- Thu hoạch, xử lý và bảoquản hỗn dịch kháng nguyên:
2.4.10.Kiểm tra hiệu lực hỗn dịch kháng nguyên bằng phản ứng trung hòa trên phôi gà
trên phôi gà
Khả năng đáp ứng miễn dịch của vịt sau khi tiêm phòng hỗn dịch kháng nguyên được thể hiện thông qua biến động hàm lượng kháng thể trong huyết thanh vịt sau khi được tiêm hỗn dịch kháng nguyên. Chúng tôi sử dụng phản ứng trung hòa trên phôi trứng gà với phương pháp huyết thanh pha loãng và virus cố định. Phương pháp này thường dùng để kiểm tra biến động hàm lượng kháng thể của vịt sau khi được tiêm phòng hỗn dịch kháng nguyên. Để thực hiện phản ứng trung hòa cần phải chuẩn bị:
- Kháng thể là huyết thanh miễn dịch cần khảo sát - Kháng nguyên là bệnh phẩm chứa virus chuẩn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31 - Huyết thanh thường làm đối chiếu (đã xử lý để diệt bổ thể ở 560C/30 phút)
2.4.10.1. Phương pháp chế huyết thanh miễn dịch chuẩn (kháng huyết thanh)
Dùng 20 con vịt 1 - 5 ngày tuổi chia thành 2 lô: lô thí nghiệm và lô đối chứng, mỗi lô 10 con.
- Lô thí nghiệm: Tiêm hỗn dịch kháng nguyên viêm gan vịt với liều sử dụng, mỗi con 0,5 ml. Sau 21 ngày lấy máu, lấy xong bảo quản trong tủ lạnh 40C/12 - 24 giờ chắt huyết thanh để làm phản ứng trung hòa với virus (tất cả các thao tác phải đảm bảo an toàn). Huyết thanh phải trong suốt hoàn toàn và được bảo quản trong tủ lạnh.
- Lô đối chứng: không tiêm hỗn dịch kháng nguyên, cũng sau 21 ngày lấy máu chắt huyết thanh làm phản ứng đối chiếu với lô thí nghiệm.
2.4.10.2. Phương pháp làm phản ứng trung hòa virus cố định, huyết thanh thay đổi
- Chuẩn bị trứng: Trứng gà có phôi 11 ngày tuổi, soi trứng, chọn những phôi khoẻ mạnh, đánh dấu buồng hơi, đánh dấu vị trí đầu phôi, sát trùng bằng cồn 700 xung quanh vỏ trứng, sát trùng vị trí buồng hơi bằng cồn iod 5%.
- Huyết thanh miễn dịch được xử lý ở 560C/30 phút để loại bỏ các yếu tố trung hòa không đặc hiệu và pha loãng với nước muối sinh lý 0,9% thành các độ pha loãng 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 và 1/256.
- Pha loãng huyễn dịch virus tương đương 1.000 ELD50/0,1 ml.
- Trộn huyết thanh với huyễn dịch virus theo theo tỷ lệ 1:1 (ví dụ: trộn 0,1 ml huyết thanh với 0,1 ml huyễn dịch virus), sau đó đểủ ở 370C trong 45 phút đến 1 giờđể virus tiếp xúc với kháng thể trong huyết thanh rồi tiêm cho phôi gà. Mỗi độ pha loãng huyết thanh tiêm cho 5 phôi, mỗi phôi 0,1 ml; theo dõi trong 96 giờ. Hàm lượng kháng thể trong huyết thanh được biểu diễn thông qua hiệu giá kháng thể và đơn vị trung hòa (ĐVTH). Hiệu giá kháng thể chống virus là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh ngăn cản hoàn toàn sự gây chết phôi.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 Sơđồ phản ứng:
Virus Số ống Độ pha loãng của huyết thanh
1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
Virus pha loãng tương đương 1.000 ELD50 Mỗi ống 0,1 ml 1 0,1ml 2 0,1ml 3 0,1ml 4 0,1ml 5 0,1ml
Đơn vị trung hòa được tính như sau:
Nếu trộn 0,1 ml huyết thanh với 0,1 ml virus ở nồng độ 1.000 ELD50 sẽ làm cho thể tích tăng lên gấp đôi nền nồng độ giảm xuống một nửa là 500 ELD50 và trong 0,1 ml huyết dịch có 0,05 ml virus và 0,05 ml huyết thanh.
Nếu lượng kháng thể trung hòa có trong huyết thanh thí nghiệm trung hòa được 1 ELD50 (LD50, TCID50) virus ở thể tích tương đương thì trong mẫu huyết thanh đó chứa 1 đơn vị trung hòa.
Ví dụ: hiệu giá kháng thể đạt được là 1/4 tức là 0,1 ml huyết thanh ở độ pha loãng 1/4 trung hòa hết 0,1 ml virus chứa 500 ELD50 (LD50, TCID50), có nghĩa là 0,1 ml huyết thanh ở độ pha loãng 1/4 có chứa 500 ĐVTH, như vậy trong 0,1 ml huyết thanh đặc sẽ có 500 x 4 = 2.000 (ĐVTH), do đó 1 ml huyết thanh đặc chứa 2.000 x 10 = 20.000 (ĐVTH). Nếu mẫu huyết thanh thí nghiệm trung hòa được từ 50 ĐVTH trở lên, phản ứng trung hòa là dương tính. Tuy nhiên, để bảo hộđược động vật, hàm lượng kháng thể trong huyết thanh miễn dịch phải càng cao càng tốt và tùy thuộc vào từng trường hợp.
Chúng tôi tiến hành độc lập bốn phản ứng trung hòa trên phôi với virus viêm gan vịt kèm theo phản ứng đối chiếu trong đó huyết thanh miễn dịch được thay bằng huyết thanh bình thường.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
2.4.11. Nghiên cứu các điều kiện bảo tồn virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 EG - 2000
- Nghiên cứu chọn lọc môi trường thích hợp để bảo quản virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000: môi trường Glycerol 50%, môi trường tế bào xơ phôi vịt 1 lớp, tế bào xơ phôi gà 1 lớp, phôi gà 8 - 10 ngày tuổi, phôi vịt 9 - 11 ngày tuổi. Sau 12 tháng bảo tồn ở -860C, đánh giá chỉ số ELD50 và so sánh để lựa chọn môi trường thích hợp nhất.
- Nghiên cứu chọn lọc phương pháp thích hợp để bảo quản virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000: lưu trữ dạng đông khô, lưu trữ dạng bệnh phẩm (gan phôi gà) và lữu trữ dạng nước trứng. Sau 12 tháng bảo tồn ở -860C, đánh giá chỉ số ELD50 và so sánh để lựa chọn phương pháp thích hợp nhất.
- Nghiên cứu xác định thời gian bảo quản của hỗn dịch kháng nguyên virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 sau 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng và 12 tháng ở điều kiện bảo quản -200C: kiểm tra hàm lượng virus và so sánh để xác định thời gian thích hợp cho bảo quản virus.
* Phương pháp đông khô virus:
Nguyên lý: Huyễn dịch virus được làm đông, nước sẽ chuyển thẳng từ trạng thái rắn sang trạng thái khí thăng hoa nhờ máy hút chân không tạo ra áp suất thấp ở nhiệt độ rất thấp.
- Chuẩn bị giống virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000: Cấy giống virus trên phôi gà 9 - 10 ngày tuổi, sạch bệnh, thu nước trứng.
- Chuẩn bị môi trường sữa tách bơ 10%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dùng nước trứng pha với bổ trợ sữa tách bơ 10% theo tỷ lệ 1:1, đóng vào các ống.
- Đông khô: Quá trình đông khô được thực hiện trên máy đông khô cho đến khi độẩm cuối cùng của ống đông khô đạt khoảng 1%.
Sau khi đông khô, tiến hành kiểm tra độ chân không của ống đông khô. Thiết bị sử dụng là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu đạt độ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc xuất hiện màu xanh tím đậm.