệ gen của virus dịch tả vịt.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
* Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR
Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR:
Thứ tự Thành phần Số lượng
1 PCR Master Mix (Promega Inc.) 12,5 µl
2 DTVF (10 pmol/µl) 1,0 µl
3 DTVR (10 pmol/µl) 1,0 µl
4 ADN tổng số làm khuôn (100-150 ng/µl) 1,0 µl
5 Nước tinh khiết (H20) 9,5 µl
Tổng số 25,0 µl
Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:
Thứ tự Tên Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ 1 Duỗi mạch 94 2 1 2 Duỗi mạch 94 1 35 3 Gắn mồi 55 1 4 Tổng hợp sợi mới 72 3 5 Hoàn chỉnh 72 7 1 6 Dừng 4
Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt độ 4oC bảo quản cho đến khi tinh sạch sản phẩm. Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng (để giải trình trình tự trực tiếp, hoặc nếu cần, tiến hành dòng hoá vào vectơ để giải trình trình tự).
* Phát hiện sản phẩm PCR
Chuẩn bị gel agarose 0,2%: Lấy 0,8g thạch agarose nguyên chất, cho vào cốc đong thuỷ tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40ml đệm TAE 1 lần (1xTAE). Cho vào lò vi sóng, đặt nóng chảy trong 3 phút (hoặc 3 phút 30 giây) sao cho
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
agarose tan chảy hết. Đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều răng vào (tuỳ theo cần bao nhiêu mẫu mà bố trí lược có 4, 8 hay 12 răng) và đổ ngập răng lược khoảng 0,5 cm và để nguội ở nhiệt độ phòng. Khi nguội (sau 60-120 phút), các răng lược sẽ tạo thành các giếng để cho mẫu sản phẩm PCR vào kiểm tra.
Dìm ngập khay có gel trong hộp điện di chứa đệm TAE 1 lần (đệm TAE cung cấp ion cho điện trường hoạt động).
Tra mẫu: Lấy 10 µl sản phẩm PCR mỗi loại, trộn với 2 µl chất chỉ thị tra mẫu (loading dye 3X) (thành phần chủ yếu là xanh Bromophenol) với mẫu và tra riêng biệt vào từng giếng trong bản gel.
Tra chỉ thị phân tử (Marker): Trong 1 giếng riêng biệt khác cho 10µl (0,5µg) chỉ thị phân tử (thường dùng: DNA của thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzym giới hạn HindIII).
Chạy điện di ở 100V trong 30-35 phút.
Phát hiện DNA của sản phẩm: Nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (2µg/ml; 15 µl/bản gel), lắc đều trên máy lắc trong 10 phút.
Rửa gel bằng nước cất, sau đó soi qua tia cực tím và chụp ảnh, nhờ máy Dolphin-Doc (WEALTEC, USA).
Kích thước các băng DNA được so sánh với chỉ thị di truyền DNA (DNA marker)