MỤC LỤC
Chồi đỉnh phân tán (không kết cụm), hình trứng hay hình bầu dục; các vảy xếp lợp hoặc đôi khi có xu hướng xếp thành 2 dãy. Lá không có điểm tuyến, xếp xoắn đều đặn và không kết chụm lại ở đỉnh cành;. Cụm hoa gồm những xim lưỡng phân dày đặc hoặc gồm 1 hoa duy nhất, đơn tính (chỉ mang 1 thứ hoa), ít khi lưỡng tính (hoa cái ở phần dưới, hoa đực ở phần ngọn) hay hỗn hợp, dạng bông (gié, đuôi sóc) ở trên 1 trục dài, gồm các xim rất ngắn.
Đấu có cuống ngắn hoặc không có cuống, có gai hay gai nhỏ hoặc đôi khi có vảy, hay có khi đấu gần như nhẵn, hoàn toàn bao kín 1 - 3 (7) hạch, khi chín nẻ van hoặc thường tách không đều thành nhiều mảnh.
Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu…. Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo ra lượng lớn cây giống có chất lượng tốt. Nghiên cứu khả năng vươn thân và ra rễ đã nhận thấy cây pơmu vươn thân tốt nhất trong môi trường WPM + IBA 0,3mg/l + dịch chiết nấm men 1g/l, rễ nhiều và dài nhất trên môi trường WPM + IBA 5mg/l sau 45 ngày nuôi cấy [2].
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất chống hoá nâu, ảnh hưởng của sinh lý mẫu nuôi cấy, tuổi mẫu đến sự phát sinh chồi in vitro, đến tỉ lệ ngã nghiêng chồi thông in vitro, ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thông khí và cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng chồi thông đỏ in vitro cho thấy: AgNO3 có hiệu quả trong việc hạn chế sự tiết nhựa đỏ vào môi trường nuôi cấy làm tăng sự phát sinh chồi; chồi thông đỏ phát sinh cao nhất từ ngọn chính, tuổi mẫu 18 tháng. Trần văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), nhân nhanh loài gỗ quý giá ty (Tectona Grandis Linn.F.) với nguyên liệu ban đầu là chồi đỉnh cây giá ty nhập nội, môi trường nuôi cấy chồi đỉnh là MS và WPM, chồi non được sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm sau. Nuôi cấy mô sẹo trên môi trường có bổ sung IBA và NAA thấy rằng số rễ con hình thành trên môi trường bổ sung IBA lớn hơn rất nhiều trên môi trường bổ sung NAA (tỉ lệ tạo rễ ở môi trường bổ sung IBA là 89% còn trên môi trường bổ sung NAA là 76%).
Với công trình dòng hoá cây thanh hao (Artemisia annua L.) in vitro tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh (2007) đã nhân giống trên môi trường LV và nhận thấy, môi trường có bổ sung BAP 0,3mg/l chồi phát triển về cả chiều cao và số lượng. Có thế mạnh là nằm trong khu vực thuận lợi cho nhiều loại hoa phát triển đặc biệt là các loại hoa vùng nhiệt đới, việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống các loại hoa nhằm sản xuất trên quy mô công nghiệp và phục vụ xuất khẩu được nhiều tác giả quan tâm.
Các mẫu lá dẻ được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử thu được từ 5 mẫu hạt dẻ. Các dụng cụ và hoá chất cần thiết để thực hiện quá trình nuôi cấy do phòng Công nghệ tế bào, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp. Nồi hấp khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy - Nhật Bản Cân điện tử của Đức.
Hoá chất pha môi trường WPM gồm các nguyên tố đa lượng, vi lượng, kích thích sinh trưởng, đường sucrose, thạch agar, nước dừa.v.v. Thành phần hoá chất của môi trường WPM dành cho cây thân gỗ được trình bày trong bảng 2.1. Chất kích thích sinh trưởng thường pha với một lượng ít vì các chất này khi ở dạng dung dịch khó bảo quản.
Các mồi sử dụng trong phản ứng RAPD bao gồm 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng cho phân tích RAPD genome của dẻ gai Bắc Giang, dẻ có nguồn gốc từ Vân Nam - Trung Quốc và 3 mẫu dẻ thu tại Trùng Khánh - Cao Bằng.
Sau khi khử trùng, để môi trường ổn định sau 1 - 2 ngày có thể sử dụng. + Khử trùng hạt ngoài buồng nuôi cấy: Hạt đã được bóc hết 2 lớp vỏ cứng và vỏ gai được cắt bỏ bớt phần thịt hạt không chứa mầm. Rửa sạch bằng nước cất, sau đó rửa sạch bằng xà phòng và tráng lại bằng nước cất.
+ Khử trùng hạt trong buồng cây: Hạt được đưa vào môi trường nuôi cấy vô trùng, tiếp tục được khử trùng bằng javen và cồn với thời gian khác nhau. Mẫu hạt đã làm sạch được cấy vào các bình tam giác trong buồng cấy đã được khử trùng bằng tia cực tím. Những hạt nảy mầm được chăm súc và theo dừi đến khi mầm dài 5cm - 7cm có thể chuyển sang môi trường nhân chồi.
Thăm dò và xác định ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh chồi. Quan sỏt, theo dừi và thu thập số liệu về cỏc chỉ tiờu: tỉ lệ mụ tạo chồi, số chồi/mô, chiều cao và màu sắc chồi. Kết quả được phân tích trên phần mềm exel và đánh giá dựa trên số liệu thu được.
Các chồi có kích thước từ 5cm - 7cm được cắt thành các đoạn khoảng 2cm - 3cm và chuyển sang môi trường tạo rễ. Theo dừi, thu thập số liệu và phân tích kết quả về các chỉ tiêu: tỉ lệ cây tạo rễ, số rễ/cây và kích thước rễ trong 8 tuần. Đây là khâu cuối cùng của quy trình nhân giống bằng phương pháp in - vitro nhằm tìm giá thể tốt nhất cho cây dẻ để đưa chúng ra môi trường tự nhiên.
Chúng tôi đã thử nghiệm trồng cây dẻ con trên 3 loại giá thể là đất, trấu hun, và hỗn hợp đất + trấu hun. Theo dừi và chăm súc trong 8 tuần, thu thập số liệu và phân tích đánh giá kết quả. Sau khi tiến hành nuụi cấy và theo dừi kết quả, số liệu thu thập được được phân tích trên phần mềm exel của Chu Văn Mẫn [20] các giá trị thống kê về giá trị trung bình (X ), sai số trung bình mẫu (mx).
Nghiền bằng đũa thủy tinh có đầu nhọn vừa với ống eppendorf thành dạng bột mịn. DNA sau khi tách chiết được kiểm tra trên gel agarose 0,8%, xác định hàm lượng trên máy đo quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10 ng/μl. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.
Phân tích số liệu theo quy ước: 1 = phân đoạn đa hình xuất hiện và 0 = phân đoạn đa hình không xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên. SM, Dice and Jaccard và 4 phương pháp phân nhóm UPGMA (phân tích các nhóm phân tử không cùng trọng lượng), WPGMA (phân tích các nhóm phân tử có cùng trọng lượng), liên kết hoàn toàn (complete linkage), liên kết đơn lẻ (single linkage). Lập biểu đồ hình cây dựa vào giá trị phân tích của giá trị tương quan kiểu hình cao nhất trong chương trình NTSYS 2.1.
Kết quả đánh giá mối quan hệ di truyền giữa một số mẫu dẻ bằng kĩ.
Như vậy, chất lượng DNA đảm bảo tiêu chuẩn để tiến hành các phản ứng PCR - RAPD.
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn khi so sánh giữa các mẫu dẻ khác nhau trong cùng 1 mồi. Như vậy, tổng số phân đoạn DNA của 5 mẫu lá dẻ khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên là 46 phân đoạn. Trong số 10 mồi nghiên cứu, có tới 5 mồi không cho tính đa hình các phân đoạn DNA.
Giá trị PIC được sử dụng khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3. Tuy nhiên, giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỉ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn cho biết số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ (bảng 3.3). Như vậy, với 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu đã đưa ra được sự khác nhau về độ tương đồng các phân đoạn DNA của 5 mẫu dẻ phân bố ở các khu vực địa lý khác nhau là Trùng Khánh - Cao Bằng, Yên Thế - Bắc Giang và Vân Nam - Trung Quốc.
Các phân đoạn DNA được nhân bản của các mẫu dẻ có kích thước hoàn toàn giống nhau (hình 3.2A). Như vậy, sử dụng mồi TN03 không phát hiện được sự sai khác về các phân đoạn DNA đa hình được nhân bản.