Nghiên cứu biện pháp bảo tồn quỹ gen virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 dạng tươi ở - 86 độ C

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - TRẦN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP BẢO TỒN QUỸ GEN VIRUS VIÊM GAN VỊT NHƯỢC ĐỘC DH - EG - 2000 DẠNG TƯƠI Ở -860C CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Trần Thị Thu Hằng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin nói lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Bá Hiên - người Thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập hồn thành luận văn Đồng thời, xin bày tỏ biết on đến Thầy, Cô Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam cán phịng Thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành đề tài cách tốt Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn Cơ quan, người thân gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập thực đề tài nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Trần Thị Thu Hằng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan I Lời cảm ơn II Mục lục III Danh mục chữ viết tắt VII Danh mục bảng biểu VIII Danh mục hình X ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh viêm gan vịt 1.1.1 Tình hình bệnh viêm gan vịt giới Việt Nam 1.1.2 Đường xâm nhập cách lây lan 1.1.3 Cơ chế gây bệnh 1.1.4 Triệu chứng bệnh tích 1.1.5 Chẩn đốn 1.1.6 Biện pháp can thiệp phịng bệnh viêm gan vịt 1.2 Một số đặc tính sinh học virus gây bệnh viêm gan vịt 11 1.2.1 Hình thái, kích thước phân loại virus viêm gan vịt 11 1.2.2 Cấu trúc virus viêm gan vịt 11 1.2.3 Sức đề kháng 14 1.2.4 Đặc tính ni cấy 15 1.3 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt 17 1.3.1 Miễn dịch thụ động 18 1.3.2 Miễn dịch chủ động 19 1.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử 19 1.4.1 Phản ứng RT - PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) 1.4.2 19 Kỹ thuật điện di 21 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii Chương NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nội dung nghiên cứu 22 2.1.1 Kiểm tra số đặc tính sinh học chủng gốc virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 2.1.2 22 Giám định chủng gốc virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 RT - PCR 2.1.3 22 Nghiên cứu đánh giá khả kích thích đáp ứng miễn dịch chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 2.1.4 22 Nghiên cứu điều kiện bảo tồn virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 22 2.2 Nguyên liệu: 23 2.2.1 Chủng virus: 23 2.2.2 Phôi trứng 23 2.2.3 Động vật thí nghiệm 23 2.2.4 Dụng cụ hóa chất phịng thí nghiệm 23 2.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Phương pháp xác định khả thích ứng ổn định chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 2.4.2 24 Phương pháp xác định số ELD50 (liều gây chết 50% phôi) chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 2.4.3 24 Phương pháp xác định số EID50 (liều gây nhiễm 50% phôi) chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 2.4.4 25 Phương pháp giám định chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH EG - 2000 kỹ thuật RT - PCR 2.4.5 26 Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT - PCR điện di thạch agarose Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp 27 Page iv 2.4.6 Qui trình sản xuất hỗn dịch kháng nguyên từ chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 (vacxin) 27 2.4.7 Phương pháp kiểm tra tiêu vô trùng 28 2.4.8 Phương pháp kiểm tra tiêu an toàn 29 2.4.9 Kiểm tra tiêu hiệu lực khả đáp ứng miễn dịch hỗn dịch kháng nguyên phương pháp công cường độc 30 2.4.10 Kiểm tra hiệu lực hỗn dịch kháng nguyên phản ứng trung hịa phơi gà 30 2.4.11 Nghiên cứu điều kiện bảo tồn virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 33 2.4.12 Phương pháp xử lý số liệu 34 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết kiểm tra số đặc tính sinh học chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 sau thời gian bảo tồn năm -860C 3.1.1 Khả thích ứng ổn định chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 phôi gà sau thời gian bảo tồn 3.1.2 35 Xác định số ELD50 chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 3.1.3 35 37 Xác định số EID50 chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 39 3.2 Kết phản ứng RT - PCR 41 3.3 Kết kiểm tra vô trùng hỗn dịch kháng nguyên 42 3.4 Kết kiểm tra tiêu an toàn hỗn dịch kháng nguyên 43 3.5 Kết kiểm tra tiêu hiệu lực khả đáp ứng miễn dịch virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 3.6 44 Kết xác định khả đáp ứng miễn dịch vịt sau tiêm hỗn dịch kháng nguyên viêm gan vịt 3.7 48 Nghiên cứu điều kiện bảo tồn virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 50 Page v 3.7.1 Nghiên cứu chọn lọc mơi trường thích hợp để bảo quản virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 3.7.2 50 Nghiên cứu chọn lọc phương pháp thích hợp để bảo quản virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 3.7.3 51 Nghiên cứu xác định thời gian bảo quản hỗn dịch kháng nguyên virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 Kết luận 55 Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 61 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT cDNA complementary DNA BEI Binary Ethylenimine Bp Base pair (s) DNA Acid DeoxyriboNucleic DVH Duck Virus Hepatitis ĐVTH Đơn vị trung hòa E coli Escherichia coli EID50 50 percent Embryo Infectious Dose ELD50 50 percent Embryo Lethal Dose GOT Glutamate - Oxaloacetate - Transaminase GPT Glutamate - Pyruvat - Transaminase IRES Internal Ribosome Entry Site Kb Kilobase LD50 50 percent Lethal Dose Ml Mililit Mg Miligam Nm Nanomet ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction RNA Axít Ribonucleic RT - PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction UI Unit Interval UTR Untranslated Region Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC BẢNG BIỂU STT 2.1 Tên bảng Trang Thành phần phản ứng RT - PCR chu trình nhiệt nghiên cứu phân tử virus viêm gan vịt 3.1 26 Kết cấy truyền virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 phôi gà 3.2 35 Kết kiểm tra bệnh tích đại thể phơi sau gây nhiễm virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 3.3 36 Kết xác định số ELD50 chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 3.4 38 Kết xác định số EID50 chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 3.5 40 Kết kiểm tra vô trùng hỗn dịch kháng nguyên virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 3.6 43 Kết kiểm tra phòng thí nghiệm tiêu an tồn hỗn dịch kháng nguyên chế từ virus viêm gan vịt nhược độc DH EG - 2000 3.7 44 Kết xác định hiệu lực hỗn dịch kháng nguyên chế từ virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 phương pháp công cường độc 3.8 47 Kết kiểm tra hiệu lực hỗn dịch kháng nguyên phản ứng trung hịa phơi gà 3.9 48 Kết kiểm tra số ELD50 chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 sau thời gian bảo quản môi trường khác -860C Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 51 Page viii 3.10 Kết kiểm tra số ELD50 chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 sau thời gian bảo quản phương pháp khác -860C 3.11 52 Kết kiểm tra số EID50 virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 sau thời gian bảo quản khác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 53 Page ix Bảng 3.7 Kết xác định hiệu lực hỗn dịch kháng nguyên chế từ virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 phương pháp công cường độc Độ tuổi vịt Độ tuổi vịt tiêm Lần thí nghiệm Lơ hỗn dịch Số lượng cơng kháng vịt (con) cường độc nguyên (ngày) (ngày) Thí I Đối chứng Thí III nghiệm Đối chứng virus (LD50) Vị trí tiêm Tỷ lệ đến 15 ngày Số Số Số ốm chết sống (con) (con) (con) bảo hộ (%) 1–3 Dưới da 1 19 95 10 Thí nghiệm Nồng độ Kết theo dõi 20 nghiệm Đối chứng II Công cường độc Dưới da 10 10 0 Dưới da 0 20 100 10 Dưới da 10 10 20 Bắp 19 95 10 Bắp 9 10 20 15 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 100 Page 47 3.6 Kết xác định khả đáp ứng miễn dịch vịt sau tiêm hỗn dịch kháng nguyên viêm gan vịt Dựa vào bước làm phần 2.4.10, tiến hành độc lập phản ứng trung hịa phơi gà Kết thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết kiểm tra hiệu lực hỗn dịch kháng nguyên phản ứng trung hịa phơi gà Mẫu huyết Độ pha loãng huyết Hiệu giá vịt (sau tiêm kháng thể tuần) 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 + + + + + + + + + I 1/128 + + + + + + + + + + + + + + + + + II 1/128 + + + + + + + + + + + + + + + + + III 1/128 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + IV 1/128 + + + + + + + + + + Đối chứng 1/16 - Ghi chú: (+): phôi sống Liều virus trung hịa (ELD50) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 (-): phơi chết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 Qua bảng 3.8 ta thấy: - Mẫu huyết miễn dịch I sau tiêm hỗn dịch kháng nguyên: Các phôi sống sau 96 độ pha loãng 1/16, 1/32 1/64 Ở độ pha lỗng 1/128 có phơi sống phơi tiêm Ở độ pha lỗng 1/256 có phơi sống phơi tiêm Hiệu giá kháng thể 1/128, số đơn vị trung hòa 64.0000 - Mẫu huyết miễn dịch II sau tiêm hỗn dịch kháng nguyên: Các phôi sống sau 96 độ pha loãng 1/16, 1/32, 1/64 Ở độ pha loãng 1/128 1/256 có phơi sống phơi tiêm Hiệu giá kháng thể 1/128, số đơn vị trung hòa 64.0000 - Mẫu huyết miễn dịch III sau tiêm hỗn dịch kháng nguyên: Các phôi sống sau 96 độ pha loãng 1/16, 1/32, 1/64 Ở độ pha lỗng 1/128 có phôi sống phôi tiêm Ở độ pha lỗng 1/256 phơi chết Hiệu giá kháng thể 1/128, số đơn vị trung hòa 64.0000 - Mẫu huyết miễn dịch IV sau tiêm hỗn dịch kháng nguyên: Các phôi sống sau 96 độ pha loãng 1/16, 1/32 1/64 Ở độ pha lỗng 1/128 có phơi chết phơi tiêm Ở độ pha lỗng 1/256 có phôi chết phôi tiêm Hiệu giá kháng thể 1/128, số đơn vị trung hòa 64.0000 Kết phản ứng trung hòa thể bảng 3.8 do: mẫu huyết có hàm lượng kháng thể chống virus viêm gan vịt cao (lượng kháng thể trung hòa hết lượng virus cố định liều tiêm) sau tiêm cho phơi, theo dõi đến 96 khơng có phơi chết Nếu mẫu huyết có hàm lượng kháng thể chống virus viêm gan vịt thấp (lượng kháng thể khơng đủ để trung hịa hết lượng virus cố định) sau tiêm cho phơi, theo dõi đến 96 giờ, phôi chết với tỷ lệ định tùy thuộc vào độ pha loãng huyết sức chống chịu phơi Những mẫu huyết có hàm lượng kháng thể cao độ pha lỗng huyết để Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 đảm bảo trung hòa hết lượng virus cố định lớn Nếu mẫu huyết thí nghiệm ngày 21 số trung hòa từ 50 ĐVTH trở lên phản ứng trung hịa coi dương tính Dựa vào nêu chúng tơi kết luận mẫu huyết miễn dịch dương tính Điều chứng tỏ rằng, hiệu lực hỗn dịch kháng nguyên chế từ chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 bảo tồn nhiệt độ -860C ba năm cao, hàm lượng kháng thể có khả trung hịa hết hàm lượng virus cố định liều tiêm Như vậy, qua kết nghiên cứu khẳng định hỗn dịch kháng nguyên nhược độc viêm gan vịt chế từ chủng DH - EG - 2000 bảo quản dạng tươi -860C hồn tồn vơ trùng có độ an tồn hiệu lực cao 3.7 Nghiên cứu điều kiện bảo tồn virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 3.7.1 Nghiên cứu chọn lọc mơi trường thích hợp để bảo quản virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 Để chọn lọc môi trường bảo quản thích hợp, chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 bảo tồn năm -860C, sau hồn ngun chúng tơi bảo quản môi trường khác (môi trường nước trứng vịt, nước trứng gà, Glycerol 50%, tế bào xơ phôi vịt tế bào xơ phôi gà) Đối với môi trường Glycerol 50% sử dụng nước trứng gà bổ sung glycerol với tỷ lệ 1:1 đóng vào ampoul Với môi trường tế bào xơ phôi gà (vịt), tiến hành nuôi cấy tế bào xơ phôi gà (vịt) lớp Đến tế bào mọc kín đáy chai ni cấy virus gốc theo dõi đến bệnh tích tế bào đạt tỷ lệ 70% (thường từ 72 - 96 sau gây nhiễm) Thu tế bào, bảo quản -200C Sau 24 lấy giải đông Dùng máy lắc để làm vỡ tế bào, thu hỗn dịch đóng vào ampoul Bảo quản mẫu -860C 12 tháng, tiến hành kiểm tra số ELD50 mẫu virus bảo quản môi trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 Kết trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết kiểm tra số ELD50 chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 sau thời gian bảo quản môi trường khác -860C Môi trường Tế bào Tế bào xơ phôi xơ phôi gà vịt 10-4,20 10-5,22 10-4,79 10 -4,42 10 -4,18 10 -5,12 10 -4,63 10 -4,32 10 -4,19 10 -5,17 10 -4,71 Nước Nước Glycerol trứng gà trứng vịt 50% I 10-4,42 10-4,22 II 10 -4,64 Tổng hợp 10 -4,53 Đợt kiểm tra Kết bảng 3.9 cho thấy, sau thời gian bảo quản, chất lượng giống DH - EG - 2000 bảo quản môi trường khác thông qua tiêu ELD50 giữ ổn định Chỉ số virus nước trứng gà dao động từ 10-4,42 đến 10-4,64, nước trứng vịt từ 10-4,22 đến 10-4,42, Glycerol 50% từ 10-4,18 đến 10-4,20, tế bào xơ phôi gà từ 10-5,12 đến 10-5,22 tế bào xơ phôi vịt từ 10-4,63 đến 10-4,79 Như vậy, môi trường phù hợp cho việc bảo quản virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 3.7.2 Nghiên cứu chọn lọc phương pháp thích hợp để bảo quản virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 Hoàn nguyên chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 bảo tồn năm -860C Virus sau hoàn nguyên bảo quản phương pháp khác (đông khô, lưu trữ dạng bệnh phẩm lưu trữ dạng nước trứng) Sau 12 tháng bảo quản -860C, tiến hành kiểm tra số ELD50 mẫu để chọn phương pháp bảo quản thích hợp Kết kiểm tra trình bày bảng 3.10 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 Bảng 3.10 Kết kiểm tra số ELD50 chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 sau thời gian bảo quản phương pháp khác -860C Phương pháp bảo quản Lưu trữ dạng Đông khô Đợt kiểm tra bệnh phẩm (gan phôi gà) Lưu trữ dạng nước trứng I 10-4,16 10-4,21 10-4,52 II 10-4,22 10-4,33 10-4,48 Tổng hợp 10-4,19 10-4,27 10-4,50 Kết bảng 3.10 cho thấy, sau thời gian bảo quản, chất lượng giống DH - EG - 2000 bảo quản phương pháp khác thông qua tiêu ELD50 biến động đáng kể Chỉ số mẫu bảo quản phương pháp đông khô dao động từ 10-4,16 đến 10-4,22, mẫu sử dụng phương pháp lưu trữ dạng bệnh phẩm từ 10-4,21 đến 10-4,33 mẫu sử dụng phương pháp lưu trữ dạng nước trứng số dao động từ 10-4,48 đến 10-4,52 Tuy nhiên phương pháp lưu trữ dạng bệnh phẩm thường thời gian bảo quản không lâu, dễ bị tạp nhiễm tốn diện tích bảo quản phương pháp cịn lại Phương pháp đơng khơ nhanh thuận lợi cho đợt bảo quản mẫu số lượng lớn So với phương pháp lưu trữ dạng bệnh phẩm, phương pháp có thời gian bảo quản lâu, tránh tạp nhiễm Tuy nhiên, nhược điểm lớn phương pháp giá thành thiết bị Độ ổn định chủng virus bảo quản theo đợt đông khô khác Hỗn dịch virus lưu trữ dạng đơng khơ đóng vào ampoul, sau đóng bảo quản -860C Trong trường hợp, sản phẩm đơng khơ đóng vào lọ thủy tinh có nắp dạng vacxin thương phẩm chuyển từ nhiệt độ bảo quản -860C sang nhiệt độ bảo quản -200C gặp tượng giãn nở không nắp lọ thủy tinh làm cho không Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 khí có hội xâm nhập vào lọ ảnh hưởng đến chất lượng huyễn dịch virus đông khô Hơn nữa, chủng virus đông khô phải hoạt hóa trước đem sử dụng Như vậy, để phù hợp với điều kiện nước ta nên lưu giữ giống virus dạng tươi (dạng nước trứng) -860C Phương pháp có hiệu với nhiều chủng virus khác 3.7.3 Nghiên cứu xác định thời gian bảo quản hỗn dịch kháng nguyên virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 Khi sử dụng chủng virus sản xuất vacxin dịch tả vịt thành phẩm vacxin bảo quản -200C Chúng tiến hành sản xuất hỗn dịch virus phôi gà ấp 11 ngày, thu nước trứng tươi tiến hành bảo quản -200C Sau 3, 6, 12 tháng bảo quản lấy kiểm tra chất lượng phôi trứng thông qua số sinh học kết thể bảng 3.11 Bảng 3.11 Kết kiểm tra số EID50 virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 sau thời gian bảo quản khác Thời gian bảo quản tháng tháng tháng 12 tháng I 10-5,50 10-5,34 10-5,68 10 -5,43 II 10 -5,54 10-5,68 10 -5,32 10-5,50 Tổng hợp 10-5,52 10-5,51 10-5,50 10-5,465 Đợt kiểm tra Kết bảng 3.11 cho thấy điều kiện bảo quản (-200C), sau thời gian bảo quản khác (3 tháng, tháng, tháng, 12 tháng), chất lượng huyễn dịch virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 thông qua tiêu EID50 khơng có biến động đáng kể Chỉ số hỗn dịch virus sau tháng bảo quản dao động từ 10-5,50 đến 10-5,54, sau tháng số dao động từ 10-5,34 đến 10-5,68, sau tháng số dao động từ 10-5,32 đến 10-5,68 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 sau 12 tháng số dao động từ 10-5,43 đến 10-5,50 Như sau 12 tháng bảo quản -200C hỗn dịch kháng nguyên đạt yêu cầu chất lượng (hiệu giá virus ổn định) thể qua số EID50 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, rút kết luận sau: Chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 phục hồi phôi gà sau thời gian năm bảo quản nhiệt độ -860C dạng nước trứng tươi Virus nhân lên tốt gây chết phôi gà với tỷ lệ cao dao động từ 50,00 - 53,33% Thời gian gây chết phôi tập trung vào khoảng từ 49 - 96 sau tiêm truyền Virus nhân lên gây bệnh tích điển hình cho phơi gồm có: xuất huyết da, phù phơi, xuất huyết gan hoại tử gan Sau năm bảo quản -860C, giống gốc virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 giữ mức ổn định số ELD50 EID50 phôi gà Chỉ số ELD50 qua lần chuẩn độ biến động từ 10-4,155 /0,2 ml đến 10-4,21/0,2 ml ELD50 trung bình chủng đạt 10-4,19/0,2 ml Chỉ số EID50 virus biến động từ 10-5,13/0,2 ml đến 10-5,375/0,2 ml EID50 trung bình chủng 10-5,28/0,2 ml Virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 xác định có mặt nước trứng phương pháp RT - PCR Hỗn dịch kháng nguyên chế từ chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 bảo quản năm điều kiện -860C đạt tiêu vơ trùng, an tồn có hiệu lực cao Chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 bảo quản điều kiện khác Chất lượng giống DH - EG - 2000 thông qua tiêu ELD50 ổn định môi trường nước trứng vịt, nước trứng gà, Glycerol 50%, tế bào xơ phôi vịt tế bào xơ phôi gà Việc sử dụng phương pháp đông khô, lưu trữ dạng bệnh phẩm lưu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 trữ dạng nước trứng tốt cho việc bảo quản virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 nhiên để phù hợp với điều kiện nên sử dụng phương pháp lưu giữ giống virus dạng nước trưng tươi -860C Sau 12 tháng bảo quản -200C, hỗn dịch kháng nguyên virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 có hiệu tốt Như vậy, nghiên cứu thấy điều kiện bảo quản tốt với chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 dạng nước trứng tươi -860C Kiến nghị - Tiếp tục tiến hành nghiên cứu xác định thời gian bảo quản tối đa virus viêm gan vịt DH - EG - 2000 điều kiển bảo quản lạnh -860C - Xác định yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng giống virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 thời gian bảo quản -860C Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Vũ Triệu An (1997) Miễn dịch học, NXB Y học Hà Nội Nguyễn Xuân Bình (1995) 109 bệnh gia cầm, NXB Long An Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà Nguyễn Khánh Ly (2001) Nghiên cứu biến đổi bệnh lý bệnh viêm gan virus vịt, Khoa học kỹ thuật Thú y, 8(4), Hội thú y Việt Nam, tr 48-51 Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2004) Một số vấn đề miễn dịch thụ động gia súc, gia cầm non, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên (2007) Khảo sát số đặc tính sinh học chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 bước đầu nghiên cứu chế tạo vacxin phịng bệnh, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 14(2), hội thú y Việt Nam, tr 11-15 Lê Thanh Hòa, Nguyễn Như Thanh Nguyễn Bá Hiên (1984) Đặc tính sinh học giống virus vacxin viêm gan vịt chủng TN Asplin vacxin phòng bệnh Việt Nam, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 2, (1-1985), tr 21-25 Lê Thanh Hòa (2002) Sinh học phân tử: nguyên lý ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tr 104 Nguyễn Phục Hưng (2004) Tình hình mắc bệnh viêm gan vịt virus số tỉnh đồng Bắc Bộ Phân lập virus gây bệnh, nghiên cứu đặc tính sinh học chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 quy trình sản xuất vacxin Luận văn thạc sỹ nơng nghiệp Trường Đại học nông nghiệp I Trần Thị Lan Hương, Phạm Thị Hường, Nguyễn Bá Hiên (2008) Ảnh hường miễn dịch thụ động viêm gan vịt đến đáp ứng miễn dịch vịt tiêm liều vacxin đầu tiên, Tạp chí Khoa học phát triển, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, 6(4), tr 338-342 10 Đồn Thị Thanh Hương, Nguyễn Bá Hiên, Lê Thanh Hòa (2010) Phát lần genotype III (DHAV - 3) virus gây bệnh viêm gan vịt Việt Nam phương pháp giám định phân tử, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 8(2), pp 142-152 11 Bùi Thanh Khiết (2007) Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược độc DH - EG - 2000 ứng dụng phòng, can thiệp dịch vào thực tế sản xuất Luận văn thạc sỹ nông nghiệp Trường Đại học nơng nghiệp I 12 Ngơ Đình Long (2005) Tình hình bệnh viêm gan vịt virus Huyện Hiệp Hòa Tỉnh Bắc Giang Phân lập khảo sát số đặc tính sinh học chủng virus gây bệnh biện pháp phịng bệnh Luận văn thạc sỹ nơng nghiệp Trường Đại học nông nghiệp I 13 Nguyễn Luận (2008) Xác định đặc tính sinh học phân tử gen VP1 chủng virus vacxin viêm gan vịt Việt Nam so sánh với số chủng khác giới Luận văn thạc sỹ nông nghiệp Trường Đại học nông nghiệp I 14 Nguyễn Đức Lưu, Lương Tất Nhợ, Hoàng Văn Tiêu Nguyễn Hữu Vũ (2001) Nuôi ngan vịt bệnh thường gặp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 15 Melekhin G.P Gridin N.I (1989) Sinh lý NXB Nông nghiệp Hà Nội 16 Nguyễn Thát (1975) Bệnh gia cầm, NXB Khoa học kĩ thuật, Hà Nội 17 Nguyễn Thiện Nguyễn Đức Trọng (2004) Chăn nuôi vịt cạn, NXB Lao động 18 Đặng Đức Trạch, Nguyễn Đình Hưng, Phạm Mạnh Hùng, Pondman, 30 K W; Wright, E P (1984) Miễn dịch học (textbook of immunology), University press (University of Asterdam), NXB KHKT TÀI LIỆU TIẾNG ANH 19 Adamiker D (1969) Elektronenmikros kopiscle untersuchungen zus virushepatitis der Etenkken, Zentrabl Veterianezmed [B] 16: 620-636 20 Adamiker D (1970) Die Virushepatitis der Entenkken im elektronenmikroskopischen Bild, Teil II: Befunde an der Milz und am Muskei Zentralbl Veterinaermed [B] 17, pp 880-889 21 Asplin F.D (1958) An attenuated strain of duck hepatitis virus, Vet Rec 70, pp 1226-1230 22 Asplin F.D (1961) Notes on epidemiology and vaccination for virus hepatitis of ducks, Off Int Epizoot Bull 56, pp 793-800 23 Asplin F.D (1970) Examination of sera from wild fowl for antibodies against the viruses of duck plague duck hepatitis and duck influenza, Vet Rec 87, pp 182-183 24 Davis D and Hannant D (1987) Fractionation of neutralizing antibodies in serum of ducklings vaccinated with live duck hepatitis virus vacxin, Res Vet Sci 43, pp 276- 277 25 Ding C and Zhang D (2007) Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1, Virology 361, pp 9-17 26 Fabricant J, Rickard C.G and Levine P.P (1957) The pathology of duck virus hepatitis, Avian Diseases, pp 256-275 27 Ghazi F, Hughes P.J, Hyypiä T and Stanway G (1998) Molecular analysis of human pacherovirus type (formerly echovirus 23), Virol 79, pp 2641-2650 28 Gough R.E and Spackman D (1981) Studies with inactivated duck virus hepatitis vacxins in breeder ducks, Avian Pathol 10, pp 471-479 29 Hwang J (1965) A chicken embryo-lethal-strain of duck hepatitis virus Avian Dis 6: 435-440 30 Jenkins K.A, Bean A.G and Lowenthal J.W (2007) Avian genomics and the innate immune response to viruses, Cytogenet Genome Res 117, pp 207-212 31 Johansson S, Niklasson B, Tesh R.B, Shafren D.R, Travassos da Rosa A.A and Lindberg A.M (2003) Molecular characterization of M 1146, an American isolate of Ljungan virus (LV) reveals the presence of a new LV genotype, Virol 84, pp 837-844 32 Kim MC, Kim MJ, Kwon YK, Lindberg AM, Job SJ, Kwon HM, Lee Ỵ, Kwon JH (2009) Development of duck hepatitis A virus type vaccine and its use to protect Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 ducklings against infections, Vaccine 27, pp 6688-6694 33 Kim MC, Kwon YK, Job SJ, Kim SJ, Tolf C, Kim JH, Sung HW, Lindberg AM, and Kwon JH (2007) Recent Korea isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of a new genome and serotype when compared to duck hepatitis virus type I type strains, Arch Virol 152(11), pp 2059-2072 34 Levine P.P and M.S Hofstad (1945) Duck disease investigation, Annu Rep New York State Vet Coll, Ithaca Vet 40, pp 71-86 35 Levine P.P and J Fabricant (1950) Virus disease of ducks in North America Corell Vet 40, pp 71-78 36 Maiboroda A.D (1972) Formation of ducks hepatitis virus in culture cells, Veterinariya (8), pp 50-52 37 Malinovskaya G.V (1982) Formation of 19s and 7s antibodies during imimunogenesis and pathogenesis of duck viral hepatitis, Vet Nauk Proiz (Minsk) 19, pp 68-70 38 Mennella, G.R and G Mandelli (1977) Glutamic - oxaloaxetat - Transaminaza (GOT) and glutamic - pyruvic - transamilaza(GPT) in the blood serum in experimenral viral hepatitis of ducklings, Arch Vet Ital 28: 187-190 39 Oberste M.S, Maher K, Kennett M.L, Campbell J.J, Carpenter M.S, Schnurr D and Pallansch M.A (1999) Molecular epidemiology and genetic diversity of echovirus type 30 (E30): genotypes correlate with temporal dynamics of E30 isolation, J Clin Microbiol 37, pp 3928-3933 40 OIE (2000) Manual of standards for diagnostic test and vacxins 41 OIE (2006) Annual animal disease status 42 OIE (2008) Chapter 2.3.8 Duck virus hepatitis Terrestrial Manual 2008 43 Priz N.N (1973) Comparative study of virus hepatitis in animals (dogs and ducks) using different routes of influence, Vopr Virusol 6, pp 696-700 44 Rahn D.P (1962) Susceptibiliti of turkeys to duck hepatitis virus and turkey hepatitis virus MS thesis Univ Illinois 45 Reuss U (1959) Versuche zur aktiven und passiven Immunisierung bei der Virus hepatitis der Entenkuken, Zentrabl Veterinaermed 6, pp 808-815 46 Rispens B.H (1969) Some aspects of control of infectious hepatitis in ducklings, Avian dis 13, pp 417-426 47 Tseng C.H, Knowles N.J and Tsai H.J (2007) Molecular analysis of duck hepatitis virus type indicates that it should be assigned to a new genus, Virus Res 123, pp 190-203 48 Tseng C.H and Tsai H.J (2007) Sequence analysis of a duck picornavirus isolate indicates that it together with porcine enterovirus type and simian picornavirus type should be assigned to a new picornavirus genus, Virus Res 129, pp 1-104 49 Tseng C.H and Tsai H.J (2007) Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus, Virus Res 126, pp 19-31 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 50 Wang L., Pan M., Fu Y., Zhang D (2008) Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis Virus Genes 37(1), pp 52-59 51 Woolcock P.R (2003) Duck hepatits In: Saif YM, Barnes HJ, Glisson JR, Fadly AM, McDougald LR, Swayne DE (EDs) Disease of Poultry, 11th ed, Iowa State University Press, Ames, IA, pp 343-354 52 Woolcock P.R and Fabricant J (1997) Duck hepatitis, In Diseases of Poultry, 10th Ed, Calnek B.W., BRNAes H.J., Beard C.W., McDougald L.R and Saif Y.M., eds, Iowa State University Press, Ames, Iowa, U.S.A, pp 661- 673 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 PHỤ LỤC Tóm tắt quy trình sản xuất hỗn dịch kháng nguyên virus viêm gan vịt nhược độc Giống gốc Pha với nước sinh lý thành Giống gốc nồng độ 10-2 Pha với nước sinh lý nồng độ 10-2 Giống vacxin Kiểm tra vô trùng Kiểm tra vô trùng Giống sản xuất Gây nhiễm phôi trứng Gây nhiễm phôi trứng gà 10 ngày tuổi Ấp tiếp 37oC/96 Ấp tiếp 370C/x Thu trứng 4oC/12 giờ0 Thu trứng để lạnh để lạnh C/12giờ đến 24 Mổ trứng Mổ trứng ThuThu chất chứa virus nước trứng Kiểm vô trùng Kiểm tratra vô trùng Chuẩn hiệu giá Chuẩn độđộ hiệu giá Kiểm nghiệmKiểm vacxin nghiệm vacxin Bán thành phẩm Bán thành phẩm Ra chai, dán nhãn, bảo quản Ra đông dán nhãn - bảo quản Ra chai chai, khô, dán nhãn, bảo quản Ra chai, đông khô- dán nhãn - bảo quản Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 ... định chủng g? ?c virus viêm gan vịt như? ?c đ? ?c DH - EG - 2000 RT - PCR 2.1.3 Nghiên c? ??u đánh giá khả kích thích đáp ứng miễn dịch chủng virus viêm gan vịt như? ?c đ? ?c DH - EG - 2000 - Chế tạo hỗn dịch... vịt như? ?c đ? ?c DH - EG - 2000 dạng tươi -8 6 0C? ?? M? ?C ĐÍCH VÀ YÊU C? ??U C? ??A ĐỀ TÀI - Đánh giá tính ổn định đ? ?c tính sinh h? ?c, sinh h? ?c phân tử chủng virus viêm gan vịt như? ?c đ? ?c DH - EG - 2000 - Bảo tồn. .. đ? ?c phương pháp trung hòa 2.1.4 Nghiên c? ??u điều kiện bảo tồn virus viêm gan vịt như? ?c đ? ?c DH EG - 2000 - Nghiên c? ??u chọn l? ?c mơi trường thích hợp để bảo quản virus viêm gan vịt như? ?c đ? ?c DH -