B ảng 3.11 Kết quả xác định chỉ số ELD50 của chủng virus cường độc d ịch tả vịt phân lập tại Mê Linh
3.3. Giám định chủng virus cường độc dịch tả vịt ML-14 bằng kỹ thuật PCR
PCR
Để giám định chủng virus cường độc ML-14 bằng kỹ thuật PCR thì chúng tôi đã sử dụng cặp mồi (primer) bám đặc hiệu trên hệ gen DNA- polymerase của hệ gen virus dịch tả vịt theo quy định của OIE, 2012 như sau:
Mồi xuôi (DEV-7F): 5’- GAAGGCGGGTATGTAATGTA -3’. Mồi ngược (DEV-7R): 5’- CAAGGCTCTATTCGGTAATG -3’.
TT Mục đích chẩn đoán Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Kích thước sản phẩm (bp) Nguồn 1 Dịch tả vịt (Duck Enteritis Virus) DEV-7F: GAAGGCGGGTATGTAATGTA 446 (OIE – 2012) DEV-7R: CAAGGCTCTATTCGGTAATG
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62
*Kết quả chẩn đoán dịch tả vịt bằng phản ứng PCR
M 1 2 3 4 5
Hình 3.10. Sản phẩm PCR của đoạn gen AND- polymerase virus dịch tả vịt cường độc phân lập tại huyện Mê Linh, TP. Hà Nội, có sử dụng cặp
mồi đặc hiệu DEV-7F/ DEV-7R (OIE – 2012).
M là DNA marker (1Kb DNA ladder, INtRON Biotechnology). Giếng 1 – 4: 4 mẫu bệnh phẩm tương ứng với các mẫu.
Giêng1: DTV cường độc chủng VG-04
Giếng 2.3.4 là bệnh phẩm thu từ đàn vịt nghi bị Dịch tả vịt tại huyện Mê Linh – Hà Nội
Giếng 5: Đối chứng âm.
Qua ảnh 3.10, chúng tôi nhận thấy hai cặp mồi đều bám đặc hiệu trên vùng gen DNA-polymerase của hệ gen của hai chủng virus dịch tả vịt. Điều này thể hiện ở việc đoạn gen đặc hiệu được nhân lên với số lượng lớn và sau khi chạy điện di, chụp ảnh đã hiện lên các vạch sáng (band).
Như vậy, sản phẩm PCR thu được có kích thước là 446 bp cho thấy cặp mồi đặc hiệu của virus dịch tả vịt đã nhân được đoạn AND có độ dài 446 bp như đã dự kiến (đúng như thông báo của OIE, 2012). Qua đó kết luận mẫu bệnh phẩm lấy từ đàn vịt bị bệnh tại huyện Mê Linh, TP. Hà Nội có chứa virus cường độc
500 bp
250 bp
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63
dịch tả vịt và chủng virus VG-04 là virus dịch tả vịt, các chủng này đã cung cấp khuôn là hệ gen AND để thực hiện phản ứng PCR đặc hiệu đã trình bày ở trên.
Về nguyên tắc, PCR là phản ứng có tính đặc hiệu rất cao và rất nhạy. Cho dù khuôn chứa nhiều loại ADN (gọi là ADN tổng số), cặp mồi đặc hiệu của vùng gen nào sẽ bám vào vùng gen đó cho sản phẩm đặc hiệu. Khi thực hiện với khuôn là ADN tổng số tách từ mẫu bệnh phẩm có chứa hệ gen của virus dịch tả vịt, cặp mồi đặc hiệu dịch tả vịt đã cho sản phẩm PCR có độ dài như dự đoán (446bp).
Từ các kết quả trên chúng tôi kết luận virus trong bệnh phẩm được giám định chính xác là virus dịch tả vịt (duck enteritis virus = DEV).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64