Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và nghiên cứu bảo tồn nguồn gene

Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và nghiên cứu bảo tồn nguồn gene

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -

Nguyễn Minh Quế

ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ

TRÙNG KHÁNH - CAO BẰNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2009

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -

Nguyễn Minh Quế

ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ

TRÙNG KHÁNH - CAO BẰNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ TÂM

Thái Nguyên, năm 2009

LỜI CẢM ƠN

Để có được kết quả này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, chân thành đến cô giáo - TS Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin gửi lời cảm ơn các kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Di truyền - Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN và khoa Sau đại học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của gia đình và các bạn bè đồng nghiệp

Mặc dù có nhiều cố gắng, song không tránh khỏi những sai sót Tôi rất mong sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các quý thầy cô và các bạn

Thái Nguyên, ngày 25 tháng 08 năm 2009 Tác giả

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi, các số liệu trong công trình này là hoàn toàn trung thực, chính xác Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về những kết quả này

Tác giả

Nguyễn Minh Quế

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm hình thái và hệ thống phân loại dẻ

1.2 Vai trò của cây dẻ

1.3 Một số thành tựu của nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong nhân giống và bảo tồn nguồn gen một số cây trồng

1.4 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD trong đánh giá mối quan hệ di truyền của một số loài thực vật

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu nuôi cấy mô - tế bào

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật RAPD

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả đánh giá mối quan hệ di truyền giữa một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật RAPD

3.1.1 Tách chiết và tinh sạch DNA từ các mẫu lá dẻ

3.1.2 Kết quả phân tích điện di sản phẩm PCR - RAPD

3.1.3 Mối quan hệ di truyền của các mẫu dẻ nghiên cứu

3.2 Kết quả của nhân giống vô tính dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật in vitro

3.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cồn 70o và javen 65% đến khử trùng hạt

1 3 3 7 7

12

16 16 16 16 19 19 22

26 26

26 27 31 34

34

3.2.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân chồi của dẻ Trùng Khánh trong ống nghiệm

3.2.3 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ dẻ

3.2.4 Kết quả đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 35

42 44 48 50 51 56

Bảng 3.3 Hàm lượng thông tin tính đa hình (PIC) của 5 mẫu dẻ Bảng 3.4 Giá trị tương quan kiểu hình (r) theo 3 cách tính về hệ số tương

đồng Bảng 3.5 Hệ số tương đồng giữa các mẫu dẻ nghiên cứu

Bảng 3.6 Kết quả khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và BAP đến sự phát sinh chồi Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo cụm chồi

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ dẻ

Bảng 3.11 Kết quả đưa cây ra môi trường tự nhiên 17 19

26 27

28 32

32 34 36 39 41

43 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Các mẫu lá dẻ được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu dẻ trên gel agarose 0,8% Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi TN03 và DTN2

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi DTN1 và OPM5 Hình 3.4 Biểu đồ hình cây các mẫu dẻ nghiên cứu theo hệ số của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA

Hình 3.5 Các giai đoạn trong tạo nguyên liệu khởi đầu Hình 3.6 Ảnh hưởng của BAP đến sự tạo chồi Hình 3.7 Ảnh hưởng của BAP + kinetin đến sự tạo chồi

Hình 3.8 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi dẻ Hình 3.9 Cây dẻ ra rễ Hình 3.10 Cây dẻ con trồng ngoài môi trường tự nhiên với các giá thể khác nhau

Hình 3.11 Cây dẻ trồng ngoài môi trường tự nhiên sau 20 tuần 16

47

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, rất thuận lợi cho sự phát triển của thực vật nên rừng chiếm một diện tích lớn Rừng cung cấp nguồn lâm sản, góp phần cân bằng môi trường sinh thái và điều hoà khí hậu Từ đầu thế kỉ XX, rừng bị tàn phá nặng nề một phần do chiến tranh và một phần do tập quán du canh, di cư, đốt nương, làm rẫy, chặt phá rừng bừa bãi Nguồn tài nguyên rừng bị cạn kiệt gây ô nhiễm môi trường làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ con người và các sinh vật sống trên trái đất Trong những năm gần đây, Đảng và nhà nước đã có nhiều chính sách khuyến khích trồng cây gây rừng, phủ xanh đất trống đồi núi trọc và xoá đói giảm nghèo

Dẻ là một trong những loại cây rừng được khuyến khích trồng vì cây dẻ có giá trị kinh tế cao [14] Các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, hạt đều có thể sử dụng [4] Cây dẻ sống thích hợp trên điều kiện đất đồi núi khô hạn và nghèo dinh dưỡng [3] Cách trồng dẻ hiện nay chủ yếu bằng phương pháp cắt cành hoặc cây con bầu đất trong khi hệ số nhân chồi thấp nên lâu cho thu hoạch và hiệu quả chưa cao Họ dẻ ở Việt Nam không lớn lắm nên việc nhận biết không mấy khó khăn Tuy nhiên, việc phân biệt các chi trong họ lại khó còn

việc định loại các loài trong các chi lớn lại càng khó khăn hơn [4]

Từ những năm 80 của thế kỷ XX trở lại đây, hàng loạt kỹ thuật sinh học phân tử như: PCR, AFLP, RAPD, RFLP, SSR đã và đang được ứng dụng vào các lĩnh vực: Phân tích và đánh giá hệ gen của thực vật nhằm xác định những thay đổi của dòng được chọn lọc ở mức độ phân tử; sử dụng các chỉ thị phân tử hỗ trợ cho chọn giống cây trồng góp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống; đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài; phân lập và chuyển gen có giá trị kinh tế để nâng cao chất lượng và khả năng chống chịu với các

điều kiện bất lợi cuả môi trường Thành công của sinh học phân tử hiện đại đã góp phần nâng cao năng suất và chất lượng các giống cây trồng [5], [12]

Để đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và góp phần vào việc bảo tồn nguồn gen cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng, chúng tôi chọn đề

tài: "Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và nghiên cứu

bảo tồn nguồn gen cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật"

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân tích mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật sinh học phân tử

- Nghiên cứu môi trường và quy trình nhân giống in vitro dẻ Trùng

Khánh - Cao Bằng nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật RAPD 3.2 Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ

thuật nuôi cấy in vitro

- Khử trùng mẫu: Thăm dò nồng độ cồn, javen và thời gian thích hợp để khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh

- Nhân chồi: Tìm hiểu môi trường tạo chồi thông qua nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và nhóm auxin

- Tạo cây hoàn chỉnh: Tìm hiểu môi trường tạo rễ thông qua nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin

- Đưa cây ra môi trường tự nhiên: Nghiên cứu giá thể và điều kiện thích hợp để đưa cây dẻ con tạo được qua nuôi cấy trong phòng thí nghiệm ra trồng ngoài môi trường

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái và hệ thống phân loại dẻ 1.1.1 Đặc điểm hình thái

Các cây trong họ dẻ thường chỉ gặp một dạng sống (habitus) là cây thân gỗ thường xanh, ít rụng lá trong mùa khô Tuy nhiên, kích thước của chúng có

thể rất thay đổi, tồn tại ở cả 3 dạng: cây bụi (loài Lithocarpus chicocarpa,

Lithocapus eucalyptifolius, Quercus arbutifolia), cây gỗ trung bình và cây gỗ

lớn (ở các loài thuộc chi Lithocarpus, Quercus) với chiều cao dao động từ 5m

- 50m và đường kính từ 1m - 1,3m [4]

Thân cây thường mọc thẳng đứng, phân nhiều cành, đôi khi có bạnh gỗ

(các loài thuộc chi Lithocarpus campylolepis, Quercus quangtriensis, v.v.)

Tuy hầu hết các loài trong họ dẻ là những cây cao, nhưng đôi khi gặp cả những dạng “cây lùn” có chiều cao khoảng 8m - 12m, đường kính thân

khoảng 40cm - 50cm (ví dụ: Castanopsis scortechinii, Lithocarpus

pachycarpus, Quercus thorelii, v.v) Vỏ cây thường là vỏ dày và ăn sâu vào

lớp dác gỗ ngoài Cành con có lỗ vỏ bì (bì khổng, bì khẩu - lenticular) cũng là đặc điểm đặc trưng ở các loài thuộc họ dẻ [4], [27]

Chồi đỉnh là một cấu trúc phức tạp gồm nhiều lá bắc dạng vảy chụm với nhau ở đỉnh cành Trong họ dẻ, chồi đỉnh có thể mọc phân tán hoặc kết cụm Lá trong họ dẻ là lá đơn, phiến lá nguyên; phần lớn có lá kèm, mọc cách, xếp xoắn lại hoặc xếp thành 2 dãy đều đặn trên cành nhưng đôi khi chụm lại ở gần đầu cành con Gân lá dạng lông chim Gân chính đôi khi xếp nổi rõ trên cả 2 mặt Gân bên thường chỉ nổi rõ ở mặt dưới, cong ở mép hoặc song song Lá kèm thường khá lớn và mau rụng, có dạng hình trứng, hình lưỡi, mũi mác, đính bởi gốc chung nhưng đôi khi có hình khiên với cuống ở

giữa phiến Vị trí đính của lá kèm thường ở ngoài cuống lá, nhưng cũng có khi xen với cuống [4]

Hoa ở họ dẻ phần lớn là hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm hình xim Các hoa thường chụm thành bó lưỡng phân trên một trục riêng dài hay ngắn và tạo thành cụm hoa dạng bông đuôi sóc Cụm hoa là đơn tính, lưỡng tính hay hỗn hợp Hoa không có cánh và thụ phấn nhờ gió hoặc sâu bọ thứ sinh Quả dẻ thuộc loại quả đặc biệt và thường được gọi là kiểu “quả đấu” (trước đây gọi là “quả kiên”) [4], [27]

chi Trigonobalanus và Quercus) Trong đó, ở Việt Nam có 6 chi (Castanea,

Castanopsis, Fagus, Lithocarpus, Quercus và Trigonobalamus) với khoảng

210 loài, được xếp vào 3 phân họ Có 3 chi lớn là: Castanopsis (trên 50 loài),

Lithocarpus (khoảng 110 loài) và Quercus (trên 40 loài) Các chi khác chỉ có

từ 1 đến 2 loài [4], [8] Họ dẻ phân bố phổ biến ở vùng cận nhiệt đới và ôn đới của cả 2 bán cầu [27]

Đặc điểm quan trọng nhất để phân biệt các chi trong họ là cấu tạo của cụm hoa và đặc biệt là cấu tạo của đấu với những đặc điểm cấu trúc bên ngoài vỏ đấu Trong trường hợp gặp những dạng đấu trung gian, rất khó xác định

chính xác chúng thuộc Lithocarpus hay Quercus hoặc thậm chí cả

Castanopsis Đó là các loại đấu có các vảy (hay gai) rất nhỏ (đôi khi không

nhìn rõ) Chúng tạo nên ở bề mặt ngoài của những vòng (hay quầng) đồng tâm Thêm nữa, đấu lại bao gần kín các hạch [4]

1.1.2 Chi dẻ Castanea Mill, 1754 (dẻ, dẻ Trùng Khánh)

Chi này gồm dẻ Phansipan (Castanea phansipanensis A.camus) và dẻ Trùng Khánh (Castaneae mollissima Blume) hợp thành

Cây gỗ trung bình đến cây gỗ lớn Chồi đỉnh phân tán, các vảy xếp lợp Lá không có điểm tuyến, xếp xoắn đều đặn và không chụm lại ở đỉnh cành Mép lá có răng cưa ở nửa ngọn Lá kèm ngoài cuống, đính bởi gốc Cụm hoa lưỡng tính (hoa cái ở phần dưới, hoa đực ở đỉnh ngọn), dạng bông (đuôi sóc), ở trên 1 trục dài, gồm các xim rút ngắn, các xim mọc thẳng đứng Xim đực gồm 3 - 7 hoa, hoa đực có 6 mảnh bao hoa, thường có nhị lép, nhị 10 - 12, bao phấn nhỏ, rất ngắn (cỡ 0,25mm - 0,35mm), đính lưng và lắc lư, trung đới

không nhọn đầu Mầm đấu (Cupule primordial) hình thành trước lúc hoa nở

Hoa cái mẫu 6, bao gồm 6 mảnh khá phát triển, có 10 - 12 nhuỵ lép, bầu 3 (6) ô, vòi nhuỵ 3 (6), hình nón hay trụ, núm nhuỵ ở đỉnh, hình chấm nhỏ Đấu bao kín quả, có gai nhọn, chứa (1) 2 (3) hạch, khi chín thường tách thành 4 đến nhiều mảnh Hạch tròn cạnh góc trên mặt cắt ngang [4]

Dẻ Trùng Khánh được trồng nhiều ở Sơn La, Lai Châu, Lạng Sơn và chủ yếu ở Trùng Khánh - Cao Bằng Ở Trung Quốc cũng có loại dẻ này phân bố chủ yếu ở Vân Nam và Quảng Tây [3]

Dẻ Trùng Khánh thuộc loại cây gỗ lớn, cao từ 20m - 25m, đường kính tới 100cm Cây ưa sáng, phát triển trên đất hoang hoá vùng đá vôi chua, ở độ cao 500m - 2000m Ra hoa tháng 2 - 3 hàng năm, cho thu hoạch quả vào tháng 10 - 12 hàng năm [3]

Trong chi có 12 loài phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc Ở Việt Nam có 2 loài, trong đó có 1 loài nhập trồng [4]

1.1.3 Chi dẻ Castanopsis (D.don) Spach, 1841, nom Cons (dẻ gai, cà ổi,

kha thụ)

Là chi lớn gồm 120 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới Châu Á Ở Việt Nam có trên 50 loài [3] Dẻ gai Bắc Giang thuộc chi này

Cây gỗ trung bình đến gỗ to, phần lớn lá thường xanh Chồi đỉnh phân tán (không kết cụm), hình trứng hay hình bầu dục; các vảy xếp lợp hoặc đôi khi có xu hướng xếp thành 2 dãy Vỏ cây dai, dễ bóc, có nhiều xơ sợi dài và đan chéo; tia vỏ nhỏ, cao 10mm - 40mm, lấn sâu vào dác gỗ < 1mm Lá không có điểm tuyến, xếp xoắn đều đặn và không kết chụm lại ở đỉnh cành; mép nguyên hoặc đôi khi có răng cưa nhỏ ở nửa ngọn Lá kèm ngoài cuống, đính bởi gốc Cụm hoa gồm những xim lưỡng phân dày đặc hoặc gồm 1 hoa duy nhất, đơn tính (chỉ mang 1 thứ hoa), ít khi lưỡng tính (hoa cái ở phần dưới, hoa đực ở phần ngọn) hay hỗn hợp, dạng bông (gié, đuôi sóc) ở trên 1 trục dài, gồm các xim rất ngắn Gié đực luôn luôn mọc thẳng đứng Hoa đực có bao hoa hình chuông xẻ (5) 6 (7) thuỳ, có nhuỵ lép; nhị (10) 12 (15); bao phấn rất ngắn (cỡ 0,25mm - 0,35mm), đính lưng và lắc lư; trung đới không nhọn đầu Đấu có gai, mầm đấu hình thành trước lúc hoa nở, đơn độc, có các đường nối dọc rõ, với 2 - 4 (8) điểm phát triển riêng biệt, bao quanh 1 - 3 (7) hoa cái Hoa cái có bao hoa hình chuông, xẻ (5) 6 (7) thuỳ, có 10 - 12 nhị lép; bầu 3 (6) ô (không bị bẹt); vòi nhuỵ 3 - 5, hình nón hay hình trụ; núm nhuỵ ở đỉnh, hình chấm nhỏ Đấu có cuống ngắn hoặc không có cuống, có gai hay gai nhỏ hoặc đôi khi có vảy, hay có khi đấu gần như nhẵn, hoàn toàn bao kín 1 - 3 (7) hạch, khi chín nẻ van hoặc thường tách không đều thành nhiều mảnh Hạch tròn, cạnh góc trên mặt cắt ngang Lá mầm phẳng, lồi Sự nảy mầm dưới đất [4], [27]

Castanopsis boisii Hickel & Camus, 1922 (dẻ gai Yên Thế, dẻ gai Bắc Giang)

Là cây gỗ trung bình, cao khoảng 5m - 20m Cây ưa sáng, thường mọc thành quần thụ, phát triển nhanh trên đất cát pha, ra hoa tháng 10 - 12, mang quả tháng 8 - 10 (VFT) Phân bố chủ yếu ở Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Giang, Quảng Ninh [3], [27]

1.2 Vai trò của cây dẻ

Dẻ có gỗ tốt, có thể dùng trong xây dựng, làm nhà, làm nông cụ, đóng thuyền, làm bao bì Hạt dẻ có chứa nhiều tanin, nhiều loại ăn ngon [3]

Dẻ Trùng Khánh có gỗ khá nặng, có thể dùng trong xây dựng, lá có thể để nuôi tằm Hoa đực khô dùng làm thuốc sát trùng Ăn hạt dẻ chữa thận hư, gối lưng yếu liệt, đi đứng khó khăn Hạt dẻ nướng ăn hoặc tán bột uống chữa trong lạnh, đi tả như xối; hạt dẻ hầm chữa trẻ lở miệng; vỏ đen của hạt dẻ sắc uống chữa nôn ói, ỉa ra máu; vỏ gai của quả sắc uống chữa gân cốt đau nhức, giã đắp đơn sưng, tràng nhạc; hoa sắc uống chữa tràng nhạc, sa đì (viêm tinh hoàn) [3]

Hạt dẻ là loại quả có hương vị thơm ngon, bùi ngậy, ăn hạt dẻ có tác dụng chống oxy hoá trong máu, có lợi cho tim mạch [38]

Theo số liệu phân tích của viện rau quả năm 1999, trong hạt dẻ Trùng Khánh có tỉ lệ các thành phần như sau: glucose 3,3% - 5,4%; gluxit 43,36% - 46,67%; lipit 1,16% - 2%; protein 3,12% - 3,62% [38]

1.3 Một số thành tựu của nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong nhân giống và bảo tồn nguồn gen một số cây trồng

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân

giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo…

[5]

Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công ty giống cây trồng khác nhau Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào khoảng 15% [5]

Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy

in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối

tượng khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu…

Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do nhiều nguyên nhân khác nhau Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng

loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo

ra lượng lớn cây giống có chất lượng tốt

Pơmu (Fokienia hodginsii (Dun) A Henry & H.H Thomas) được xếp

vào loại cây gỗ quý hiếm ở Việt Nam Gỗ pơmu bền, đẹp, thơm được dùng nhiều trong xây dựng và làm đồ thủ công mỹ nghệ Hiện nay, pơmu đang bị khai thác mạnh nên số lượng giảm nhanh Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh (2007) sử dụng chồi đỉnh lấy từ cây 1 - 1,5 tuổi nuôi cấy trên môi trường WPM, 1/2 WPM, 1/2 MS bổ sung BAP, IAA, NAA, IBA, kinetin, Rib và nước dừa Kết quả cho thấy, môi trường WPM là khoáng cơ bản thích hợp nhất cho nuôi cấy chồi đỉnh; tỉ lệ phát sinh chồi cao nhất ở môi trường WPM bổ sung kết hợp BAP 0,1mg/l + IBA 0,3mg/l Khi bổ sung một số chất hữu cơ như: ngô, dịch chiết nấm men, glutamine vào môi trường nuôi cấy đã nhận thấy rằng môi trường có nghiệm thức WPM + BAP 0,1mg/l + dịch chiết nấm men 1g/l có khả năng nhân chồi cao nhất Nghiên cứu khả năng vươn thân và ra rễ đã nhận thấy cây pơmu vươn thân tốt nhất trong môi trường WPM + IBA 0,3mg/l + dịch chiết nấm men 1g/l, rễ nhiều và dài nhất trên môi trường WPM + IBA 5mg/l sau 45 ngày nuôi cấy [2]

Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là loài cây quý hiếm được dùng

trong dược liệu Hiện nay, thông đỏ đang đứng trước nguy cơ bị cạn kiệt Phục hồi lại rừng thông đỏ theo phương pháp truyền thống chủ yếu là giâm

cành và cây con bầu đất Tuy nhiên, cây thông đỏ sinh trưởng chậm nên hiệu quả các phương pháp này chưa cao để phục vụ khai thác và sử dụng cho công nghiệp trong thời gian dài Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn và phát triển cây thông đỏ, tác giả Trần Văn Định, Trần Văn Minh (2007) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy Chồi non sau khi được vô trùng bằng hypochlorite natrium được nuôi cấy trên môi trường MS, WPM, B5, WV3 có bổ sung BAP Nghiên cứu ảnh hưởng của chất chống hoá nâu, ảnh hưởng của sinh lý mẫu nuôi cấy, tuổi mẫu

đến sự phát sinh chồi in vitro, đến tỉ lệ ngã nghiêng chồi thông in vitro, ảnh

hưởng của điều kiện nuôi cấy thông khí và cường độ chiếu sáng đến sinh

trưởng chồi thông đỏ in vitro cho thấy: AgNO3 có hiệu quả trong việc hạn chế sự tiết nhựa đỏ vào môi trường nuôi cấy làm tăng sự phát sinh chồi; chồi thông đỏ phát sinh cao nhất từ ngọn chính, tuổi mẫu 18 tháng Môi trường bổ sung BAP 5mg/l + kinetin 1mg/l + AgNO3 150mg/l thích hợp cho nuôi cấy phát sinh chồi Điều kiện chiếu sáng thích hợp là 11,4 - 22,8 µmol/m2

/s và đậy bằng nắp giấy Cây thông đỏ ra rễ tốt nhất sau 75 ngày nuôi cấy trên môi trường WPM có bổ sung NAA 1mg/l kết hợp Rhizopon 50mg/l [10]

Được xếp vào loại gỗ quý hiếm thuộc nhóm 1, nhưng hiện nay, trai Nam Bộ là loại cây đang bị đe doạ rất nguy cấp và có nguy cơ tuyệt chủng tự nhiên cao Vi nhân giống cây trai Nam Bộ được tác giả Khưu Hoàng Minh, Trần Văn Minh (2007) nghiên cứu nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý đang bị tuyệt diệt và tạo giống cây sạch bệnh phục vụ công tác tái sinh rừng Mẫu trai thực sinh được vô trùng tốt nhất khi sử dụng kết hợp hypochlorit - Ca 25% trong 20 - 32 phút với HgCl2 0,05% trong 15 phút Môi trường khoáng cơ bản thích hợp với cây trai Nam Bộ là WPM Khả năng tạo cụm chồi tốt nhất ở môi trường bổ sung BAP 1mg/l và môi trường bổ sung BAP 0,5mg/l là thích hợp nhất với nhân cụm chồi; khả năng vươn thân tốt nhất ở

môi trường có bổ sung nước dừa 10%; cây ra rễ tốt nhất trên môi trường có bổ sung IBA 0,3mg/l [23].

Trần văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), nhân nhanh loài gỗ quý giá

ty (Tectona Grandis Linn.F.) với nguyên liệu ban đầu là chồi đỉnh cây giá ty

nhập nội, môi trường nuôi cấy chồi đỉnh là MS và WPM, chồi non được sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm sau Các tác giả cũng đã xây dựng

thành công quy trình nhân giống in vitro và đưa cây con ra ngoài môi trường

tự nhiên [25]

Nhằm phục vụ công tác chuyển gen, nhóm tác giả Bùi Văn Thắng, Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Việt, Hồ Văn Giảng (2007) đã xây dựng hoàn chỉnh

hệ thống tái sinh cây xoan ta (Melia azedarach L.) Hệ thống tái sinh cây

xoan ta đạt hiệu suất cao thông qua cảm ứng cụm chồi từ mảnh lá mầm với tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi đạt 98% và 7,3 chồi/mảnh cấy khi nuôi trên môi trường MS có bổ sung vitamin B5 + BAP 6,65µM+ kinetin 0,46µM + surcrose3% Kéo dài chồi dạt 97% với chiều cao trung bình là 28,7mm khi cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung vitamin B5 + IBA 0,88µM + surcrose 2% nuôi trong 4 ngày Sau đó, cây xoan ta được cấy sang môi trường MS + surcrose 1% không có chất điều hoà sinh trưởng Cây mô chuyển từ

điều kiện in vitro ra trồng trong nhà lưới, sinh trưởng, phát triển bình thường

[32]

Trên một số cây giống cây trồng rừng có năng suất và chất lượng cao

khác chúng ta cũng đã xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro

[19]

Việt Nam có hàng ngàn cây thuốc quý hiếm được ghi tên trong danh lục đỏ Nhiều cây thuốc quý có nguy cơ bị tuyệt chủng do bị khai thác mạnh phục vụ cho việc sản xuất trên quy mô công nghiệp Để bảo tồn nguồn gen những cây thuốc quý này, quy trình nhân giống cây dược liệu được nhiều tác

giả nghiên cứu hoàn thiện như: nhân giống vô tính các dòng Kava (Piper

methysticum G Forster) có hoạt tính sinh học cao (Đinh Đoàn Long và cs

(2004)) [18] Nguyễn Trung Thành, Lê Văn Cần, Pack Kee Youep đã nuôi

cấy rễ bất định của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamnenis Ha et Grush v.) trên

môi trường MS cơ bản Kết quả mô sẹo hình thành sau 4 tuần nuôi cấy với nồng độ tối ưu là 2,4-D 1mg/l Nuôi cấy mô sẹo trên môi trường có bổ sung IBA và NAA thấy rằng số rễ con hình thành trên môi trường bổ sung IBA lớn hơn rất nhiều trên môi trường bổ sung NAA (tỉ lệ tạo rễ ở môi trường bổ sung IBA là 89% còn trên môi trường bổ sung NAA là 76%) Nồng độ đường tối ưu cho sự sinh trưởng rễ bất định sâm Ngọc Linh là 50g/l với trọng lượng khô

đạt 1,75g [31] Với công trình dòng hoá cây thanh hao (Artemisia annua L.)

in vitro tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh (2007) đã nhân giống

trên môi trường LV và nhận thấy, môi trường có bổ sung BAP 0,3mg/l chồi phát triển về cả chiều cao và số lượng Khi bổ sung BAP, NAA và 2,4-D riêng rẽ không kích thích phát sinh phôi soma nhưng khi bổ sung NAA và 2,4-D riêng rẽ lại kích thích tạo rễ Bổ sung kết hợp BAP 0,5mg/l và NAA 0,5mg/l cho tế bào soma phát sinh đồng đều; cả BAP, NAA và 2,4-D đều có tác dụng kích thích tăng tế bào soma và môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng sinh tế bào soma là môi trường LV có bổ sung BAP 0,5mg/l + NAA 0,5mg/l Qua nghiên cứu cũng thấy rằng, cần thiết nuôi cấy tế bào soma trong điều kiện có chiếu sáng trên môi trường bán rắn và lỏng [38]

Có thế mạnh là nằm trong khu vực thuận lợi cho nhiều loại hoa phát triển đặc biệt là các loại hoa vùng nhiệt đới, việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống các loại hoa nhằm sản xuất trên quy mô công nghiệp và phục vụ xuất khẩu được nhiều tác giả quan tâm Trong lĩnh vực này, chúng ta đã thu được một số thành tựu đáng kể như: Nghiên cứu phương thức nhân nhanh một số giống hoa cúc chùm Hà Lan (Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang

Thạch, Từ Thị Hoài Thu (1999)) [1]; tái sinh in vitro cây cúc (Dandrenthema

morifolium L.) và bước đầu chuyển gen ipt làm chậm sự lão hoá (Nguyễn

Hữu Hổ, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh (2007)) [15]…

1.4 Ứng dụng của kĩ thuật RAPD trong đánh giá mối quan hệ di truyền của một số loài thực vật

RAPD (Random Amplyfied Polymorphysm DNA) là kỹ thuật mới được

ứng dụng trong những năm gần đây ở Việt Nam RAPD có nhiều ưu điểm nổi bật như: có khả năng phát hiện hiện tượng đa hình DNA trên một phạm vi rộng, thao tác đơn giản, nhanh gọn, ít tốn kém, không cần biết trước trình tự gen của đối tượng cần nghiên cứu, chất lượng DNA không cần độ tinh sạch cao… [40] Nhiều nghiên cứu cho thấy, RAPD là kỹ thuật đem lại hiệu quả cao trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và sự đa dạng di truyền, nghiên cứu nguồn gốc loài và lập bản đồ di truyền của thực vật Vì vậy, kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với nhiều kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy

Việt Nam là một nước nông nghiệp với sản lượng xuất khẩu lương thực, thực phẩm cao trên thế giới nên cây lương thực, thực phẩm được nhiều tác giả quan tâm nghên cứu Với mục đích nghiên cứu mối quan hệ di truyền

của một số giống lạc trồng (Archis hypogaea L.), Chu Hoàng Mậu và Nguyễn

Thị Hoa Lan (2003) đã phân tích đa dạng di truyền giữa 12 giống lạc là L02, L03, L05, L08, L12, L15, L16, LVT, Sen Nghệ An, Đỏ Bắc Giang, Phú Thọ Phân tích hệ gen 12 giống lạc với 5 mồi phản ứng ngẫu nhiên nhận được 32 phân đoạn DNA, trong đó có 15 phân đoạn đa hình chiếm 46,9%, 4 mồi cho kết quả đa hình là RA31, RA36 , RA46 và RA142 Kết quả phân tích RAPD đã cho thấy DNA của 12 giống lạc có cấu trúc khác nhau giữa các giống lạc có sự sai khác di truyền với hệ số từ 0,03 - 0,13 [21]

Lúa là cây lương thực chủ yếu ở Việt Nam Trong những năm gần đây, sản lượng lúa xuất khẩu của Việt Nam luôn đứng thứ 2 trên thế giới Nhằm chọn, tạo ra những giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt đáp ứng thị hiếu khách hàng, hàng loạt các nghiên cứu về cây lúa đã được các tác giả tiến hành Nguyễn Đức Thành, Phạm Duy Toản, Nguyễn Hoàng Anh (2000) đã ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD và STS trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn giống ở lúa [30] Lúa cạn là cây lương thực giữ vị trí quan trọng trong đời sống người dân miền núi, góp phần cung cấp lương thực tại chỗ cho những vùng khó khăn Cây lúa cạn có chất lượng gạo tốt, thơm, dẻo, khả năng kháng được sâu bệnh cao, có thể gieo trồng được ở những nơi không chủ động được nước tưới Với mục đích nghiên cứu sự đa dạng về kiểu gen và kiểu hình chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương miền núi, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Vân Anh (2007) đã nghiên cứu trên 12 giống lúa cạn ở 3 tỉnh Sơn La, Bắc Kạn, Cao Bằng và đã chia các giống lúa thành 4 nhóm với khoảng cách di truyền giữa các giống lúa cạn là 7,69 - 34% và hệ số đa dạng di truyền của hệ gen lúa cạn Hg = 52,37% [22] Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn, Lò Thị Mai Thu, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Bình (2008) tiếp tục đánh giá mối quan hệ di truyền ở mức độ phân tử DNA bằng kỹ thuật RAPD, xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa cạn, tạo cơ sở cho việc tuyển chọn giống lúa cạn chịu hạn làm vật liệu chọn giống, góp phần vào bảo tồn và phát triển nguồn gen cây lúa cạn miền núi Kết quả đã nhân bản được 182 phân đoạn DNA từ hệ gen của 7 giống lúa cạn Năm mồi sử dụng cho nghiên cứu đều thể hiện tính đa hình, tính đa hình cao được thể hiện ở các mồi M4, M7, M13 (trong đó mồi M13 có 100% phân đoạn đa hình) Trên cơ sở đó, các tác giả đã chia các giống lúa cạn nghiên cứu thành 2 nhóm chính: nhóm thứ nhất gồm 3 giống (LC, CB2, SL1)

và nhóm thứ 2 gồm 4 giống (CB1, HG, SL2, LCh) với hệ số khác nhau là 26% Hai giống HG và SL1 có khả năng chịu hạn tốt nhất, đồng thời cũng có hệ số tương đồng di truyền cao nhất (97%) được xếp vào cùng một nhóm [34]

Cây ăn quả cũng là một trong những thế mạnh của nông nghiệp Việt Nam Tuy nhiên, chất lượng các giống cây khác nhau cũng như chất lượng của cùng một loại cây ở các vùng sinh thái khác nhau lại có sự khác biệt Vì vậy, nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các giống cây trong cùng vùng sinh thái và giữa các giống cây khác nhau trong cùng một loài nhằm tìm ra loại cây và điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của chúng là vấn đề quan trọng Trong lĩnh vực này, chúng ta đã đạt được một số kết quả như: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các giống nhãn trồng ở Việt Nam của tác giả Nguyễn Văn Thiết, Lê Thị Lan Oanh (2001) [33]; sử dụng kĩ thuật RAPD và AFLP để nghiên cứu quan hệ di truyền của 2 giống vải thiều và vải chua của Nguyễn Thị Dung và cs (2005) [9], sử dụng dấu chuẩn RAPD để nhận dạng 1 số giống chuối trồng ở Việt Nam (Nguyễn Xuân Thụ, Lê Thị Lan Oanh, Nguyễn Thị Dung (1998)) [34], đánh giá đa dạng nguồn gen xoài Việt Nam

(Mangifera) bằng kĩ thuật RAPD (Nguyễn Ngọc Huệ, Trần Danh Sửu, Trịnh

Hồng Kiên (2005)) [16]

Ứng dụng chỉ thị phân tử (RAPD và DNA lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xây dựng vườn giống cây cóc hành, Nguyễn Việt Cường, Phạm Đức Tuấn (2007) đã tiến hành nghiên cứu 40 dòng cây trội cóc hành

(Azadirachta excalsa) được tuyển chọn trong rừng khộp tự nhiên khô hạn ở 6

xã của 2 huyện Ninh Sơn và Bắc Ái thuộc tỉnh Ninh Thuận Mồi sử dụng cho nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên gồm OPC10, OPC18, OPC14, OPC20, OPB17, OPC13 và 2 mồi lục lạp gồm rnH - trnK và atpB - rbcL Kết quả, các dòng cóc hành được nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền thấp mặc dù các

cây trội được chọn lọc đều ở rừng tự nhiên và có khoảng cách về không gian khá xa Có 6 cặp cóc hành có hệ số tương đồng gần bằng 1 từ 0,978 đến 0,981 là cặp X32 và X35, X8 và X11, X34 và X50, X13 và X22, X19 và X37 Các dòng cóc hành có quan hệ di truyền gần gũi cần loại khi xây dựng vườn giống là X11, X22, X35, X37, X43, X43, X50 Đây là kết quả nghiên cứu bước đầu về đa dạng di truyền (mới sử dụng 6 mồi RAPD và 2 mồi lục lạp) [7]

Dẻ là cây trồng rừng chủ yếu ở một số tỉnh miền núi phía bắc như Cao Bằng, Bắc Giang, Lào Cai, Sơn La… Hiện đã có một số công trình nghiên cứu về cây dẻ trên các phương diện khác nhau như: nghiên cứu thực trạng và giải pháp chủ yếu nhằm phát triển sản xuất hạt dẻ ở tỉnh Cao Bằng của Ngô

Xuân Hoàng (2008) [14], nghiên cứu cơ sở phân loại họ dẻ - Fagaceae

Durmort ở Việt Nam của Nguyễn Tiến Bân [4] Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện

nay chưa có công trình nào nghiên cứu về việc nhân giống in vitro cây dẻ

Trùng Khánh - Cao Bằng và mối quan hệ di truyền giữa các giống dẻ bằng kỹ thuật sinh học phân tử

2.1.2.1 Hoá chất và thiết bị nuôi cấy mô

Các dụng cụ và hoá chất cần thiết để thực hiện quá trình nuôi cấy do phòng Công nghệ tế bào, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Thái

Nguyên cung cấp

* Dụng cụ

Buồng cấy vô trùng (Bioiogicalsafety Cabinets)

Nồi hấp khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy - Nhật Bản Cân điện tử của Đức

Máy đo pH

Tủ sấy

Bình tam giác có kích thước từ 250ml - 500ml, pipet loại 1ml, dụng cụ nuôi cấy

* Hoá chất

Hoá chất pha môi trường WPM gồm các nguyên tố đa lượng, vi lượng,

kích thích sinh trưởng, đường sucrose, thạch agar, nước dừa.v.v

Thành phần hoá chất của môi trường WPM dành cho cây thân gỗ được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản môi trường WPM (Lioyd và Mc Cown, 1980)

STT Thành phần Nồng độ (mg/l)

STT Thành phần Nồng độ (mg/l)

1 KH2PO4 170 12 CuSO4.5H2O 0,25 2 K2SO4 990 13 Na2MoO4.2H2O 0,25

* Phương pháp pha chất kích thích sinh trưởng

Chất kích thích sinh trưởng thường pha với một lượng ít vì các chất này khi ở dạng dung dịch khó bảo quản Trong quá trình nuôi cấy, chúng tôi đã sử

dụng các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin (Kinetin và BAP) và chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (α - NAA) Các chất kích thích sinh trưởng này được pha với nồng độ như sau:

1 BAP (6 - Benzynaminopurne) C12H11N5

Sử dụng dung dịch NaOH 1N một lượng vừa đủ để làm tan BAP Sau đó pha tới nồng độ 0,5mg/ml với nước cất Sau khi pha, hoá chất được bảo quản ở nhiệt độ 0o

C - 5oC

2 Kinetin (6 - Furfurylaminopurine) C10H9N2O

Sử dụng dung dịch NaOH 1N một lượng vừa đủ để làm tan kinetin Sau đó pha tới nồng độ 0,2mg/ml với nước cất Sau khi pha, hoá chất được bảo quản ở nhiệt độ 0o

C - 5oC

3 α - NAA (α - naphtyl axetic acid) C11H10O2

Làm tan NAA trong cồn tuyệt đối cùng với NaOH 1M Sau đó pha tới nồng độ 0,5mg/ml với nước cất Sau khi pha, hoá chất được bảo quản ở nhiệt độ 0o

Bảng 2.2 Trình tự các nucleotid của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi DTN1 5’AACCGACGGG 3’ TN03 5’GGGAAGGACA 3’ DTN2 5’GAAACACCCC 3’ TN07 5’CCAGACCCTG 3’ OPM5 5’GCCACGGAGA 3’ DTN5 5’CGCTGTGCAG 3’ APR08 5’CTGCTGGGAC 3’ OPQ02 5’CCGCGTCTTG 3’

OCN6 5’GGGGGTCGTT 3’ DHN04 5’GGAAGCCAAC 3’

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu nuôi cấy mô - tế bào 2.2.1.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy

- Nguyên tắc: Pha môi trường đặc với thành phần và nồng độ các chất phù hợp Môi trường là WPM có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin, tất cả các hoá chất tan đều, không kết tủa Môi trường có bổ sung chất độn là agar để làm giá đỡ, yêu cầu không quá lỏng cũng không quá rắn để cấy mẫu được dễ dàng Ngoài ra, chúng tôi còn bổ sung nước dừa vào môi trường để tăng nguồn cung cấp dinh dưỡng cho cây Khử trùng môi trường theo phương pháp khử trùng Pasteur Dụng cụ pha môi trường được rửa sạch, sấy khô

- Các bước tiến hành: Sau khi xác định được công thức cần pha, tính thể tích các hoá chất trong môi trường nuôi cấy

Ví dụ, môi trường nhân chồi dẻ có công thức WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + BAP 0,5mg/l + nước dừa 200ml/l, có thể tiến hành theo các bước sau:

(1) Đong khoảng 650 ml nước cất đặt lên bếp điện đun sôi

(2) Dùng pipet hoặc ống đong lấy các dung dịch WPM với nồng độ WPM1: 20ml/l; WPM2: 20ml/l; WPM3: 5ml/l; WPM4: 5ml/l; WPM5: 5ml/l Cho tất cả vào 1 cốc thuỷ tinh sạch

(3) Bổ sung 1ml BAP vào cốc dung dịch trên (4) Cân 20g đường sucrose và 8,5g thạch agar

(5) Khi nước sôi, cho đường vào khuấy tan rồi đổ agar vào khuấy đều và đun sôi cho tan hết

(6) Bổ sung hoá chất đã chuẩn bị ở cốc thuỷ tinh

(7) Định lượng dung dịch trên bằng nước cất đến 1000 ml Điều chỉnh pH bằng máy chuẩn pH sao cho pH đạt 5,7 - 5,8

(8) Chia đều vào các bình tam giác mỗi bình khoảng 75ml Sau đó nút bông và đóng bằng nắp giấy đậy kín

(9) Khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 120 - 121oC, thời gian 20 phút, áp suất 1 - 1,2atm Sau khi khử trùng, để môi trường ổn định sau 1 - 2 ngày có thể sử dụng

2.2.1.2 Phương pháp khử trùng mẫu hạt dẻ và đưa vào môi trường nuôi cấy

* Mục đích:

Thu được vật liệu sạch phục vụ cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo

* Các bước tiến hành:

Mẫu hạt nuôi cấy được làm sạch bằng cách:

+ Khử trùng hạt ngoài buồng nuôi cấy: Hạt đã được bóc hết 2 lớp vỏ cứng và vỏ gai được cắt bỏ bớt phần thịt hạt không chứa mầm Rửa sạch bằng nước cất, sau đó rửa sạch bằng xà phòng và tráng lại bằng nước cất

+ Khử trùng hạt trong buồng cây: Hạt được đưa vào môi trường nuôi cấy vô trùng, tiếp tục được khử trùng bằng javen và cồn với thời gian khác nhau Chúng tôi sử dụng cồn 70o trong thời gian 2 phút, 5 phút, 7 phút, 10

phút và javen 65% trong 20 phút và 25 phút Sau đó, tráng lại hạt 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng Thấm khô hạt bằng giấy thấm đã khử trùng

Mẫu hạt đã làm sạch được cấy vào các bình tam giác trong buồng cấy đã được khử trùng bằng tia cực tím

Công thức môi trường cấy gây được sử dụng là: WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l Theo dõi tỉ lệ hạt nảy mầm tỉ lệ hạt nhiễm và chết sau 4 tuần Những hạt nảy mầm được chăm sóc và theo dõi đến khi mầm dài 5cm - 7cm có thể chuyển sang môi trường nhân chồi

2.2.1.3 Phương pháp nhân chồi Mục đích:

Thăm dò và xác định ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng có

trong môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh chồi

Cách tiến hành:

Các chồi có kích thước từ 5cm - 7cm thu được trên môi trường cấy gây được chuyển sang môi trường nuôi cấy đối chứng (không bổ sung chất kích thích sinh trưởng, chỉ có WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200 ml/l) và môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l + kích thích sinh trưởng)

Các chất kích thích sinh trưởng được bổ sung vào môi trường với nồng độ như sau: BAP (0,2mg/l; 0,5mg/l; 1mg/l; 1,2mg/l; 1,5mg/l), tổ hợp BAP (0,2mg/l; 0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l) + kinetin (0,5mg/l; 1mg/l; 1,2mg/l; 1,3mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l), tổ hợp BAP (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l) + NAA (0,05mg/l; 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,4mg/l)

Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về các chỉ tiêu: tỉ lệ mô tạo chồi, số chồi/mô, chiều cao và màu sắc chồi Kết quả được phân tích trên phần mềm exel và đánh giá dựa trên số liệu thu được

2.2.1.4 Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi có kích thước từ 5cm - 7cm được cắt thành các đoạn khoảng 2cm - 3cm và chuyển sang môi trường tạo rễ Thành phần môi trường gồm có: WPM + đường sucrose 25g/l+ agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l+ α - NAA (0,05mg/l; 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,4mg/l) Theo dõi, thu thập số liệu và phân tích kết quả về các chỉ tiêu: tỉ lệ cây tạo rễ, số rễ/cây và kích thước rễ trong 8 tuần.

2.1.1.5 Phương pháp đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên

Đây là khâu cuối cùng của quy trình nhân giống bằng phương pháp in

-vitro nhằm tìm giá thể tốt nhất cho cây dẻ để đưa chúng ra môi trường tự

nhiên

Chúng tôi đã thử nghiệm trồng cây dẻ con trên 3 loại giá thể là đất, trấu hun, và hỗn hợp đất + trấu hun Theo dõi và chăm sóc trong 8 tuần, thu thập số liệu và phân tích đánh giá kết quả

2.1.1.6 Phương pháp tính toán kết quả

Sau khi tiến hành nuôi cấy và theo dõi kết quả, số liệu thu thập được được phân tích trên phần mềm exel của Chu Văn Mẫn [20] các giá trị thống kê về giá trị trung bình (X ), sai số trung bình mẫu (mx)

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kĩ thuật RAPD

2.2.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA

Nguyên tắc: Tách được DNA ra khỏi các sản phẩm của tế bào và chiết

xuất DNA đảm bảo giữ nguyên cấu trúc và độ tinh sạch

Tiến hành:

Lá của 5 mẫu dẻ được thu thập, bảo quản lạnh ở - 85oC, tách chiết và tinh sạch DNA theo phương pháp của Doyle J.J có cải tiến [40], gồm các bước sau:

-Cân 200mg mẫu lá non cho vào ống eppendorf 2 ml.

- Cho nitơ lỏng vào ống eppendorf có chứa mẫu lá Nghiền bằng đũa thủy tinh có đầu nhọn vừa với ống eppendorf thành dạng bột mịn

- Bổ sung 800µl đệm tách DNA, đảo nhẹ để tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ trong 60 phút ở 650

C

- Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

- Bổ sung 800µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl (24:1), đảo đều

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút để phân tách thành 2 pha, hút cẩn thận dịch nổi cho vào ống eppendorf mới

- Tủa dịch nổi bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1), đảo nhẹ

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút loại bỏ dịch nổi (hoặc vớt kết tủa DNA)

- Rửa DNA hai lần bằng ethanol 80%

- Làm khô DNA bằng máy Speed - Vac hay ở nhiệt độ phòng - Hoà tan DNA trong 300µl TE 1X

- Bổ sung 1µl RNase (10mg/ml), ủ ở 370C trong 30 phút - Thêm 10µl Sodium acetate 3M đảo nhẹ

- Bổ sung 2,5 thể tích ethanol tuyệt đối, đảo nhẹ để ở - 200C ít nhất 1 giờ - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi

- Rửa DNA hai lần bằng ethanol 80%

- Hoà tan DNA trong 300µl TE 1X, giữ ở -200C đến khi sử dụng

DNA sau khi tách chiết được kiểm tra trên gel agarose 0,8%, xác định hàm lượng trên máy đo quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10 ng/μl

2.2.2.2 Phản ứng PCR - RAPD

Mỗi ống phản ứng PCR có 25μl dung dịch chứa 1X đệm PCR; 2,5mM MgCl2; 100μl 4 dNTPs; 200nM đoạn mồi; 0,125 đơn vị Taq polymerase và

10ng DNA khuôn

Phản ứng PCR - RAPD thực hiện trong máy PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu trình nhiệt: Bước 1: 94oC trong 3 phút; Bước 2: 92o

C trong 1 phút; Bước 3: 35oC trong 1 phút; Bước 3: 72oC trong 1 phút, từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 45 chu kì; Bước 5: 72oC trong 10 phút; Bước 6: giữ ở 4o

C Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel

2.2.2.3 Phân tích số liệu

Phân tích số liệu theo quy ước: 1 = phân đoạn đa hình xuất hiện và 0 = phân đoạn đa hình không xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên

Xác định hệ số di truyền giống nhau theo phương pháp của Nei Và Li(1979) - hệ số Jacar [41]

Trong đó: Sij: Hệ số giống nhau giữa 2 cá thể

a: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở cả 2 cá thể i và j

b: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở i và không xuất hiện ở j c: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở j và không xuất hiện ở i

Phân tích đánh giá hệ số tương quan kiểu hình theo 3 phương pháp: SM, Dice and Jaccard và 4 phương pháp phân nhóm UPGMA (phân tích các nhóm phân tử không cùng trọng lượng), WPGMA (phân tích các nhóm phân tử có cùng trọng lượng), liên kết hoàn toàn (complete linkage), liên kết đơn lẻ (single linkage) Lập biểu đồ hình cây dựa vào giá trị phân tích của giá trị tương quan kiểu hình cao nhất trong chương trình NTSYS 2.1 Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content = PIC) của mỗi cặp mồi xác định theo công thức:

PICi = 1 - ∑P1

Trong đó: Pi là tần số của alen i của kiểu gen được kiểm tra

Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đa hình) tới 1 (đa hình hoàn toàn)