đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen dẻ trùng khánh - cao bằng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật

đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen dẻ trùng khánh - cao bằng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ Nguyễn Minh Quế ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ TRÙNG KHÁNH - CAO BẰNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ Nguyễn Minh Quế ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ TRÙNG KHÁNH - CAO BẰNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ TÂM Thái Nguyên, năm 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để có được kết quả này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, chân thành đến cô giáo - TS Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin gửi lời cảm ơn các kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Di truyền - Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN và khoa Sau đại học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của gia đình và các bạn bè đồng nghiệp. Mặc dù có nhiều cố gắng, song không tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các quý thầy cô và các bạn. Thái Nguyên, ngày 25 tháng 08 năm 2009 Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi, các số liệu trong công trình này là hoàn toàn trung thực, chính xác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về những kết quả này. Tác giả Nguyễn Minh Quế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm hình thái và hệ thống phân loại dẻ 1.2. Vai trò của cây dẻ 1.3. Một số thành tựu của nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong nhân giống và bảo tồn nguồn gen một số cây trồng 1.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD trong đánh giá mối quan hệ di truyền của một số loài thực vật Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thực vật 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu nuôi cấy mô - tế bào 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật RAPD Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá mối quan hệ di truyền giữa một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật RAPD 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA từ các mẫu lá dẻ 3.1.2. Kết quả phân tích điện di sản phẩm PCR - RAPD 3.1.3. Mối quan hệ di truyền của các mẫu dẻ nghiên cứu 3.2. Kết quả của nhân giống vô tính dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật in vitro 3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của cồn 70o và javen 65% đến khử trùng hạt 1 3 3 7 7 12 16 16 16 16 19 19 22 26 26 26 27 31 34 34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng nhân chồi của dẻ Trùng Khánh trong ống nghiệm 3.2.3. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng ra rễ dẻ 3.2.4. Kết quả đƣa cây ra ngoài môi trƣờng tự nhiên KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 35 42 44 48 50 51 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần cơ bản môi trƣờng WPM Bảng 2.2. Trình tự các nucleotid của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu Bảng 3.1. Hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA của 5 mẫu dẻ nghiên cứu Bảng 3.2. Đa hình về phân đoạn DNA đƣợc nhân bản của 10 mồi ngẫu nhiên Bảng 3.3. Hàm lƣợng thông tin tính đa hình (PIC) của 5 mẫu dẻ Bảng 3.4. Giá trị tƣơng quan kiểu hình (r) theo 3 cách tính về hệ số tƣơng đồng . Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng giữa các mẫu dẻ nghiên cứu Bảng 3.6. Kết quả khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của tổ hợp kinetin và BAP đến sự phát sinh chồi Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo cụm chồi Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng ra rễ dẻ Bảng 3.11. Kết quả đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên 17 19 26 27 28 32 32 34 36 39 41 43 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Các mẫu lá dẻ đƣợc sử dụng làm vật liệu nghiên cứu Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu dẻ trên gel agarose 0,8% Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi TN03 và DTN2 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi DTN1 và OPM5 Hình 3.4. Biểu đồ hình cây các mẫu dẻ nghiên cứu theo hệ số của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA Hình 3.5. Các giai đoạn trong tạo nguyên liệu khởi đầu Hình 3.6. Ảnh hƣởng của BAP đến sự tạo chồi Hình 3.7. Ảnh hƣởng của BAP + kinetin đến sự tạo chồi Hình 3.8. Ảnh hƣởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi dẻ Hình 3.9. Cây dẻ ra rễ Hình 3.10. Cây dẻ con trồng ngoài môi trƣờng tự nhiên với các giá thể khác nhau Hình 3.11. Cây dẻ trồng ngoài môi trƣờng tự nhiên sau 20 tuần 16 26 29 30 33 35 37 40 42 44 46 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn - 1 - MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, rất thuận lợi cho sự phát triển của thực vật nên rừng chiếm một diện tích lớn. Rừng cung cấp nguồn lâm sản, góp phần cân bằng môi trường sinh thái và điều hoà khí hậu. Từ đầu thế kỉ XX, rừng bị tàn phá nặng nề một phần do chiến tranh và một phần do tập quán du canh, di cư, đốt nương, làm rẫy, chặt phá rừng bừa bãi. Nguồn tài nguyên rừng bị cạn kiệt gây ô nhiễm môi trường làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ con người và các sinh vật sống trên trái đất. Trong những năm gần đây, Đảng và nhà nước đã có nhiều chính sách khuyến khích trồng cây gây rừng, phủ xanh đất trống đồi núi trọc và xoá đói giảm nghèo. Dẻ là một trong những loại cây rừng được khuyến khích trồng vì cây dẻ có giá trị kinh tế cao [14]. Các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, hạt đều có thể sử dụng [4]. Cây dẻ sống thích hợp trên điều kiện đất đồi núi khô hạn và nghèo dinh dưỡng [3]. Cách trồng dẻ hiện nay chủ yếu bằng phương pháp cắt cành hoặc cây con bầu đất trong khi hệ số nhân chồi thấp nên lâu cho thu hoạch và hiệu quả chưa cao. Họ dẻ ở Việt Nam không lớn lắm nên việc nhận biết không mấy khó khăn. Tuy nhiên, việc phân biệt các chi trong họ lại khó còn việc định loại các loài trong các chi lớn lại càng khó khăn hơn [4]. Từ những năm 80 của thế kỷ XX trở lại đây, hàng loạt kỹ thuật sinh học phân tử như: PCR, AFLP, RAPD, RFLP, SSR . đã và đang được ứng dụng vào các lĩnh vực: Phân tích và đánh giá hệ gen của thực vật nhằm xác định những thay đổi của dòng được chọn lọc ở mức độ phân tử; sử dụng các chỉ thị phân tử hỗ trợ cho chọn giống cây trồng góp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống; đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài; phân lập và chuyển gen có giá trị kinh tế để nâng cao chất lượng và khả năng chống chịu với các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn - 2 - điều kiện bất lợi cuả môi trường . Thành công của sinh học phân tử hiện đại đã góp phần nâng cao năng suất và chất lượng các giống cây trồng [5], [12]. Để đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và góp phần vào việc bảo tồn nguồn gen cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng, chúng tôi chọn đề tài: "Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật". 2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân tích mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Nghiên cứu môi trường và quy trình nhân giống in vitro dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật RAPD. 3.2. Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. - Khử trùng mẫu: Thăm dò nồng độ cồn, javen và thời gian thích hợp để khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh. - Nhân chồi: Tìm hiểu môi trường tạo chồi thông qua nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và nhóm auxin. - Tạo cây hoàn chỉnh: Tìm hiểu môi trường tạo rễ thông qua nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin. - Đưa cây ra môi trường tự nhiên: Nghiên cứu giá thể và điều kiện thích hợp để đưa cây dẻ con tạo được qua nuôi cấy trong phòng thí nghiệm ra trồng ngoài môi trường. [...]... [38] Theo số liệu phân tích của viện rau quả năm 1999, trong hạt dẻ Trùng Khánh có tỉ lệ các thành phần như sau: glucose 3,3% - 5,4%; gluxit 43,36% 46,67%; lipit 1,16% - 2%; protein 3,12% - 3,62% [38] 1.3 Một số thành tựu của nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong nhân giống và bảo tồn nguồn gen một số cây trồng Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được... bằng kỹ thuật sinh học phân tử - 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu thực vật Ba mẫu hạt dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng thu hoạch tại các địa điểm khác nhau của huyện Trùng Khánh - Cao Bằng vào tháng 9 - 10 năm 2008 Hạt dẻ thu tại Vân Nam - Trung Quốc tháng 11/2008 Hạt dẻ gai thu tại Yên Thế -. .. các giá trị thống kê về giá trị trung bình ( X ), sai số trung bình mẫu (mx) 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kĩ thuật RAPD 2.2.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA Nguyên tắc: Tách được DNA ra khỏi các sản phẩm của tế bào và chiết xuất DNA đảm bảo giữ nguyên cấu trúc và độ tinh sạch Tiến hành: Lá của 5 mẫu dẻ được thu thập, bảo quản lạnh ở - 85oC, tách chiết và. .. phương di n khác nhau như: nghiên cứu thực trạng và giải pháp chủ yếu nhằm phát triển sản xuất hạt dẻ ở tỉnh Cao Bằng của Ngô Xuân Hoàng (2008) [14], nghiên cứu cơ sở phân loại họ dẻ - Fagaceae Durmort ở Việt Nam của Nguyễn Tiến Bân [4] Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay chưa có công trình nào nghiên cứu về việc nhân giống in vitro cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng và mối quan hệ di truyền giữa các giống dẻ bằng. .. kết hợp với nhiều kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận di n chỉ thị phân tử có độ tin cậy Việt Nam là một nước nông nghiệp với sản lượng xuất khẩu lương thực, thực phẩm cao trên thế giới nên cây lương thực, thực phẩm được nhiều tác giả quan tâm nghên cứu Với mục đích nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số giống lạc trồng (Archis hypogaea L.), Chu Hoàng Mậu và Nguyễn Thị Hoa... kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn, Lò Thị Mai Thu, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Bình (2008) tiếp tục đánh giá mối quan hệ di truyền ở mức độ phân tử DNA bằng kỹ thuật RAPD, xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa cạn, tạo cơ sở cho việc tuyển chọn giống lúa cạn chịu hạn làm vật liệu chọn giống, góp phần vào bảo tồn và phát triển nguồn gen cây lúa... DNA trên một phạm vi rộng, thao tác đơn giản, nhanh gọn, ít tốn kém, không cần biết trước trình tự gen của đối tượng cần nghiên cứu, chất lượng DNA không cần độ tinh sạch cao [40] Nhiều nghiên cứu cho thấy, RAPD là kỹ thuật đem lại hiệu quả cao trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và sự đa dạng di truyền, nghiên cứu nguồn gốc loài và lập bản đồ di truyền của thực vật Vì vậy, kỹ thuật RAPD... 4 B 5 1 2 3 4 5 Hình 2.1 Các mẫu lá dẻ được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử thu được từ 5 mẫu hạt dẻ A: Mặt trước lá 1 Dẻ Trung Quốc B: Mặt sau lá 2, 3, 4 Ba mẫu dẻ Trùng Khánh 5 Dẻ Bắc Giang 2.1.2 Hoá chất và thiết bị 2.1.2.1 Hoá chất và thiết bị nuôi cấy mô Các dụng cụ và hoá chất cần thiết để thực hiện quá trình nuôi cấy do phòng Công nghệ tế bào, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm... hoàn toàn) - 25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả đánh giá mối quan hệ di truyền giữa một số mẫu dẻ bằng kĩ thuật RAPD 3.1.1 Tách chiết và tinh sạch DNA từ lá các mẫu dẻ DNA được tách chiết và tinh sạch Sau đó, kiểm tra độ tinh sạch và xác định hàm lượng thông qua máy đo quang phổ hấp thụ ở các bước sóng 260nm và 280nm... chưa cao để phục vụ khai thác và sử dụng cho công nghiệp trong thời gian dài Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn và phát triển cây thông đỏ, tác giả Trần Văn Định, Trần Văn Minh (2007) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy Chồi non sau khi được vô trùng bằng hypochlorite natrium được nuôi cấy trên môi trường MS, WPM, B5, WV3 có bổ sung BAP Nghiên cứu . PHẠM -- -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - - Nguyễn Minh Quế ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ TRÙNG KHÁNH. http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -- -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - - Nguyễn Minh Quế ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT