điều tra và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen các giống hoa cúc và hoa lan cắt cành hiện đang sản xuất tại đà lạt

điều tra và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen các giống hoa cúc và hoa lan cắt cành hiện đang sản xuất tại đà lạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại học Đà Lạt

-o0o -

ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH

HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT

ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM MÃ SỐ: B2005-29-41-TĐ

Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục và Đào tạo Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại học Đà Lạt

NHĨM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Cán bộ tham gia thực hiện đề tài:

1 TS Nguyễn Văn Kết 2 Th.S Cao Thị Làn

3 Th.S Nguyễn Thành Sum 4 NCV Đỗ Phương Mai 5 NCV Trương Thị Lan Anh

Các đề tài sinh viên đã báo cáo

1 Khảo sát hiệu quả ức chế virus của ribazole trên năm giống cúc nuơi cấy in vitro Đinh Thị Hạnh Sinh viên Nơng học khĩa 27

2 Tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của cúc (Farm trắng, Farm tím, Nữ hoàng tím, Thọ đỏ, Thọ vàng chanh) in vitro Nguyễn Thị Thắm Sinh viên Tại chức Sinh học khĩa 13

3 Tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của cúc (Chrysanthemum sp.) in vitro

Phạm Thị Hằng Hương Sinh viên Sinh học khĩa 27

4 Phục tráng giống hoa cúc (Farm hồng, Pingpong vàng, Nút vàng, Nút tìm, Tia muỗng vàng) bằng ribazole Cao Viết Tuấn Sinh viên Nơng Học Khĩa 27

5 Khảo sát ảnh hưởng của biện pháp bổ trợ ribazole trong việc làm sạch virus lên sự sinh trưởng và phát triển của ba giống địa lan (Đỏ Bà Mai, Tím hột, Vàng Ba Râu) tại Đà Lạt Vũ Thị Phương Thanh Sinh viên Nơng học khĩa 27

6 Khảo sát về tình hình sản xuất các giống cúc tại Đà Lạt hiện nay Nguyễn Thị Như Quỳnh Sinh viên Nơng học khĩa 28

Abstrast

Lam Dong Province of Vietnam has an exceptional diversity of cutting flower of

Cymbidium and Chrysanthemum with approximately 38 and 72 varieties respectively

Plant tissue culture and micropropagation techniques play an important role in conservation programme and management of botanical collection

Chrysanthemum and Cymbidium plants collected from farmers were identified the

highest virus infection rate among of these species The results obtained by

observation samples of 54 varieties Chrysanthemum and 14 varieties Cymbidium

Using meristem culture and treated with Virazol in vitro suggest that the possibility could be obtained virus free plants through cultures

2

Mở đầu

1.Tính cấp thiết của đề tài

Việc du nhập ngày càng nhiều các giống hoa cắt cành là một xu hương cần thiết

đề đáp ứng nhu cầu thưởng thức hoa của người dân cũng như để xuất khNu Tuy nhiên

song song với việc chạy đua thay đổi về giống trên thị trường sản xuất hiện nay thì

đồng thời cũng có rất nhiều giống dần dần bị lãng quên, không phải vì các giống hoa

này không đảm bảo chất lượng mà là do thị hiếu của người tiêu dùng Việc nghiên cứu các biện pháp công nghệ trong lĩnh vực nhân giống các loài hoa cắt cành có giá trị kinh tế của địa phương nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen trong tập đoàn hoa cắt cành là một biện pháp cần thiết cho xu hướng phát triển đa dạng về hoa cắt cành trong tương lai và tránh lãng phí một số lớn các giống hoa mà bản thân đất nước chúng ta hiện nay chưa thể lai tạo được

2.Mục tiêu đề tài

Đề tài thực hiện nhằm những mục đích sau:

- Điều tra tình hình sản xuất hoa cắt cành hiện có tại Đà lạt

- Sưu tập và bảo tồn các nguồn gen quí về hoa cúc, hoa lan cắt cành, v.v có giá trị tại tình Lâm Đồng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

- Nghiên cứu các điều kiện môi trường sinh trưởng thích hợp của các giống cây con bảo tồn trong điều kiện in vitro

- Nghiên cứu các điều kiện môi trường giá thể sinh trưởng thích hợp của các giống cây con vườn ươm

- Tạo môi trường thực tập và nghiên cứu cho giáo viên và sinh viên

3.Phạm vi và giới hạn của đề tài

Đề tài chỉ thực hiện nghiên cứu bảo tồn các giống cúc và các giống hoa lan cắt cành

hiện còn tồn tại và đang sản xuất tại Thành phố Đà Lạt

NAA
-naphthalene acetic acid NCV Nghiên cứu viên

PLB Protocorm like body

TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) VW Vacin and Went (1949)

4

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Sơ lược về cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng 1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mô

Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình

nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ quan) thực vật trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng (15, 22, 29)

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật Cuối thế kỷ 19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh (15, 22)

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi

White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với

một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men Sau đó White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit Từ đó việc nuôi cấy

đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau

Năm 1958, tính toàn năng của tế bào đã được khẳng định bằng công trình nghiên cứu của Stewart và cs (1958) trên mô rễ cây cà rốt Các tác giả này đã nuôi cấy mô rễ cà rốt trên môi trường đặc có nước dừa và đã thu nhận được khối mô sẹo gồm các tế bào nhu mô Khi chuyển mô sẹo này sang môi trường lỏng có cùng thành phần và nuôi lắc thì nhận được huyền phù gồm các tế bào riêng lẽ và các nhóm tế bào Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường lỏng, không cấy chuyển thì thấy hình thành rễ

Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin

(1963) cùng thông báo rằng tế bào cà rốt tự do khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi bình thường ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng được khẳng định

Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính toàn năng của tế bào đã

được thông báo, hầu như tất cả các cơ quan đều có thể phát triển phôi Phôi soma đã

được ghi nhận ở nhiều giống như Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium,

Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza

Ngày nay bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, các cây lương thực, cây ăn quả Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới (10, 11, 15 22, 30)

5

1.2 Công nghệ sinh học thực vật trong nhân giống cây trồng

Công nghệ sinh học thực vật hình thành do áp lực tự nhiên của xã hội theo hai khuynh hướng: áp lực gia tăng năng suất và áp lực giảm năng suất mùa màng Trước những xu hướng đó, đòi hỏi ngày càng phải đưa nhanh kỹ thuật mới vào công tác lựa chọn, nhân giống cây trồng

Sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật theo thời gian có thể được tóm tắt như sau: từ những năm 1920 bắt đầu là lai chéo, năm 1960 là kỹ thuật gây đột biến, năm 1970 là sự phát triển kỹ thuật cấy mô, đến năm 1980 là kỹ thuật dung hợp tế bào trần và từ những năm 1990 đến nay là sự phát triển của kỹ thuật gen (10, 12, 15 22, 30)

Nhờ sự kết hợp giữa nuôi cấy mô thực vật và công nghệ gen, người ta đã tạo ra

được những thuộc tính mới cho cây trồng một cách có định hướng và hiệu quả Nhờ

thuộc tính totipotent của thực vật, người ta có thể hoàn toàn tái tạo nên một loạt các cây mới hoàn chỉnh từ một tế bào mang đặc tính mới chỉ trong một thời gian ngắn

Nhờ sự kết hợp này đã giúp cho công nghệ sinh học thực vật nói chung và nuôi cấy mô nói riêng có những bước tiến mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn Có thể nói một cách khái quát những ưu điểm của công nghệ này là:

- Chọn lọc nhanh những tính trạng mong muốn, nuôi cấy mô là con đường nhanh nhất giúp chọn lọc và biểu hiện tính trạng

- Nuôi cấy mô tạo nguồn nguyên liệu thực vật tuyệt vời cho quá trình chuyển gen ở thực vật

- Nuôi cấy mô kết hợp với kỹ thuật dung hợp tế bào trần và đột biến có thể tạo ra các dòng lai khác loài

- Giúp nhân giống vô tính với tốc độ và số lượng lớn - Giúp tạo được cây sạch bệnh

- Thực vật nuôi cấy mô là nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất các chất quý hiếm,

1.3 Vai trò của chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô

Chất điều tiết sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Chất điều tiết sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với một hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chất được tổng hợp nhân tạo Những chất điều tiết sinh trưởng này được vận chuyển đến các bộ phận khác của cơ thể gây nên những tác động điều tiết của cây

6

Vai trò điều hòa của chất điều tiết sinh trưởng thực vật là khởi động cho sự hình thành các phản ứng cá biệt hay các quá trình sinh lý nhất định hoặc trì hoãn quá trình đó

Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinin, ngoài ra gibberelin và ethylen cũng có vai trò quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật

1.3.1 Các auxin

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic axit (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ Ngoài IAA, còn có những dẫn xuất khác là naphtyl axetic axit (NAA) và 2,4 – diclophenoxyl axetic axit (2,4-D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia mô và trong quá trình tạo rễ (10, 12, 40, 41)

NAA, IBA, 2,4-D là những auxin tổng hợp, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA Chúng có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ

Đối với rễ, về cơ bản auxin ức chế sự phát triển của rễ, chỉ ở nồng độ cực thấp

(10-9 -10-12g/ml) thì mới có tác dụng kích thích sinh trưởng của rễ, vượt qua ngưỡng này (10-8mg/l) thì lại thể hiện tác dụng ức chế

IAA kích thích sự ra rễ và kìm hãm sự phát triển callus Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus và kìm hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy Mặc dù cùng nhóm chất auxin nhưng hai chất này lại có tính chất đối kháng

NAA được Went và Thimann (1937) tìm ra Chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy (10, 12, 40, 41)

Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và tăng cường hoạt động của một số enzim (10, 40, 41)

Benjamin và cs (1987) đã cho rằng nồng độ BA cao (1-5ppm) kích thích sự

phát triển của chồi đỉnh và đầu rễ của cây Atropa belladona Lat và cs (1988) cho rằng khi sử dụng kinetin để nhân nhanh cây Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 1-

5mg/l

Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều tiết sinh

7

trưởng nội sinh Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định

đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô

Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ này thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi, nếu tỷ lệ này cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển

mô sẹo Barna và Wakhlu (1998) chỉ ra rằng tốc độ tái sinh chồi của cây Plantago

ovata tăng cao khi trên môi trường sử dụng KIN 4-6 µM phối hợp với NAA 0,05µM

Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác động đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, dẫn đến quá trình mitos và cảm ứng cho sự phân chia tế bào

Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào, cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường (10, 12, 40, 41)

1.3.3 Các nhóm chất khác

Ngoài những nhóm chất điều tiết sinh trưởng kể trên, trong nuôi cấy in vitro

còn sử dụng một số nhóm chất khác như Abscicis acid, ethylen, các amino acid Abscisis acid sử dụng ở nồng độ cao là chất ức chế sinh trưởng và trạng thái nghỉ bắt buộc Ethylen được sinh ra trong quá trình nuôi cấy thực vật Ethylen có thể kìm hãm sự sinh trưởng tế bào và đNy nhanh sự lão hóa trong quá trình nuôi cấy mô Silver nitrat có thể được sử dụng để ngăn chặn ethylen hình thành trong quá trình nuôi cấy mô (40, 41)

Amino acid có thể nâng cao sự tăng trưởng của tế bào và sự tái sinh cây L Glutamine có thể được xem như là nguồn nitơ Enzim hydrolyzed protein N-Z amin Type A như casein hydrolyzate có thể được sử dụng hiệu quả đến 2g/l Thêm vào đó malate, citrate, pyruvate và acid vô cơ tương tự có thể có hiệu quả trong môi trường nuôi cấy protoplast và có thể làm giảm bớt độc hại của muối amonium (Gamborg & Shyluk, 1970; Gamborg, 1986)

Ngoài ra, các chất chiết của cây như coconut milk của cây quả hạch xanh có thể rất hiệu quả trong việc cung cấp phức hợp chất dinh dưỡng vô cơ không xác định và các nhân tố sinh trưởng

1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation)

Trong 5 thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về kỹ thuật vi nhân giống (Arditi và Krikorian, 1996; Chakrabarty và cs., 2001; Rasai và cs., 1995; Rout và cs., 2000) Vi nhân giống là sự nhân giống vô tính với số lượng của cây trồng thông qua nuôi cấy

mô in vitro Kỹ thuật nuôi cấy này đã được ứng dụng rộng rãi trong việc nhân giống

các loài cây cảnh và những loài khác trên toàn thế giới (Chu 1992; Huetteman và Preece 1993; Mantell và cs., 1985; Prerik, 1987)

Một trong những dạng thú vị và quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro là

khả năng tái sinh và sinh sản của cây từ nuôi cấy tế bào và mô Dạng đơn giản nhất

của tái sinh cây in vitro là kích thích sự phát triển của chồi Kỹ thuật này tận dụng sự

phát triển cá thể cho sự phát triển chồi bằng đỉnh sinh trưởng hoặc chồi bên Trạng thái ngủ của những chồi này bị phá hũy và sự phát triển của các chồi non được kích

8

thích bằng tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng (thường sử dụng cytokinin) để tái sinh ra chồi con Các chồi con này sau đó được tách ra cho phát triển rễ để tái sinh cây con

Sự tái sinh cây từ nuôi cấy mô có thể được thực hiện bằng cách nuôi cấy từ

đỉnh sinh trưởng, từ callus và từ tế bào, hoặc chồi nách vì chồi nách là tiền thân của đỉnh sinh trưởng Ngược lại, sự tái sinh bất định diễn ra tại những vị trí khác như là

các đốt thân, từ lá mầm, vùng kéo dài ra của rễ Sự tái sinh chồi bất định thường phụ thuộc vào sự có mặt của gen cấu trúc Nhưng sự tái sinh cây từ callus và từ tế bào thường không có mặt của gen cấu trúc

Sự phát sinh cơ quan là sự hình thành các cơ quan riêng biệt như chồi hoặc rễ Sự tái sinh phôi soma là sự hình thành cấu trúc lưỡng cực chứa cả chồi và rễ Hầu hết các cây trồng có thể tái sinh cây theo cách phát sinh cơ quan hoặc phôi soma nhưng rất ít loài có thể được cả hai cách Một số loài có thể tái sinh một cách dễ dàng từ nuôi cấy mô và tế bào trong khi một số loài chỉ có thể tái sinh bằng quá trình bất định

Sự tái sinh cây từ chồi nách hoặc chồi đỉnh được ứng dụng rộng rãi trong vi nhân giống do có sự biến dị ít nhất Ngược lại sự phát sinh chồi bất định và sự tái sinh cây từ callus bởi sự phát sinh cơ quan hoặc bởi phôi soma có biến dị cao như tốc độ tái sinh của nó

1.4.1 Các bước thực hiện trong kỹ thuật vi nhân giống

Trong kỹ thuật vi nhân giống có 4 giai đoạn đặc trưng (Murashige 1974, George và cs 1984)

Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu cấy và nuôi cấy khởi đầu

Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi con hoặc chồi mầm từ mẫu ban đầu

Sự tái sinh chồi bất định là kỹ thuật nhân nhanh được sử dụng thường xuyên nhất trong vi nhân giống (Chu 1992) Môi trường nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng trong giai đoạn này được cung cấp tối ưu để tỉ lệ nhân nhanh chồi đạt tối đa

Giai đoạn 3 : là giai đoạn tái sinh rễ từ chồi con để tái sinh cây con Giai đoạn này cần môi trường đặc trưng hoặc không, điều này phụ thuộc vào kiểu gen của loài

Giai đoạn 4: hoàn chỉnh cây con cho thích nghi trên điều kiện trồng trên hỗn hợp đất trong nhà kính để sau đó chuyển ra đồng ruộng

1.4.2 Các nhân tố trong môi trường nuôi cấy invitro

Mức độ thành công của bất kỳ một kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào hoặc nuôi cấy cơ quan đều liên quan đến nhiều nhân tố Nhân tố quan trọng là lựa chọn thành phần dinh dưỡng và chất điều tiết sinh trưởng Trong hai đến ba thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về thành phần của các môi trường cơ bản (Sheet và Shillito, 1997; Perik 1987; Torres, 1989)

Môi trường nuôi cấy

Có hơn 50 công thức môi trường khác nhau được sử dụng cho nuôi cấy in vitro

nhiều loại cây khác nhau (Gamborg và cộng sự, 1976; Huang và Murashige, 1977) Trong đó môi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, có cải biên bằng sự thay đổi thành phần các vi lượng (Chand và cs., 1977; Jha và Sen, 1985; Rout và cs., 1999; Saxena và cs., 1988)

9

Môi trường dinh dưỡng bao gồm các loại muối vô cơ, nguồn cacbon, vitamin và chất điều tiết sinh trưởng Một số thành phần khác có thể được bổ sung thêm như nitơ vô cơ, acid vô cơ và chất chiết cây trồng (Gamborg, 1986)

Các muối khoáng được sử dụng như là thành phần của môi trường nuôi cấy mô tế bào Hầu hết các môi trường chứa ít nhất 30mM nitơ vô cơ và kali vô cơ Muối amonium có thể được sử sụng từ 2-20mM Ảnh hưởng của muối amonium có thể thay

đổi từ ức chế đến hiệu quả Nồng độ Ca, SO4, photphat và muối Mg từ 1-3 mM là thích hợp Ngoài ra trong môi trường cũng cần bổ sung thêm một số khoáng vi lượng

Môi trường MS (1962) hoặc Linsmainer và Skoog (1965) (LS) được sử dụng rộng rãi, đặc biệt là trong quá trình tái sinh cây Môi trường B5 (Gamborg và cs., 1968), N6 (Chu, 1978), Nisch và Nitsch (1969) (NN) và các dẫn xuất từ các môi trường này có thể được sử dụng rộng hơn cho nhiều loại cây Theo Huang và cs., Indra D Bhatt và Uppeandra Dhar (2000), cây dâu tây phát triển thích hợp trên môi trường MS

1.4.2.2 Các chất điều tiết sinh trưởng

Liều lượng chất điều tiết sinh trưởng lên môi trường nuôi cấy quyết định rất lớn đến sự thành công của nuôi cấy mô thực vật Mor và Zieslin (1987), Rout và cs (2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và mối tương tác giữa chúng lên vi nhân giống của nhiều loại cây khác nhau, trong đó đã có báo cáo rất rõõ về ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự nhân nhanh chồi của nhiều loại cây khác nhau Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho việc nhân nhanh chồi

Theo Indra D Bhatt và Uppeandra Dhar khi sử dụng BA, Kinetin, 2-ip trên môi trường MS, tốc độ nhân nhanh tốt nhất khi bổ sung BA Theo kết quả nghiên cứu của Kang và cs (1994), BA là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho sự nhân

nhanh chồi từ mẫu lá của cây dâu Fragaria x ananassa Loại dâu này sẽ cho số lượng

chồi cao, hiệu quả nhất trên môi trường MS có bổ sung 4,0 µM BA kết hợp với 0,1 µM NAA Tác động kết hợp giữa BA và auxin sẽ làm tăng số lượng chồi (Uppadhaya và Chandra, 1983) Hu và Wang (1983) cho rằng nồng độ cytokinin cao sẽ làm giảm số lượng chồi sinh sản, nhưng khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ cho chất lượng chồi không tốt, chồi hình thành dạng hoa thị hoặc những nốt nhỏ ở cuối gốc

Trong nuôi cấy rễ in vitro, sự có mặt của cytokinin trên môi trường thường hạn

chế khả năng ra rễ Cây sẽ hình thành rễ trong môi trường có bổ sung auxin hoặc không cần bổ sung thêm auxin phụ thuộc vào kiểu gen của cây trồng (Rout và cs., 2000)

1.4.2.3 Nguồn cacbon và những cơ chất khác

Nguồn cacbon được sử dụng trong môi trường thường từ 2-3 % đường saccaro hoặc glucose (nhưng rất ít) Những nguồn cacbon khác có thể là lactose, maltose, galactose nhưng rất ít sử dụng Nguồn cacbon này đóng vai trò trong sự phát triển tế bào Hầu hết các cây trồng có thể tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển nhưng với những vitamin đặc trưng như vitamin B1), vitamin B3,

vitamin B6 và myo- inositol cần được bổ sung vào môi trường trong nuôi cấy in vitro

để nâng cao sự sinh trưởng và sự phân hóa (Gamborg và cs., 1968)

10

Agar được sử dụng rộng rãi trên các môi trường đặc và bán đặc, nhưng một vài egllin agent khác có thể sử dụng như gelatin, agrose, aglinate và gebrite

Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường ở các giai đoạn khác nhau của

quá trình nuôi cấy in vitro Than hoạt tính không phải là chất điều tiết sinh trưởng, nó

đóng vai trò như là chất hút Nm của môi trường Than hoạt tính có khả năng hấp thụ

một số chất không có lợi cho sự phát triển của cây như các chất được sản sinh ra trong quá trình khử trùng môi trường nuôi cấy hoặc một số chất do cây trồng tiết ra

Đôi lúc than hoạt tính cũng đóng vai trò như chất điều tiết sinh trưởng (Ebert và cs.,

1993; Eymar và cs., 2000; George và Sherrington, 1984) Bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường có thể có lợi cho việc hình thành rễ của cây do than hoạt tính có tác dụng hạn chế mức độ chiếu sáng hoặc than hoạt tính có khả năng hấp thụ các chất ức chế sự ra rễ có trong môi trường nuôi cấy (Dumas và cs.,1995; George và Sherrington, 1984)

1.4.2.4 Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn cốt lõi quyết định đến sự thành công trong nuôi cấy in vitro

Có 3 cách thường được sử dụng trong vi nhân giống : thông qua callus, sự hình thành chồi bất định và chồi nách (Bhojwani và cs., 1996) Trong trường thông qua nuôi cấy chối nách, tốc độ nhân nhanh phụ thuộc vào nồng độ cytokinin thích hợp trên môi

trường và sự cấy chuyển trong quá trình tái sinh cây Trên cây dâu tây Fragaria x

ananasa, tốc độ nhân nhanh chồi đạt kết quả tốt nhất khi bổ sung vào môi trường MS

các chất điều tiết sinh trưởng BA (4,0 µM) và NAA (0,1 µM) sau 60 ngày nuôi cấy Nhưng khi bổ sung vào môi trường nồng độ BA cao hơn 4,0 µM cùng với 0,1 µM NAA sẽ làm cho chồi sinh trưởng không tốt và chất lượng chồi xấu, do đó tốc độ nhân nhanh cũng giảm

1.4.2.5 Sự hình thành rễ

Sự hình thành rễ của nhiều loài cây có thể không cần bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng (Saxena và cs., 1998) Rễ của nhiều loài cây có thể được hình thành dễ dàng khi nồng độ các muối khoáng giảm đi một nữa hoặc giảm hơn, và nồng độ

đường giảm từ 2 hoặc 3% đến 0.5% (Webb và Street, 1977) Theo Indra D Bhatt và

Uppeandra Dhar khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) lên sự hình thành

rễ của loài Fragaria x ananasa, cây ra rễ tốt nhất khi sử dụng NAA với liều lượng

thấp (0.1mg/l)

Rễ của một số loài cây có thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường, đôi khi có bổ sung thêm auxin Than hoạt tính làm nâng cao sự phát triển của rễ khi rễ đầu tiên vừa được hình thành (Marthur và cs., 1999) Sự phát triển của rễ tốt hơn khi trong môi trường có chất hút các chất ức chế ra rễ hoặc làm giảm mức độ chiếu sáng bằng cách bổ sung than hoạt tính (Druart và cs., 1993; George và Sherrington, 1984)

Sự phát triển sung mãn của hệ rễ của cây con trong nuôi cấy in vitro là điều

kiện thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng

11

2 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu họ lan (Orchidaceae) và chi địa lan (Cymbidium

sw.)

2.1 Khái quát chung

Lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông vào 551-479 trước công nguyên bởi Khổng Tử

Cây lan được biết đến đầu tiên ở Trung Quốc là Kiến Lan (tìm ra ở Phúc kiến)

là Cymbidium enrifolium

Theo Phrastus được xem là ông tổ của thực vật học và cũng có thể nói là cha

đẻ của ngành học về lan Orchis được ông dùng để chỉ những cây lan tìm thấy ở vùng Địa Trung Hải

Thế kỷ thứ nhất sau công nguyên, Dioscorides dùng Orchis để mô tả 2 loài địa lan trong quyển sách về dược liệu của ông và được Linnaeus ghi lại trong sách “Các Loài Cây Cỏ” (Species Plantarum) vào 1753, rồi John Lindley sử dụng đầu tiên để đặt tên cho họ lan là Orchidaceae từ năm 1836 và tồn tại cho đến nay

Ở Việt Nam sự nghiên cứu về lan chưa rõ rệt lắm nhưng có lẽ người đầu tiên

tìm hiểu và nuôi trồng lan là vua Trần Anh Tông, kế đến là Joanis Loureiro, là nhà truyền giáo người Bồ Đào Nha (1789) trong cuốn “ Thực Vật Chứng Nam Bộ ” (Flora Cochinchinesis) các cây lan trong cuộc hành trình đến nam phần Việt Nam và

đã được Bentham và Hoocker ghi lại trong “ Các Giống Cây Cỏ” (Genera

Plantarum)(1862 – 1883) F Gagnepain và A Guillaumin mô tả 101 giống gồm 636 loài lan cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ “ Thực Vật Chí Đông Dương ” do Hlecomte chủ biên

Đáng kể nhất là quyển II bộ sách “ Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam” của giáo sư

Phạm Hoàng Hộ với 289 loài lan được mô tả và vẻ hình Mới dây giáo sư đã bổ sung thêm 364 loài lan trong quyển III tập 2 của bộ sách “Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam”

xuất bản 1993 Trong đó chi Cymbidium.sw có 15 loài:

C.aloifolium (Lindl.).sw, C.atropurpureum (Lindl.) Rolfe., C.banaense Gagn, C bicolor lindl, C.dayanum Reich.b.f, C.devonianum Paxt., C.enrifolium (Lindl.).sw, C.erythrostylum Rolfe, C.filay sonianum Lindl., C.inrigne Rolfe, C.lancifolinum Hookf, C.lowianum Reich.b.f, C.schroederi Rolfe., C.sinense (Jacks)Willd., C.macroshizon Lindl

Theo Trần Hợp trong cuốn “Phong Lan Việt Nam” tập 1 và 2 xuất bản 1988-

1990 thì họ lan Việt Nam có khoảng 368 loài, trong đó chi Cymbidium có khoảng 10

loài sau:

C.aloifolium (Lindl.).sw, C.dayanum Hookf, C devonianum Paxt., C.enrifolium (Lindl.).sw, C.evrardii Guillaum, C.grandiflorum Griff, C.inrigne Rolfe, C.lancifolinum Hookf, C.parishii Reich.b., C.poilanei Gagnep

Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến trong cuốn “Phân Loại Học Thực Vật – Thực Vật Bậc Cao” xuất bản 1978 thì họ lan ở Việt Nam có 91 chi 463 loài, trong đó chi Cymbidium có khoảng 12 loài sau:

12

C.aloifolium Swartz., C.cyperifolium Wallex Lindl, C.dayanum Reich.b.f, C devonianum Paxt., C.ebarneum Reich.b.f, C.enrifolium Swartz., C.erythrostylum Lindl., C.giganteum Wall., C.inringne Reich.b.f., C.lancifolinum Hookf, C.polanei Gagn., C.munronianum kinget plant

2.2 Một vài nét về địa lan Đà Lạt

Hiện nay, nhu cầu hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới và trong nước đang ngày càng tăng Trong năm 2000 kim ngạch xuất khNu hoa lan cắt cành và giống cây lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đó chỉ riêng hoa lan cắt cành đã chiếm 128 triệu USD Do đó việc trồng lan đã trở thành một hướng phát triển kinh tế của nhiều nước trên thế giới và đang phát triển mạnh mẽ ở khu vực Đông Nam Á

Thái Lan trở thành một nước xuất khNu hoa cắt cành và cây giống lan nhiều nhất trên thế giới từ 1990 đến 1995 số lượng lan cắt cành xuất khNu ở Thái Lan tăng 1.7 lần, từ 15.6 triệu cành lên 26.5 triệu cành

Chính phủ Malaysia đã thấy hiệu quả kinh tế lớn của việc trồng lan nên đã giao 300 ha đất cho hiệp hội hoa lan Malaysia, với mục đích quy hoạch vùng này thành trung tâm sản xuất hoa xuất khNu

Trong những năm gần đây Nhà nước ta cũng định hướng phát triển việc trồng lan không chỉ phụ vụ cho xuất khNu mà còn phục vụ cho ngành du lịch Các cấp lãnh

đạo nhà nước từ Trung ương đến địa phương đã bắt đầu thấy được tầm quan trọng của

ngành xuất khNu hoa lan nên đã có những chủ trương khuyến khích phát triển Năm 1978, ngành xuất khNu thành phố Đà Lạt đã xuất khNu lô đầu tiên sang các nước Châu âu với 3000 cành lan., cho đến nay thì số lượng này đã tăng lên đáng kể

Hiện nay việc trồng lan đem lại hiệu quả kinh tế cao, đây là một mặt hàng thu nhiều ngoại tệ, nhưng bản thân nó lại chẳng yêu cầu phải có vốn đầu tư quá cao

Điều kiện tự nhiên của Đà Lạt phù hợp với việc trồng nhiều loài hoa, đặc bệt là

hoa lan Trong đó địa lan Đà lạt vốn nổi tiếng từ lâu về sự phong phú và vẻ đẹp độc

đáo mà chỉ có địa lan ở Đà Lạt mới có được Những năm gần đây, ngành trồng lan Đà

Lạt đã có những biến chuyển đáng kể Diện tích trồng hoa thay thế cho trồng rau ngày càng tăng Hiện nay Đà Lạt có 400 ha trồng hoa với 300 triệu cành hoa xuất khNu hàng năm Hướng phát triển đến năm 2010 tăng diện tích trồng lên 450 – 500 ha trong

đó ưu tiên phát triển trồng lan Thêm vào đó, với sự trợ giúp của công nghệ nuôi cấy

mô, việc nhân giống và tạo ra những giống mới do lai tạo cũng dễ dàng hơn, từ đó mà thời gian trồng lan được rút ngắn lại

Hiện nay sản lượng hoa lan cắt cành đặc biệt là địa lan vẫn chưa đủ cung cấp cho nhu cầu rộng lớn của thị trường Trong khi đó dịch bệnh thối giả hành, và một số bệnh do virus hoành hành đã làm giảm một lượng lớn số chậu địa lan có ở Đà Lạt Do vậy ngành trồng lan trong đó Cymbidium là chủ đạo sẽ còn tiếp tục phát triển Từ một vài dẫn liệu nêu trên, ta có thể mạnh dạn kết luận việc nuôi trồng Cymbidium ở Đà Lạt có một ưu thế tuyệt vời Và đây là một tiềm năng to lớn mà nếu chúng ra biết cách tác động sẽ đem lại lợi nhuận cao

Họ lan là họ có số lượng loài lớn thứ 2 với khoảng 20000 - 25000 loài Trong

đó Cymbidium được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, Cymbidium có những

13

đặc điểm nổi bật cả về giá trị thNm mĩ lẫn giá trị khoa học Vẻ tao nhã, hài hòa của

chúng từ lâu đã hiện diện trong văn học nghệ thuật và gắn liền với đời sống văn hóa của con người Phương Đông

2.3 Hình thái bên ngoài của địa lan

Về hình thái bên ngoài địa lan là những cây thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ Thân ngầm của địa lan (căn hành) thường ngắn nối những củ với nhau, … các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành Củ già, khi bị tách khỏi căn hành cũ có thể phát sinh đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những cây con, do đó người ta xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân

Củ lan (giả hành) thường có dạng con quay hay dạng hột xoài Đường kính của giả hành từ 1cm đến 15cm Giả hành được bao bọc bởi các bẹ lá xếp xít nhau, do đó giả hành của địa lan không rõ ràng như một số loài lan khác như denrobium, catleya

Rễ của một số loài địa lan bì sinh hay phụ sinh thường mọc bám trên vỏ cây, mặt đất Một số loài khác có rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay thực sinh) Những rễ mới thường chỉ mọc ở cây con, còn cây mẹ ít khi hình thành rễ mới mà chỉ thấy những rễ phụ phân nhánh từ rễ củ

Lá địa lan thường có hai dạng, dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính trên giả hành Lá ở dạng thực đính trên giả hành thường có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một phần phân cách, khi phiến lá rụng vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành, một số loài không có cuống lá Tùy theo từng loài mà hình dáng của phiến lá, gân lá rất khác nhau, gân dọc nổi rõ hay gân chìm trong thịt lá Một số loài ít chịu rợp có phiến lá màu vàng xanh, còn lại thường là màu xanh đậm Bản lá và độ dày của lá thay đổi tùy theo từng loài, các loài sống ở trảng trống có lá hẹp và dày hơn các loài ưa bóng rợp Lá có dạng dải, dạng mũi mác hay dạng phiến Đầu lá thường là nhọn, hay chia thành hai thùy Kích thước của lá biến động từ 0.5 cm – 6cm, chiều dài thay đổi từ 10 cm – 150 cm

Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới của giả hành từ các nách lá, tách các bẹ già đâm ra ngoài Chồi hoa thường xuất hiện cùng với chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuôi cá, nhưng chồi hoa căng tròn hơn, trong khi đó chồi thân thì hơi dẹt Các lá

đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuôi cá, còn các lá bao ở chồi hoa thì

luôn ôm chặt quanh phát hoa

Cành hoa không phân nhánh, có thể dựng đứng hay buông thõng Cành hoa có thể mang từ vài hoa đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo hình xoắn ốc Búp hoa khi đã đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cành hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi xuống dưới, sau đó búp hoa bắt đầu bung cánh

Hoa Cymbidium thoạt nhìn có 6 cánh với 5 cánh gần giống nhau và 1 cánh môi Thực ra 3 cánh bên ngoài chính là 3 lá đài, có màu sắc giống 2 cánh hoa ở trong Cánh hoa cuối cùng biến đổi thành cánh môi có màu sắc sặc sỡ hơn

Hoa Cymbidium là hoa lưỡng tính, đặc biệt nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trục hợp nhụy (trụ nhị - nhụy) Trên trục hợp nhụy, thì nhị nằm ở trên cùng mang hai khối phấn màu vàng, có gót dính như keo Khối phấn được đậy bởi một nắp màu trắng ngà, nắp này dễ mở rời và cách biệt với nuốm nhụy bởi một các mỏ nổi lên Do hoa có cấu trúc đặc biệt như vậy nên Cymbidium trong tự nhiên quá

2.4 Phân loại địa lan

Trong hệ thống phân loại họ lan là một họ lớn thứ hai với 20.000- 25.000 loài chỉ sau họ cúc (A.L Takhtajan) Loài địa lan thuộc

Ngành: Magnoliophyta- Angiospermae Lớp: Liliopsida- monocotyledemes Bộ: Orchidales

Họ: Orchidaceae Chi: Cymbidium

Theo các tác giả Võ Văn Chi và một số tác giả khác thì trong tự nhiên có chi Cymbidium có khoảng hơn 50 loài, và ở Việt Nam có 15 loài trong đó chỉ riêng Đà Lạt có tới 12 loài

- Cymbidium aloifolium Swartz (Hay Cymbidium aimulans Rolfe; Cymbidum

Pubesecens Lindl)

- Cymbidium cyperifolium - Cymbidium dayanum Reichb.F - Cymbidium devoniaum Paxt - Cymbidium eburneum Reichb

- Cymbidium ensifolium Swartz (hay Cymbidium sudaicum Schltr)

- Cymbidium erythrostylum Lindl (hay Cymbidium longifolium Don; Cymbidium Limodorum Angustiflorum Ham)

- Cymbidium gagiteum Wall (hay Cymbidium gradnifolium Griff; Cymbidium

hookerianum R)

- Cymbidum insigne Rolfe

- Cymbidium Lancifolium Hook F (hay Cymbidium gibsonii Paxt; Cymbidium

javancum Hook F.)

- Cymbidium polanei Gagn

- Cymbidium munronianum King et Plan

15

Ở Đà Lạt ngoài 12 loài trên còn có nhiều biến chủng khác, nhưng hiện nay vẫn

chưa xác định rõ loài, thứ Từ lâu đồng bào dân tộc ở Đà Lạt đã dùng từ Tòong Plăng có nghĩa là “lan sả” để gọi những loài lan này Nhưng cho tới khi người Pháp và người Kinh đến Đà Lạt thì phong trào trồng lan và phát triển lan ở Đà Lạt mới bắt đầu phổ biến và ngày càng phát triển

Cuối những năm 50 của thế kỷ này, một số giống lan lai đã di nhập vào Đà Lạt

để thoả mãn về nhu cầu giống mới và thị hiếu của một số người chơi lan giàu có

Trong quá trình nuôi trồng lan lai, giới chơi lan đã tích luỹ dần những kinh nghiệm trong việc xác định các yếu tố giá thể, giàn che, cách tưới nước bón phân,… phù hợp với điều kiện khí hậu ở Đà Lạt Những cây lai đó đã phát triển tốt và cho ra hoa đều

đặn hàng năm Từ đó phương pháp trồng “lan ngoại” đã được hình thành và được phổ

biến nhưng cũng chỉ dừng lại trong phạm vi hẹp của những người trồng lan tiêu khiển Trong mấy năm gần nay, phong trào trồng lan của người dân Đà Lạt đang có chiều hướng phát triển mạnh các loài địa lan, đặc biệt là các loài lan nhập nội như: Tím Hột, Miretta xanh, Xanh Chiểu, Trắng bệt, Trắng Bệt, Hồng Bệt, Miss Kim, Đỏ Bà Mai, Vàng Ba Râu, Miretta xanh,… … Vì các giống lan này cho hoa rất đẹp, màu sắc sặc sỡ, hương thơm và đặc biệt là lâu tàn nên đã làm thu hút các nhà vườn, các nghệ nhân chơi hoa, họ đã chú ý nuôi trồng và nhân giống ngày càng nhiều

2.5 Virus hại thực vật

Virus thực vật được phát hiện vào cuối thế kỉ 19 và đến đầu thế kỉ 20 có rất nhiều virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm thuốc lá dưa chuột, virus thoái hóa khoai tây, virus hại cà chua,…Virus thực vật gây nhiều thiệt hại như làm giảm chất lượng nông sản, giảm năng suất và có khi là mất 100% năng suất Trên thế giới hàng năm bệnh virus gây thiệt hại khoảng 70 tỉ USD (Nguyễn Văn Tỵ, 2002)

Tại nước ta, nhiều bệnh virus được truyền từ năm này qua năm khác gây thiệt hại một vài phần trăm cho đến 80- 90% năng suất cây trồng, đặc biệt virus gây thoái hóa nghiêm trọng các cây trồng nhân giống vô tính Hiện nay, các cây đang trồng cũng như cây mô ở Đà Lạt đều không hoàn toàn sạch bệnh, và virus là nguyên nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất cản trở sự phát triển của sản xuất trồng trọt hiện đại Việc nghiên cứu và phòng bệnh virus giúp giảm thiệt hại do bệnh virus gây ra là rất cần thiết, đặc biệt là những nước có nền kinh tế dựa vào nông nghiệp là chính như nước ta

Ivanopski là người đầu tiên khám phá ra thế giới virus khi nghiên cứu bệnh trên cây thuốc lá vào năm 1892 Virus được phát hiện đầu tiên đó gây những vết khảm trên lá cây thuốc lá là Tobaco Mosaic Virus và đây cũng chính là loài virus có phổ cây chủ lớn nhất hiện nay Cho đến nay, với sự phát triển của sinh học và sự trợ giúp của trang thiết bị, phương tiện hiện đại, con người đã phát hiện được trên 4 ngàn loại virus, trong đó có hơn 100 loại là virus hại thực vật và có tới hơn 25 loài virus gây hại trên cây lan

Như vậy, virus thực vật là những vi sinh vật có kích thước vô cùng nhỏ bé và có những đặc điểm sau đây (PGS.TS Vũ Triệu Mẫn và PGS.TS Lê Lương Tề, 2002)

16

Virus là những nucleoprotein rất nhỏ bé do đó phải quan sát chúng trên kính hiển vi điện tử Virus có cấu tạo rất đơn giản: có hai phần chính là lõi axit nucleic và vỏ protein

Thông thường virus thực vật có vật chất di truyền là ARN, một số ít còn lại có vật chất di truyền là ADN

Virus là vi sinh vật kí sinh ở mức độ tế bào Virus thực vật có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây, và mỗi loại cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus

Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhiễm vào tế bào cây chủ chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus sử dụng vật chất của tế bào để tạo thành vô số virus con mới Do vậy cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dần, thoái hóa và suy tàn có khi bị chết Khoảng thời gian từ lúc virus bắt đầu xâm nhiễm

đến khi cây thoái hóa và chết phụ thuộc vào đặc điểm gây bệnh của các loài khác

nhau và phụ thuộc vào từng loài cây cũng như sức chống chịu của từng cây

2.5.1 Thành phần cấu tạo

Thông thường mỗi virus được tạo từ hai thành phần chính là protein và axit nucleic, một số virus đặc biệt còn có cả polyanin, lipit, hoặc một số men đặc hiệu Dựa vào những hiểu biết về đặc điểm cấu tọa của virus mà các nhà khoa học đã tìm ra những chất hóa học có tác dụng làm giảm sự nhân lên của virus trong tế bào cây chủ

Protein của virus thực vật có tác dụng bảo vệ, bám giữ và có vai trò quan trọng trong việc virus truyền bệnh qua môi giới Protein của virus thực vật cũng được tạo thành từ nhiều axit như alanin, acginin, glixin, triptophan, valin,…Các virus (ARN hay ADN) sẽ quyết định bản chất protein của chúng

Ở bên ngoài tế bào cây chủ có những điểm đặc biệt hay những thụ thể để virus

nhận biết mà bám vào, từ đó mới bơm nucleic vào tế bào Do đó từ kết quả phân tích vỏ protein của virus và biết được trình tự nhận biết đó thì sẽ tổng hợp được những chất hóa học có cấu tạo giống các thụ thể để giảm tốc độ lan truyền virus trong cây chủ

Axit nucleic của virus giữ vai trò chủ yếu quyết định tính di truyền, khả năng truyền nhiễm và gây bệnh Phần lớn các virus thực vật có vật chất di truyền là ARN, một số ít là ADN Cả ARN và ADN đều là những đại phân tử chứa hàng trăm ngàn các đơn vị nhỏ được gọi là các nucleotit Mỗi nucleotit được cấu tạo từ một gốc photphat, bazơ nitơ và đường 5 carbon Có 2 nhóm bazơ nitơ là purin và pirimidin với 5 loại là uracil, adenin, guanin, xitozin và timin

Dựa trên cấu tạo của các nucleotit mà con người đã tổng hợp nên những dẫn xuất của chúng hoặc những hóa chất mà về mặt hóa học tương tự các nucleotit này Các hóa chất này sẽ cạnh tranh với các nucleotit để tham gia tạo thành các axit nucleic, và do đó làm sai khác trật tự nucleotit và làm giảm tốc độ tái sản xuất của virus

2.5.2 Về cách gọi tên: tên virus thường được đặt theo qui tắc sau

Tên virus = Tên cây chủ + Đặc điểm bệnh + Virus

Virus thực vật muốn kí sinh và gây bệnh cho cây chủ thì virus phải bám được vào thành tế bào và xâm nhiễm vào trong tế bào Bản thân virus không chủ động di chuyển và xâm nhập vào bên trong tế bào được Sự xâm nhiễm của virus thực vật vào cây chủ có thể thông qua các vectơ truyền bệnh như côn trùng, bét nhện,… hoặc qua các vết thương cơ giới do con người gây ra trong quá trình cắt tỉa cây trồng Sau khi xâm nhập được vào bên trong tế bào, sự lây lan của virus từ tế bào này sang tế bào khác có thể qua cầu nguyên sinh giữa các tế bào, hoặc qua dòng vận chuyển vật chất Người ta cũng phát hiện ra rằng trên tế bào có một số điểm nhận biết đặc biệt mà virus có khả năng bám vào để từ đó xâm nhập vào tế bào, gọi là các thụ thể

Sau khi xâm nhiễm vào tế bào cây chủ, virus sẽ giải phóng vật chất di truyền (RNA, DNA) quá trình này gọi là sự lột áo (uncoating) Tiếp đó là quá trình tái tạo vật chất di truyền và biểu đạt gen

Đối với virus có vật chất di truyền là ARN (ARN virus), quá trình tái tạo ARN

gồm tái tạo ARN của virus và mARN protein của virus “ARN virus ” lợi dụng ribosom của cây chủ phiên dịch ra là enzym ARN- phụ thuộc ARN (ARN- dependent ARN polymerasa, RdRp) Dưới tác dụng của RdRp tế bào sẽ tổng hợp ra hàng loạt ARN con của virus và ARN tổ gen của virus, lúc này ARN tổ gen sẽ tiến hành phiên dịch ra protein vỏ áo Cuối cùng “ARN con” và “protein vỏ áo” lắp vào nhau tạo thể virus con hoàn chỉnh Vô số virus con được tạo thành sản sinh ra enzym phân giải màng tế báo ký chủ để phóng thích virus con ra ngoài, từ đó tiếp tục xâm nhiễm sang các tế bào bên cạnh

Đối với virus có vật chất di truyền là ADN, sự tái tạo lại vật chất di truyền có

thể xảy ra theo con đường sau: đầu tiên là từ DNA sẽ phiên mã ra RNA , sau đó xảy ra quá trình phiên mã ngược từ RNA qua DNA và quá trình tổng hợp protein từ RNA Cuối cùng là protein và DNA sẽ kết hợp với nhau để tạo thành virus mới hoàn chỉnh

Như vậy virus sử dụng vật chất của tế bào để sinh sản Do đó virus cũng gây ra những biến đổi về sinh lí và hình thái bên ngoài của cây bị bệnh

2.5.3Virus gây biến đổi về sinh lí cây chủ

Virus thực vật kí sinh bên trong tế bào và sử dụng vật chất của tế bào cây để xây dựng cơ thể virus mới do đó gây ra những tác động lên quá trình tổng hợp và trao

đổi chất của tế bào cây chủ Virus có thể kìm hãm sự tổng hợp, trao đổi chất này

trong khi đó lại kích thích sự tổng hợp và trao đổi chất khác

18

Virus tác động lên quá trình hoạt động của hệ thống men trong tế bào để kìm hãm enzym phản ứng tạo nên một số chất này hay kích thích tạo ra nhiều chất có lợi cho virus Trong cây bị bệnh virus, hoạt động một số men oxi hóa được tăng cường như oxidaza (Woods, 1899), peroxidaza (Kokin, 1937), tirodinaza, xitocromoxidaza (Martin, 1954), polyfenoloxida (Van Kammen và Drouwer, 1964), ngược lại thì hoạt

động của một số men khác bị kìm hãm như catalaza (Vager, 1955)

Virus gây bệnh cho cây cũng tác động lên quá trình hô hấp của cây Những thay đổi này không ổn định (có thể cao hay thấp) tùy thuộc vào giai đoạn sinh trưởng của cây, điều kiện thời tiết hay tình trạng sinh lí của cây trồng

Bệnh virus thường làm giảm số lượng diệp lục trong lục lạp, do vậy làm giảm hiệu quả quang hợp của cây Cùng với sự giảm số lượng diệp lục thì các sắc tố như antoxianit, carotinoit sẽ tăng lên, làm cho lá cây nhiễm bệnh virus chuyển màu từ màu xanh sang màu vàng hay nâu đỏ

Bên cạnh đó, virus thực vật còn làm thay đổi tốc độ trao đổi gluxit trong cây Ban đầu cây bị bệnh ở bộ phận hoa, lá cây sẽ tích lũy các chất đường ở vị trí nhiễm bệnh Nhưng về sau hàm lượng đường ở các lá bị bệnh sẽ thấp hơn so với các lá khỏe Nguyên nhân là do virus ban đầu làm cản trở quá trình vận chuyển ở các bộ phận bị bệnh đến các bộ phận khác dẫn đến việc tích lũy đường ở các bộ phận này Sau đó, virus sử dụng vật chất của tế bào, thúc đNy quá trình hô hấp nên hàm lượng đường ở bộ phận bị bệnh sẽ thấp hơn các bộ phận khác trong cây

2.5.4Virus gây biến đổi về hình thái

Thông thường cây chủ chỉ có biểu hiện bệnh ra bên ngoài khi mà đã bị nhiễm bệnh khá nặng Một số triệu chứng về hình thái do virus gây ra:

- Triệu chứng khảm lá: Là triệu chứng rất phổ biến của nhiều bệnh virus mới hại thực vật Lá cây loang lổ chỗ xanh đậm, chỗ xanh nhạt, chỗ biến vàng (Mosaic - khảm lá) Khảm lá thường xảy ra ở các bệnh như: Virus khảm thuốc lá, khảm

ớt, dưa chuột, khảm lá đậu, khảm lá táo tây

- Đốm chết hình nhẫn: Thương gặp là khảm và tạo ra đốm chết loại hình nhẫn

(đốm vòng) như bệnh đốm hình nhẫn ở cây đu đủ, cây mận, cây thuốc lá, cây hoa cNm chướng

- Triệu chứng hại gân lá: Là hiện tượng bệnh phá hoại ở gân lá dẫn đến gân sáng, gân chết, gân biến dạng… như virus Y hại cây thuốc lá tạo gân sáng, virus Y hại một số giống khoai tây (tạo gân biến dạng)

- Khảm lá, lùn cây: Là hiện tượng khảm lá kèm theo cây lùn như Maize mosaic dwarf virus hay khảm sóc lá (Maize strerk trip mosaic virus) ở ngô, lúa, và các cây đơn tử diệp

- Xoăn, cuốn lá: Biến dạng lá như xoăn lá cà chua, cuốn lá khoai tây, xoăn lá cây ớt, hồ tiêu

- Biến màu và biến vàng: Là những triệu chứng gây biến vàng (ở lúa), gây hoá xanh (ở cam, chanh)

19

- Lùn bụi, tàn lụi: Là hiện tượng khá phổ biến như lùn bụi ở cây lạc, cây chuối rụt, cây cam bị bệnh tritera virus Vết chết ở thân cây, vết lõm thân như hiện tượng sưng cành táo, vết lõm thân cây cam, chanh

- Biến dạng củ, quả: Như ở táo, mận, nho bị nhiễm virus, quả cà chua bị đốm héo, củ khoai tây ở cây bị bệnh vàng lùn

Các triệu chứng bệnh trên còn phụ thuộc vào giống cây kí chủ, điều kiện môi trường và chủng loại virus gây bệnh mà có sự biến đổi Cùng một loại virus mà ở ba nhóm chủng khác nhau có thể thể hiện thành nhiều nhóm triệu chứng khác nhau

Bên cạnh đó các triệu chứng bệnh này không mang tính đặc thù, ví dụ như virus bệnh đốm vòng thì vết bệnh cũng tương tự như bệnh đốm do một số loài nấm gây nên Do đó bệnh virus không chỉ khó phát hiện khi mới chớm bị, mà khi bị nặng và có biểu hiện bệnh ra bên ngoài thì cũng rất dễ nhầm với bệnh do bệnh sinh lí, bệnh nấm, hay một số tác nhân khác gây ra

Tóm lại virus gây bệnh hại ở thực vật có một số đặc điểm sau:

Cây bị bệnh virus hiện nay thì không thể chữa được mà chỉ có thể làm ức chế sự sinh sản của virus trong cây

Bệnh virus gây thiệt hại lớn cho người trồng Đối với những cây ngắn ngày virus gây thiệt hại nhanh chóng Ví dụ ở nước ta hiện nay, bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá

ở cây lúa do virus gây ra và lan truyền nhờ rầy nâu đang bùng phát, gây hậu quả nặng

nề cho bà con vùng đồng bằng Sông Cửu Long Nhưng thiệt hại nặng nề hơn cả là virus không làm cho cây trồng bị chết ngay khi còn nhỏ mà làm thoái hoá, giảm sức sống, dần dần dẫn đến tàn lụi sau khi người trồng đã đầu tư rất nhiều vào việc chăm sóc và nuôi dưỡng cây Ví dụ ở Đà Lạt, có nhiều gia đình trồng địa lan đã mất 70%

đến 100% chậu địa lan đang trong giai đoạn có hoa

Bệnh virus tồn tại lâu, khó phát hiện và triệu chứng bên ngoài không đặc thù dễ gây nhầm lẫn Việc chuNn đoán bệnh thì phức tạp, đòi hỏi kĩ thuật cao Biểu hiện bên ngoài của cây bị bệnh virus có chu kì biến đổi theo chu kì phát triển của virus, theo tác động của yếu tố môi trường, đặc điểm sinh lí của cây chủ Do đó những biểu hiện bệnh bên ngoài của cây cũng thay đổi gây nhầm lẫn cho người trồng Và đến khi cây chủ không còn khả năng phục hồi theo chu kì bệnh thì cây sẽ hoàn toàn tàn lụi Ví dụ bệnh virus hại địa lan tại Đà Lạt, trong điều kiện mùa khô, nhiệt độ cao diễn biến bệnh virus chậm chạp, nhưng vào mùa mưa lại bùng phát

2.6 Virus hại địa lan

Những triệu trứng bệnh virus đầu tiên được miêu tả vào năm 1943 trước khi Ivanopski phát hiện ra sự tồn tại của thế giới virus Virus thực vật gây hại trên rất nhiều loại cây trồng, có thể thấy trong tự nhiên đa số cây đều bị nhiễm virus Ở nước ta mà đặc biệt ở Đà lạt, trong những năm gần đây cùng với sự gia tăng về nhu cầu và qui mô trồng lan thì bệnh virus hại lan cũng bùng phát và đã gây ra nhiều thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người trồng lan

Theo ước tính thì đến nay có khoảng 25 loài virus hại lan Những triệu chứng biểu hiện bệnh virus gây hại trên lan rất đa dạng và không theo qui tắc nào cả Đa số virus thực vật gây vàng, chết mô hay hoại mô (thối nhũn) và biểu hiện ban đầu của

20

virus nhiều khi giống với bệnh sinh lí Ví dụ: Bệnh trên địa lan do Cymbidium Mosaie

Virus gây ra, ban đầu giống với biểu hiện khi bón quá nhiều urê cho cây

Trong họ lan thì địa lan là cây đặc thù của xứ lạnh và được trồng khá lâu ở Đà lạt và có giá trị kinh tế cao Ngày nay, dưới sự phát triển của kĩ thuật nuôi cấy mô, việc mở rộng qui mô sản xuất lan đang gặp nhiều thuận lợi, bên cạnh đó thì việc lây lan bệnh virus cũng đang là nguy cơ số một cho người trồng lan nếu cây lan không sạch bệnh virus

Trong số những loài virus hại địa lan hiện nay thì tại Đà Lạt có một số loài gây

hại chủ yếu: Cymbidium Mosaic Virus (CyMV), Tobaco Mosaic Virus (TMV),

Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), Cybidium Ringspot Virus (CyRV), Odotoglosum

Khi bệnh nặng thì những chấm đen ban đầu phát triển trên cả phần bẹ lá, toàn bộ lá khô đi nhanh chóng và gây ra hiện tượng khô xám giả hành

Trên những cây lan nhiều năm tuổi, trong cùng một chậu thì tất cả giả hành, chồi non và phát hoa đều bị bệnh

CyMV ngoài tác động làm khô lá thì còn gây thối theo đám từ gân lá ra ngoài mép lá

2.6.2 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Tobaco Mosaic Virus orchid trên

cây địa lan

TMV orchid theo dòng vận chuyển vật chất lây lan khắp hệ thống cây trồng và gây ra hiện tượng khảm lá, lùn cây, cây còi cọc

Vết bệnh thường xuất hiện ở phần lá, ban đầu trên lá non xuất hiện một vài

đốm vàng xanh, sau đó các đốm xuất hiện ngày càng nhiều và gây hoại lá

Với các lá bị nhiễm nhẹ, phiến lá nhỏ hẹp và mặt lá sần sùi

Đặc điểm của vết bệnh là các tế bào biểu bì trên phần sáng của vết bệnh nhỏ

hẹp, xếp sít nhau, ở phần xanh lam của vết bệnh tế bào biểu bì lớn hơn bình thường

2.6.3 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Tomato Spotted Wilt Virus trên cây

địa lan

Cây nhiễm virus TSWV có biểu hiện bệnh rõ rệt ở phần hoa, trên cả nụ non và hoa đã nở, nhưng chủ yếu là hại ở phần nụ hoa Các vết bệnh thường to và có màu

đen

21

2.6.4 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Cybidium Ringspot Virus (CyRV)

trên cây địa lan

Phần lá trên cây bị bệnh do virus CyRV thường có nhiều sọc vàng nhạt phân biệt rõ với cùng xanh của phiến lá Cây bị bệnh nặng thì các vết bệnh liên kết lại với nhau làm cho cây bị vàng, các lá xếp sít với nhau và dựng thẳng đứng

Bệnh thường xuất hiện ở cây con 6 tháng tuổi với bộ lá dày có màu vàng nhạt Trên cây lớn thì bệnh khiến cho phát hoa thấp ngắn, tuy có nụ hoa nhưng lại không nở được

2.7 Một số biện pháp đã được áp dụng để có cây sạch bệnh virus

Ngày nay, việc tạo ra các cây giống sạch bệnh để cung cấp cho người trồng là vô cùng quan trọng và cần thiết Hiện nay chỉ có hai phương pháp được sử dụng để có cây trồng sạch bệnh là cây gieo từ hạt không bị tổn thương và phương pháp phục tráng giống bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

2.7.1 Về phương pháp gieo hạt

Phương pháp nhân giống bằng hạt hiện nay là phương pháp nhân giống thường

được sử dụng cho lan Đây là phương pháp tạo ra được số lượng lớn các cây con và

chủ yếu áp dụng với những cây mà thời gian tạo cây con bằng phương pháp nhân giống vô tính là rất lâu và khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên Bên cạnh đó để nâng cao tỉ lệ hạt nảy mầm cho những cây có thể nảy mầm trong điều kiện tự nhiên như lan, người ta gieo hạt trong điều kiện phòng thí nghiệm

Vấn đề quan trọng nhất trong phương pháp này là tìm ra môi trường gieo hạt tối ưu để rút ngắn thời gian và tăng tỉ lệ hạt nảy mầm

2.7.2 Về phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Đây là một trong những phương thức nuôi cấy mô trong phòng thí nghiệm

(nhân giống in- vitro) Nhân giống in- vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, các hormone tăng trưởng, carbon, và một số chất bổ trợ khác Kĩ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô như lá, thân hoặc rễ

2.7.3 Một số biện pháp bổ trợ khác 2.7.3.1 Phương pháp nhiệt độ

Thông thường, để ức chế sự tái bản của virus thì các mẫu thực vật được xử lí với nhiệt độ ở 30 – 37 oC trong thời gian từ 10 - 14 ngày hay ở 40 – 55 oC trong 5 - 10 phút (Nguyễn Văn Tỵ, 2002)

Tuỳ vào loại mẫu cấy, kích thước mẫu cấy mà có thời gian và nhiệt độ xử lí thích hợp Sau đây là một số thí nghiệm đã tiến hành của nhiều tác giả với mục đích

ức chế sự nhân bản của virus bằng nhiệt độ là:

Để ức chế virus PVY - Potato Virus Y trên cây khoai tây, năm 1956 Thomson,

năm 1998 Leonhardt và cộng sự, tiến hành xử lí mẫu ở 35 – 38 oC trong 30 - 40 ngày

Trong giai đầu của quá trình tìm kiếm, các nhà khoa học đã tìm thấy một số hoạt chất như: Iot deoxyuridin, 2 - thiouracil,… Đây là những chất đồng dạng với purin, pirimidin Những chất này có tác dụng làm rối loạn sự tổng hợp bình thường của các axit nucleic của virus Bên cạnh đó những hoạt chất được tìm thấy trong thời gian này tuy có tác dụng ức chế tác động của virus nhưng đồng thời cũng gây độc cho tế bào

Hợp chất được sử dụng sớm nhất trong là 2 – thiouracil, đựơc tìm ra vào năm 1952 do hai nhà khoa học là Commoner và Mercer Từ lâu người ta đã biết đa số virus có vật chất di truyền chứa uracil là một phần của acid nucleic Do đó Commoner và Mercer đã ức chế sự tái bản của virus trong cây thuốc lá bằng cách sử dụng 2 - thiouracil

Vào năm 1953, Jeener và Rosseels nhờ việc sử dụng đồng vị của sulfua (S35)của 2 - thiouraci và chứng minh được rằng S35 đã tham gia vào acid nucleic của virus Sau đó hàng loạt những chất hoá học khác thuộc nhóm này được nghiên cứu Một số chất chất khác như 5- Fluorouracil (Heidelberger và cộng sự, 1957), 5 - Chlorouracil, Azaguanin (Matthews, 1953),…

8 - Azaguanin là một hợp chất không có trong tự nhiên và được tổng hợp do Matthews vào năm 1953 Matthews đã sử dụng 8 - Azaguanin trong thí nghiệm ức

chế sự nhân bản của virus CMV (Cucumber Mosaic Virus) và virus TMV (Tobaco

MosaicVirus)

Và thực tế là việc sử dụng 2 - thiouracil và một số chất hoá học khác thời kì này đều không hiệu quả (Tam, 1959) Những chất này không chỉ ức chế sự tái bản của virus mà đồng thời ức chế sự sinh trưởng và thậm chí gây chết đối với tế bào Nhưng dù sao, 2 - thiouracil khi sử dụng ở nồng độ phù hợp cũng thu được một số thành công trong việc ức chế được sự tái bản của virus (Holmes,1955)

Ngày nay, ribazole là một hóa chất do con người tổng hợp được sử dụng rộng rãi trong ức chế virus ở động vật và cả thực vật mà ít gây ảnh hưởng xấu lên tế bào vật chủ nhất

Ribazole là hợp chất thuộc nhóm kháng chuyển hoá nucleotide của virus do đó có tác dụng ức chế sự nhân bản của virus trong tế bào

Ribazole có công thức hoá học là C18H12N4O5 và cấu tạo hoá học như sau:

Vào năm 1972 Sidwell đã chứng minh rằng ribazole có thể ức chế hoạt động của một số loài virus động vật mà ít gây độc cho tế bào

Từ đó cho đến nay, ribazole đã đựơc chứng minh là không chỉ ức chế hoạt

động của rất nhiều loại virus động vật mà còn có tác dụng với cả virus thực vật Theo

Simpkins và cộng sự (1981), theo Vicente De Fazio (1987), Chen và Sherwood (1991) và gần đây là Fletcher cùng cộng sự (1998) đã cho thấy ribazole có tác dụng

ức chế virus thực vật nhân bản

Việc ứng dụng ribazole trong nuôi cấy in- vitro để ức chế hoạt động của virus thực vật trong việc làm sạch bệnh virus được bắt đầu từ những năm 1980 và đã được áp dụng cho một số đối tượng thực vật Đa số virus thực vật có vật chất di truyền là ARN, một số ít còn lại có vật chất di truyền là ADN Cả ADN và ARN đều có cấu tạo từ các axit nucleotic Mỗi nucleotid đều gồm có 3 phần là nhóm photphat, phân tử

đường 5 carbon và Bazơ nitơ Có 5 loại bazơ nitơ là adenin, guanin, xitozin, timin,

uraxin Trong đó ARN có 4 loại là adenin, uraxin, guanin, xitozin Còn ADN có 4 loại là adenin, timin, guanin, xitozin

Ribazole có cấu tạo và tính chất hoá học tương tự cả adenosin lẫn guanosin Bên cạnh đó ribazole có thể hoạt động độc lập và tuần hoàn và đó là nguyên nhân mà ribazole tham gia đồng hoá vào ARN và ADN của virus Từ đó ribazole có một số tác

Cuối cùng ribazole có thể cạnh tranh với Guanosin triphotphat, có tác dụng ức chế hoạt động gen của virus thực vật

Ribazole đã được áp dụng với rất nhiều cây trồng như khoai tây, thuốc lá,… và mỗi loại cây trồng thích hợp với những nồng độ ribazole khác nhau

24

Ví dụ như đối với cây Allium Sativum L thì nồng độ tối thích của ribazole

trong các thí nghiệm này là 205 µm (Hector Loszoya và Saldana; William O Dowson; T Murashige, 2006)

Đối với cây Oxalic Tuberosa Molina, Ullucus Tuberosus Caldas, Arraccia

Xanthorrhiza, thì nồng độ ribazole tối ưu là 50 mg/l môi trường nuôi cấy (Fletcher, 2001)

Đối với cây khoai tây, nồng độ ribazole được sử dụng trong khoảng 20- 30

mg/l môi trường MS có bổ sung kinetin, NAA và GA3

Khi sử dụng ribazole trên cây chuối thì nồng độ ribazole là 50 mg/ l nhưng khi

sử dụng cho Nicotiniana Rustica thì nồng độ ribazole lại cao hơn là 100 mg/ l môi

trường nuôi cấy

3.Sơ lược về lịch sử nghiên cứu, đặc điểm chung và phân loại về họ cúc 3.1.Tình hình sản xuất hoa cúc

3.1.1 Trên thế giới

Trong ngành sản xuất hoa toàn cầu, hoa cúc là loài quan trọng thứ hai sau hoa hồng Cúc còn được xem như là một trong những loài hoa trang trí được ưa chuộng nhất trên toàn thế giới

Ở Nhật Bản, hoa cúc là quốc hoa từ năm 910 (L.Naeve, và D Nelson, 2005), nên ngành sản xuất hoa cúc đã mang về lợi nhuận tăng hơn hai lần, chỉ trong vài thập niên gần đây, nhờ áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật, cũng như do nhu cầu thưởng thức cuộc sống của người dân tăng nhanh Hoa cúc ở Nhật Bản chiếm đến 35% tổng sản phNm hoa cắt cành trong nước (Boase và cs, 1997)

Trên thế giới, hàng năm, Nhật Bản cũng là quốc gia sản xuất hoa cúc nhiều nhất, với 2 tỉ cành, tiếp theo là Hà Lan với 800 triệu; Colombia 600 triệu; Italia: 500 triệu; Hoa Kì:300 triệu (Boase và cs, 1997) Ở nước Anh, hoa cúc là loại hoa cắt cành quan trọng đứng thứ hai trên thị trường (Flowers and Plants Association, 2001)

Tại Nhật Bản, hoa cúc cắt cành được sử dụng khá phổ biến: 40% được dùng làm quà tặng; 25% được dùng để trang trí tại các khách sạn hay trong các lễ hội; 25%

được dùng để trang trí trong gia đình và cúng theo đạo Phật; và 10% phục vụ trong

việc giảng dạy nghiên cứu (Jaime, 2003)

Cải cúc (C.coronarium L.) được trồng rất phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc và

vùng Đông Nam Á, như một loại rau ăn hàng ngày khá phổ biến (Oka và cs., 1999) Một số loài cúc khác có chứa một hàm lượng tinh dầu đáng kể, nên một số loài được trồng để khai thác tinh dầu (Schwinn và cs., 1994)

3.1.2 Tại Việt Nam

Ở nước ta, có nhiều loài cây dại thuộc họ cúc mọc ở nhiều nơi Một số loài

được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền, ví dụ như bồ công anh (Lactuca laciniata

L.) Hoa cúc làm cảnh được đưa vào trồng ở nước ta vào khoảng từ thế kỉ XV đến đầu thế kỉ XVI Lúc đó chủ yếu dùng làm cảnh Mãi đến sau này, cúc mới được trồng như một loại cây thương mại Ở nước ta, Hà Nội là nơi có diện tích trồng hoa cúc nhiều nhất, với diện tích 450 ha, sau đó là Thành Phố Hồ Chí Minh (370 ha) Đà Lạt là vùng

Diện tích trồng hoa cúc ở Đà Lạt đã tăng nhanh trong những năm gần đây Diện tích trồng hoa cúc chiếm đến 40-50% diện tích trồng hoa nói chung Trong việc trồng hoa cúc, bà con nông dân đã áp dụng nhiều biện pháp kĩ thuật, như dùng hệ thống đèn chiếu sáng, hệ thống tưới phun sương, nhà kính… Đa số hoa cúc ở Đà Lạt được trồng với mục đích cắt cành Mỗi năm, Đà Lạt cung cấp cho thị trường từ 10-15 triệu cành

Tại Đà Lạt, hiện có khoảng 70 giống, được du nhập chủ yếu ở Hà Lan, theo nhiều con đường khác nhau: chính thức và không chính thức Do đó, việc xác định tên thương phNm và chủng loại cho từng chủng loại cúc là rất khó khăn

3.2 Đặc điểm sinh học họ cúc (Asteraceae hay Compositae) : 3.2.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại

Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978, họ cúc thuộc: -Giới thực vật

-Ngành Magnoliophyta (Angiospermae) - Ngọc Lan (hạt kín) -Lớp Magnoliopsida (Dicotyledonea) - Ngọc Lan (hai lá mầm) -Bộ Asterales (cúc)

Bộ cúc có một họ duy nhất là họ cúc (Asteraceae hay Compositae) được xem là họ lớn nhất của ngành hạt kín và giới thực vật nói chung Bao gồm gần 1000 chi và hơn 20 000 loài, có những chi có tới 1000 loài Họ cúc phân bố trên khắp nơi trên Trái Đất, sống được trong nhiều điều kiện khí hậu, môi trường, đất đai khác nhau Dạng sống chủ yếu là thân thảo, cây bụi, hiếm khi thân gỗ, nhưng thân gỗ thấp bé (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978; H.T.Sản và P.N.Hồng, 1986)

(Asteroideae=Tubiliflorae) và thìa lìa (Cichorioideae=Liguliflorae)

Phân họ hoa ống có đặc điểm là tất cả hoa trong cụm hoa đầu tiên hình ống (ống phễu, ống sợi, ống hình chuông…), hoặc hoa hai môi, hoặc hoa có hoa hình ống

ở giữa và hoa thìa lìa giả xung quanh Trong phân họ hoa ống có gần 740 chi, và rất

nhiều loài với các cây quen thuộc như là: ngãi cứu (Artemisia vulgaris L var.indica

(Willd.) DC.), thanh hao (Artemisia carvifloria Wall.), nhọ nồi (Eclipta prostrata L.)

thược dược (Dahila pinnata Cav.)…

Trong đó, chi Chrysanthemum được trồng phổ biến như một loài hoa trồng chậu hay hoa cắt cành Hoa cúc là một loài hoa cắt cành phổ biến trên toàn thế giới, nó đa dạng về các thứ và có hàng ngàn kiểu dáng khác nhau (Cockshull, 1985) Ngoài ra một số loài khác trong chi này còn được dùng làm rau ăn, làm thuốc an thần, thuốc

(Lactuca sativa L.), rau diếp xoăn (Cichorium endivia L.), bồ công anh (Lactuca

laciniata L.) (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978)

3.2.2.Đặc điểm thực vật học

Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978; H.T.Sản và P.N.Hồng, 1986; N.Q Trạch và Đ.V.Đông, 2002 thì cúc có các đặc điểm sau:

Rễ - Cúc có hệ rễ chùm, mọc cạn, theo chiều ngang, đâm sâu khoảng 10-20 cm rễ

cúc có kích thước khá đều nhau, với số lượng rễ lớn, nên khả năng hút nước và chất dinh dướng rất mạnh Do cúc được nhân giống bằng phương pháp vô tính, nên rễ mọc ngang từ các mấu thân ở gần mặt đất

Thân - Thân hoa cúc là thân thảo nhỏ, nhiều đốt, mọng nước, giòn, dễ gãy Trên thân

non một số loài có phủ một lớp lông tơ Một số loài có dạng thân bò Chiều cao thân tuỳ loài Nhưng đa số các giống nhập có thân to, thẳng, giòn Còn các giống nội địa có thân nhỏ, mảnh, cong

Lá - Lá cúc thuộc loại lá đơn, không có lá kèm, mọc so le Bản lá có xẻ thuỳ hình

lông chim Phiến lá mỏng, mặt dưới có phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn Gân lá hình mạng Mỗi cây có khoảng 30 – 50 lá

Hoa, quả - Hoa cúc về cơ bản là hoa lưỡng tính Hoa cúc có nhiều màu sắc khác nhau,

thích nghi với thụ phấn nhờ sâu bọ Hoa nhỏ, sít nhau và luôn luôn tập hợp thành cụm hoa đầu, để một sâu bọ thụ phấn được cho nhiều hoa cùng một lúc Đế hoa lồi lên Hoa ở giữa là hoa hình ống, hoa ở ngoài là hoa thìa lìa giả

Ở cúc, quả là quả bế Chỉ có một hạt mầm nằm trong khoang của quả và đôi khi dính

với vỏ quả Vỏ hạt rất mỏng, phôi lớn và thẳng không có nội nhũ Quả phát tán nhờ gió và động vật

27

Hình 1.1: Các dạng hoa cúc

(Nguồn:RHS A-Z Encyclopedia of Garden Plants (c) DK Images)

3.2.3.Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Khí hậu - Đa số hoa cúc thích hợp với điều kiện khí hậu ôn hoà, mát mẻ, lượng mưa

đầy đủ, nhất là những hoa được nhập từ vùng ôn đới Với nhiệt độ trên 250C, cúc sinh trưởng và phát triển kém (L.Naeve, và D Nelson, 2005)

Đất đai - Cúc ít đòi hỏi về điều kiện đất đai Thích hợp với đất acid nhẹ, pH khoảng

6.0 - 6.5 Nhìn chung, cúc sẽ phát triển tốt trên đất có độ Nm tốt, thoáng khí, giàu chất hữu cơ, đặc biệt là có phân chuồng Trước khi trồng, cần làm đất tốt, cày sâu 20-40 cm để đảm bảo độ thoáng khí và bón lót đầy đủ phân hữu cơ (M.N Dana và B R Lerner, 1996; M.Top và B Tatura, 2002; L.Naeve, và D Nelson, 2005)

Phân bón - Cúc là cây đòi hỏi một lượng phân bón khá lớn, vì vậy, cần bón 2 lần

NPK, với tỷ lệ 10:10:10 Mỗi lần bón khoảng 25 kg/ 100m2 Tốt hơn là bón lót trong giai đoạn chuNn bị đất một lượng phân hữu cơ (M.N Dana và B.R.Lerner, 1996; M.Top và B Tatura, 2002)

Cần chú ý không bón phân để cây bước vào giai đoạn ra hoa (L.Naeve, và D Nelson, 2005)

Nước tưới - Cúc chỉ có thể sống sót trong thời gian khô hạn ngắn, nếu khô hạn kéo

dài sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây Vì vậy, tưới nước rất quan trọng

đối với cúc, nhất là trong mùa khô (L.Naeve, và D Nelson, 2005)

Cần tưới một cách đều đặn và kỹ lưỡng, đảm bảo nước phải thấm sâu xuống

đất ít nhất 12-15cm Cần chú ý tránh làm tổn thương cây do những tia nước mạnh quá

Những tổn thương này là nguyên nhân để các virus xâm nhập, các vi khuNn và nấm phát triển (M.N Dana và B R Lerner, 1996)

Sâu bệnh hại - Một số côn trùng gây hại trên cúc thường xuyên là rệp muội, sâu vẽ

bùa, nhện…Các bệnh thường gặp là: đốm lá, thối thân rễ, mốc sương…(M.N Dana và B R Lerner, 1996; L.Naeve, và D Nelson, 2005)

Trong trường hợp sâu hại không nhiều lắm thì không cần thiết phải sử dụng thuốc hoá học Nên áp dụng biện pháp phòng ngừa tổng hợp, bằng thiên địch, bằng bẫy côn trùng… (M.N Dana và B R Lerner, 1996)

28

4 Virus và phương pháp ELISA

Virus rất nhỏ bé, chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử Chúng chưa có cấu trúc tế bào nên bắt buộc phải kí sinh nội bào trên cơ thể một sinh vật khác (vi khuNn, nấm, động vật, thực vật) Chúng chỉ có cấu tạo bởi một vỏ protein bao bọc bên ngoài một lõi acid nucleic Chúng có đầy đủ các hoạt động sống như di truyền, biến dị, tăng trưởng, sinh sản truyền nhiễm… mặc dù các hoạt động này đều phải gắn liền với tế bào vật chủ

Virus thực vật đã được phát hiện cách đây trên một thế kỷ và thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà sinh học Ngành nông nghiệp hết sức lúng túng trước các bệnh nghiêm trọng do virus gây nên vì cho đến nay vẫn chưa có thuốc phòng trừ đặc hiệu (bệnh khảm thuốc lá, bệnh xoăn lá cà chua, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá ở lúa…)

Cây bị bệnh virus có thể tàn lụi, chết Một số bộ phận của cây như thân, hoa, củ, quả, lá bị hủy hoại, cây phát triển kém dẫn tới năng suất giảm, chất lượng nông sản về dinh dưỡng, cảm quan kém Một số trường hợp bệnh hại cây có thể sinh ra những độc tố gây ảnh hưởng xấu, trực tiếp đến sức khoẻ và đời sống của con người và động vật

Do tác hại của virus vô cùng to lớn nên cần có những biện pháp chuNn đoán và phát hiện sớm để có biện pháp sử lý cho thích hợp Hiện nay có nhiều phương pháp chuNn đoán bệnh virus thực vật như phương pháp huyết thanh (trong đó phương pháp DAS-ELISA là phương pháp huyết thanh hiện đại nhất), phương pháp cây chỉ thị, phương pháp chuNn đoán bằng hiển vi điện tử, chuNn đoán phân tử (RT-PCR)

Phương pháp ELISA tới nay vẫn là phương pháp phát hiện virus hiệu quả, nhanh chóng được sử dụng rộng rãi Để thực hiện được phương pháp này cần phải tách được protein của virus thực vật, bằng cách nghiền mẫu thực vật có chứa virus trong dung dịch đệm nhằm giữ pH không đổi ở dịch chiết và thực hiện quy trình làm tinh khiết virus

ELISA là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để xác định kháng thể đặc hiệu chống virus ở thời điểm xuất hiện triệu chứng hoặc ngay sau khi xuất hiện triệu chứng Kỹ thuật cho phép xác định kháng thể ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 µg/ ml) Nguyên lý phương pháp này là kháng thể được đánh dấu bằng cách gắn với enzym Khi cơ chất thích hợp enzym sẽ phân giải, cơ chất cho sản phNm có màu Đo cường

độ màu để biết mức độ phản ứng xảy ra

Kỹ thuật ELISA được dùng nhiều là kỹ thuật “bánh kẹp”(sandwich), theo đó kháng nguyên của cây bệnh (virus) được phản ứng với kháng thể sơ cấp đã biết, được xác định khi cho thêm kháng thể thứ cấp có gắn enzym

Các bước thực hiện như sau:

- Cố định kháng thể sơ cấp (đã được biết) lên thành giếng

- Nạp dịch virus (kháng nguyên) vào giếng rồi ủ Nếu kháng nguyên phù hợp sẽ tạo phản ứng với kháng thể sơ cấp Rửa nhẹ để loại bỏ kháng nguyên thừa

- Thêm kháng thể thứ cấp có gắn enzym Rửa nhẹ để loại bỏ kháng thể thừa

29

- Thêm cơ chất thích hợp với enzym Cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên trong dịch chiết virus

4.1 Bệnh khảm thuốc lá TMV (tobacco mosaic virus)

TMV là bệnh virus phổ biến ở các vùng trồng thuốc lá trên thế giới Ở Việt Nam bệnh gây hại nặng trên vùng trồng thuốc lá các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc bộ Cây bị nhiễm bệnh có thể giảm năng suất 35%, chất lượng thuốc lá cũng giảm mạnh do hàm lượng nicotine giảm, lá dễ bị gãy nát

Virus có khả năng truyền bệnh cao Bệnh truyền chủ yếu qua con đường tiếp xúc cơ học, các vết thương do xây xát Virus vận chuyển trong cây theo hệ thống mạch dẫn

Bệnh Khảm thuốc lá có khả năng gây hại cho nhiều cây khác ngoài thuốc lá như cây ớt, cà chua, địa lan, hoa cúc

4.2 Bệnh khảm thuốc lá trên địa lan

Cây bệnh nhiễm hệ thống, gây hiện tượng khảm lún cây, cây còi cọc, xuất hiện các vết chết hoại ở phần lá, trên lá non xuất hiện các lá xanh, vàng phiến lá nhỏ hẹp, ,mặt lá sầm sùi Các tế bào biểu bì trên phần sáng của vết bệnh nhỏ hẹp, xếp sít nhau, ở phần xanh lam của vết bệnh tế bào biểu bì lớn hơn

4.3 Bệnh khảm thuốc lá trên cúc

Trên lá non xuất hiện các lá xanh, vàng xen kẽ nhau, gân lá nhợt nhạt, lá nỏ hẹp, cây chỉ bằng ½ cây khỏe, cây mất triệu chứng khi nhiệt độ giảm xuống 110C Cây nhiễm bệnh hệ thống

Gây bệnh cho Cúc, Lan bao gồm nhiều yếu tố và nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau Trong báo cáo này chúng tôi chỉ tiến hành test và đánh giá tác hại của virus TMV Bởi vì, TMV là một virus phổ rộng, đồng thới không phải là virus gây hại chính cho các đối tượng trên Do đó nếu các đối tượng trên nhiễm TMV thì xác suất nhiễm các bệnh virus khác rất cao

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu: 2.2.1 Vật liệu ban đầu

Đặc thù của đề tài là nghiên cứu bảo tồn nguồn gen các giống cúc và hoa lan

cắt cành hiện đang sản xuất tại Đà Lạt là sự đa dạng về giống, riêng giống cúc nhập vào Đà lạt đã có hơn 70 giống Chính vì vậy, trong phương pháp thực hiện nghiên cứu chúng tôi chỉ nêu những phương pháp chung và trên một số giống làm chuNn, các giống còn lại đều tuân thủ theo các bước sau đây:

a Thu thập mẫu

b Tách và nuôi cấy mô phân sinh

c Nhân nhanh protocorm (đối với địa lan), nhanh nhanh cây cúc in vitro d Chuyển protocorm và cây con sang môi trường xử lý virus

e Tách lại mô phân sinh f Nhân nhanh và test virus

2.2 Phương pháp nghiên cứu

A Phương pháp áp dụng trên đối tượng lan Cymbidium

Các thí nghiệm đã tiến hành sử dụng protocorm của ba giống địa lan sẵn có trong phòng thí nghiệm Ba giống đó là Trắng bệch, Tím hột, và Miretta xanh Cả ba gjống này đều cho hoa rất đẹp và các giống mà được trồng rộng rãi ở Đà Lạt

1 Môi trường nuôi cấy

Trong các thí nghiệm đã thực hiện với môi trường khoáng Knudson C, MS và 1/2MS có bổ sung thêm các chất khác là:

Vitamin: các vitamin là myo - inositol, acid nicotinic, pyridoxine HCl, Thiamin HCl Đây là các vitamin được sử dụng trong môi trường MS

Peptone được bổ sung với hàm lượng 2g/l Agar được bổ sung 8g/ l

Chất điều hòa sinh trưởng bổ sung là BA: 0.5 mg/ l

Đường saccharose với hàm lượng 30g/l

2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.1 Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp và sử dụng ribazole hổ trợ việc loại bỏ virus kết hợp với việc tách mô phân sinh đỉnh

31

Các protocorme hình thành sau khi qua bước nuôi cấy đỉnh dinh trưởng, chúng tôi tiếp tục bố trí nuôi cây trong các môi trường có hàm lượng khoáng MS, 1/2MS và môi trường Knudson C

Các thí nghiệm về tác động của của than hoạt tính, cytokinin (chọn BA), cytokinin/auxin (chọn BA và NAA) đều sử dụng môi trường khoáng cơ bản là MS Cách bố trí thí nghiệm như sau:

- Thí nghiệm ảnh hưởng của BA: Chúng tôi bố trí 5 nồng độ khác nhau: 0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2 mg/l

- Thí nghiệm ảnh hưởng phối hợp giửa BA và NAA: này được thực hiện bởi các protocorme nuôi cấy trong môi trường MS, có than hoạt tính là 1g/l, nồng độ BA là 1ml/l và có bổ sung thêm các nồng độ NAA từ 0 – 2mg/l

Chọn môi trường thích hợp từ các thí nghiệm trên để tiếp tục nghiên cứu tác

động của ribazole lên sinh trưởng của cây con Chúng tôi sử dụng ribazole trong các

thí nghiệm với các nồng độ 0 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l và 150 mg/l Dạng ribazole đã sử dụng là chế phNm của Getz Pharma

Các protocorm tái sinh trên môi trường đã xử lý ribazole, tiếp tục được cấy chuyền để theo dõi khả năng phục hồi và test virus Cây sạch bệnh tiếp tục được nhân lên để giữ giống cũng như chuyển ra khảo nghiệm ở vườn ươm

Các mẫu thí nghiệm trên được nuôi trong điều kiện phòng nuôi in- vitro với: Thời gian chiếu sáng: 10h/ ngày

Cường độ chiếu sáng: 45 micro mol m-2 s-1

Độ Nm trung bình: 75- 80 %

Nhiệt độ: 25- 27oC

Chỉ tiêu theo dõi:

Các chỉ tiêu được theo dõi là số mẫu cấy sống sót, số lượng protocorm mới phát sinh sau 60 ngày nuôi cấy Bên cạnh đó một số chỉ tiêu khác thường xuyên được theo dõi là thời gian bắt đầu phát sinh protocorm mới, màu sắc mẫu cấy Sau giai

đoạn xử lý, theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng của cây con (chiều cao, số lá, số rễ, trọng

lượng tươi sau ba tháng cấy chuyền…)

2.2 Nghiên cứu giá thể thích hợp cho cây lan con khi ra vườn ươm

Cây con sau khi rút khỏi môi trường in vitro cần rửa sạch agar bám vào rễ, nhúng rễ cây con với Mancozeb rồi mới trồng vào giá thể

Khay trồng: Khay kích thước 30 × 45 × 5cm

Với thí nghiệm giá thể: chúng tôi bố trí một số nghiệm thức sau: Ký hiệu loại

giá thể

Loại giá thể I

II

Dớn mút 3T

32

III IV V VI VII VIII

3T/dớn xay (1:1) Xơ dừa

Dớn xay/Xơ dừa (3/1) Dớn xay/Xơ dừa (2/1) Dớn xay/Xơ dừa (1/1) Dớn xay

Số lượng cây con/ khay: 100 cây

Độ Nm giá thể: 70 – 80% Độ Nm không khí: 90 – 95%

Nhiệt độ nuôi trồng: 20-25oC Ánh sáng: Độ che sáng > 70% Số lần tưới/ngày: 3-5 lần

Bón phân: N-P-K tỉ lệ 3:1:1 pha loãng có EC 1.0 ds/m phun mỗi tuần 2 lần (trừ tuần đầu tiên sau khi mới ra cây)

2.3 Nghiên cứu chế độ phân bón cho cây con giai đoạn ra vườn ươm

Cây con sau khi rút khỏi môi trường in vitro cần rửa sạch agar bám vào rễ, nhúng rễ cây con với Mancozeb rồi mới trồng vào giá thể Giá thể được chọn ra từ những kết quả nghiên cứu giá thể để bố trí thí nghiệm

Khay trồng: Khay kích thước 30 × 45 × 5cm Số lượng cây con/ khay: 100 cây

Độ Nm giá thể: 70 – 80% Độ Nm không khí: 90 – 95%

Nhiệt độ nuôi trồng: 20-25oC Ánh sáng: Độ che sáng > 70% Số lần tưới/ngày: 3-5 lần

Bón phân: N-P-K tỉ lệ 3:1:1 pha loãng có EC thay đổi từ 0; 0.5; 1.0 và 1.5ds/m phun mỗi tuần 2 lần (trừ tuần đầu tiên sau khi mới ra cây)

B Phương pháp áp dụng trên đối tượng hoa cúc

Với các giống cúc chúng tôi chọn các giống hoa cúc được trồng khá phổ biến ở

Đà Lạt farm hồng, pingpong vàng, nút vàng, nút tìm, tia muỗng vàng Các giống thu

thập còn lại đều theo một qui trình mẫu tương tự các giống nêu ra ở đây

Trong đề tài chúng tôi sử dụng vật liệu ban đầu là các đế hoa, được lấy từ các vườn sản xuất của bà con nông dân trong địa bàn thành phố Đà Lạt

Quy trình xử lý mẫu như sau:

33 - Chọn đế hoa từ cây trồng trên vườn

- Rửa bằng xà phòng và rửa lại bằng nước cất nhiều lần, đảm bảo sạch hết xà phòng

- Khử trùng mẫu bằng TTCA với nồng độ 15g/l, trong 10 phút Trong quá trình khử mẫu luôn lắc đều đặn, nhẹ nhàng để đảm bảo các mẫu được khử trùng đều

- Đưa vào điều kiện vô trùng để rửa lại nhiều lần bằng nước cất (4-5 lần) , trước

khi đưa vào nuôi cấy trong môi trường MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA đã chuNn bị sẵn

Đế hoa sau khi nuôi cấy 30 ngày, có thể tiếp tục cấy chuyền trong môi trường

nhân nhanh (MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA) để đảm bảo số lượng đỉnh chồi cần thiết cho thí nghiệm

34

Môi trường nuôi cấy

Môi trường để nuôi cấy là môi trường MS (Murashige – Skooge, 1962), bổ sung 30g/l đường, 8g/l agar, chất điều hoà sinh trưởng gồm có: 0.2mg/l IBA, 0.5mg/l BA; và được bổ sung Ribazole ở các nồng độ khác nhau

Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh về pH =5.8 bằng KOH (1N), hoặc HCL (1N) Môi trường nuôi cấy được đun cho hoà tan các thành phần trước khi khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1 atm trong 30 phút

Sau khi khử trùng, môi trường được đổ vào bao nilon 500ml, chứa 100ml môi trường Bao nilon cũng đã được hấp vô trùng trong autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1 atm trong 30 phút Quá trình đổ môi trường vào bao nilon được tiến hành trong tủ cấy ở

điều kiện vô trùng

Bảng 2.1 :Thành phần cơ bản của môi trường MS

35

Bảng 2.2 :Thành phần cơ bản của môi trường Knudson C (1946)

Ca(NO3)2 * 4 H2O 1000 mg KH2PO4 250 mg MgSO4 * 7 H2O 250 mg (NH4)2SO4 500 mg FeSO4 * 7 H2O 25 mg MnSO4 * 4 H2O 7.5 mg Sucrose 20 g Agar 12-15 g

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn Chọn mẫu cấy ban đầu (đế hoa) có kích thước tương đối đồng đều Mỗi bao nilon được cấy 9 mẫu, lặp lại 3 lần Sau khi cấy, các mẫu cấy được bố trí nuôi trong phòng cây, đảm bảo ánh sáng đồng

đều với thời gian chiếu sáng 16 giờ Nhiệt độ trong khoảng 18-250C

Phương pháp lấy chỉ tiêu và xử lý số liệu:

Sau thời gian nuôi cấy 30 ngày, chúng tôi tiến hành lấy số liệu gồm các chỉ tiêu về số chồi/cụm chồi; chiều cao chồi (tính từ gốc đến ngọn) để nhận xét về mức

độ sinh trưởng và phát triển của cây dưới ảnh hưởng của Ribazole

Số liệu được tính toán trên phần mềm EXCEL phiên bản 2003, của Microsoft Gồm có tính các số liệu trung bình trong mỗi nghiệm thức và dùng công cụ data analysis để phân tích số liệu bằng bảng ANOVA

Các thí nghiệm

- Ảnh hưởng của Ribazole lên sự sinh trưởng phát triển in vitro

Các cây in-vitro được nuôi cấy từ đế ban đầu, được dùng làm vật liệu cho thí nghiệm Từ các đỉnh chồi tách ra từ cây in-vitro, theo từng giống, sẽ được cấy vào các lô nghiệm thức khác nhau Trên mỗi giống, các lô thí nghiệm bao gồm:

Sau 30 ngày nuôi cấy, các cây sẽ được đo đạc các chỉ tiêu: số chồi/cụm, chiều cao chồi và tỷ lệ sống

Sự phục hồi của cây sau khi xử lý ribazole

Các cây sau khi đã xử lý ribazole, chúng tôi tiến hành tách đỉnh chồi, cấy chuyền lại trong môi trường nhân nhanh bình thường, để kiểm tra sự phục hồi của cúc sau khi xử lý ribazole

36

Do một số điều kiện khách quan, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự phục hồi sau của cây còn sống ở tất cả các nồng độ đối với ba giống (tia muỗng vàng, farm hồng và pingpong vàng); đối với hai giống còn lại (nút vàng và nút tím) chúng tôi kiểm tra

ở lô nghiệm thức R2 để so sánh với lô đối chứng

Các chỉ tiêu quan sát cũng bao gồm: số chồi/cụm, chiều cao chồi và tỷ lệ sống của mẫu cấy

Phương pháp test virus

- Đối tượng là các cây hoa địa lan, hoa cúc có triệu chứng nhiễm bệnh virus

TMV điển hình theo mô tả trên và các mẫu cây trong ống nghiệm được sử lý loại virus

- Thời gian:

Đợt 1: 5//2006 – 6/2006 Đợt 2: 9/2007

- Rửa mẫu sạch bằng nước
lau qua bằng cồn 700C
ngâm Javen (4%)

khoảng 5 phút (chú ý tránh để mẫu bị xây sát nhiều)
Rửa bằng nước cất vô

trùng 3 lần Dùng giấy thấm vô trùng thấm khô

- Cối sứ: ngâm Javen (4%) trong 5 phút
Rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần

Bước 2: Tách chiết

- Mẫu thực vật: Cân 2 g mẫu lá cho mỗi giống trước khi đem xử lý

- Nghiền mẫu trong cối sứ có chứa dung dịch đệm chiết (lượng đệm chiết tuỳ thuộc vào lượng mẫu)

* Cách pha đệm chiết : 1g mẫu : 0,5 ml dịch đệm chiết : 9,5 ml nước cất vô trùng

- Chiết lấy dịch nổi, bảo quản vào ở 2 -80C để dịch chiết lắng cặn Sau đó hút ra 2 ống eppendorf (1ml/ống)

- Votext
Ly tâm 4500vòng /phút trong 5’ ở nhiệt độ 60C

37

c.Test ELISA

Bước 1: Phủ kháng thể sơ cấp

- Đệm phủ (màu xanh) pha trong nước cất với tỷ lệ 1/5

- Kháng thể sơ cấp (Ab1) hòa trong đệm phủ với tỷ lệ 1/100 Vortex trước khi sử dụng

- Nạp vào mỗi giếng 100µl

- Đậy Microplate bằng màng film, tiến hành ủ hỗn hợp trên trong 2 giờ ở 370C - Rửa 3 lần bằng PBS – Tween được pha sẵn Quá trình rửa sẽ giúp loại bỏ

kháng thể thừa và thấm khô giếng bằng giấy thấm Bước 2: Nạp mẫu

+ Mẫu dịch chiết (M) được chuNn bị ở phần tách chiết virus

+ Chứng dương (+), chứng âm (-) được pha bằng nước cất vô trùng + Chứng trắng (0): Nước cất vô trùng

+ Đệm cơ chất (không màu): pha loãng theo tỷ lệ 1:19

Vortex trước khi sử dụng

- Tiến hành nạp mẫu vào các giếng trong Micrplates

- Ủ mẫu ở 2 –80C trong 12 h (giếng được đậy bằng màng film)

- Rửa mẫu: sau khi ủ đổ và rảy khô giếng Rửa 3 lần bằng PBS- Tween, 2 lần

đầu đổ rửa đổ ngay, lần 3 sau 3 phút mới đổ Sau mỗi lần đổ thấm khô bằng

giấy thấm

Bước 3: Phủ kháng thể thứ cấp

- Đệm cộng hợp (màu đỏ) được pha loãng trong nước cất với tỷ lệ 1/5

- Kháng thể thứ cấp (Ab2) pha loãng trong đệm cộng hợp với tỷ lệ 1/100 Vortex trước khi sử dụng

- Nạp vào mỗi giếng 100µl dung dich trên - Đậy màng film và ủ trong 2h ở 370C

- Rửa 3 lần bằng PBS – Tween được pha sẵn Quá trình rửa sẽ giúp loại bỏ kháng thể thừa và thấm khô giếng bằng giấy thấm

Bước 4: Nạp cơ chất

- Pha loãng 2ml đệm cơ chất trong 8ml nước cất tiệt trùng (tỷ lệ 1/5) - Dùng 2 viên cơ chất pha vào dung dịch đệm trên

- Nạp vào mỗi giếng 100µl hỗn hợp trên

- Đậy giếng bằng màng film và ủ ở 370C trong 30’ Bước 5: Đọc kết quả