Nghiên cứu biện pháp bảo tồn quỹ gen virus dịch tả vịt nhược độc DP - EG - 2000 dạng tươi ở -86c

DANH MỤC BẢNG 2.1 Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR 33 3.1 Kết quả cấy truyền chủng gốc virus dịch tả vịt nhược độc 3.2 Kết quả kiểm tra bệnh tích đại thể trên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

HOÀNG THỊ PHƯƠNG THÚY

NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP BẢO TỒN QUỸ GEN VIRUS DỊCH TẢ VỊT NHƯỢC ĐỘC DP-EG-2000 DẠNG TƯƠI Ở -860C

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

HOÀNG THỊ PHƯƠNG THÚY

NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP BẢO TỒN QUỸ GEN VIRUS DỊCH TẢ VỊT NHƯỢC ĐỘC DP-EG-2000 DẠNG TƯƠI Ở -860C

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ

rõ nguồn gốc Mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2014

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Phương Thúy

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Bá Hiên đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và xây dựng luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, tập thể cùng các thầy giáo, cô giáo Viện đào tạo Sau đại học, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Ban chủ nhiệm Khoa Thú Y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn

Nhân dịp này tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Cao Văn, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong quá trình học tập

và hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2014

Tác giả luận văn

1.1 Những nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt ở trong nước và nước ngoài 3

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

2.3.1 Phương pháp xác định khả năng thích ứng và ổn định của chủng

2.3.2 Phương pháp xác định chỉ số ELD50 (liều gây chết 50% phôi) của

2.3.3 Phương pháp xác định chỉ số EID50 (liều gây nhiễm 50% phôi) của

2.3.4 Phương pháp giám định chủng virus dịch tả vịt nhược độc

2.3.5 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của hỗn dịch kháng nguyên 34 2.3.6 Phương pháp kiểm tra sự thuần khiết của hỗn dịch kháng nguyên 34 2.3.7 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn của hỗn dịch kháng nguyên 36 2.3.8 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của hỗn dịch kháng nguyên 36 2.3.9 Nghiên cứu các điều kiện bảo tồn virus dịch tả vịt nhược độc DP-

3.1 Kiểm tra một số đặc tính sinh học của chủng gốc virus dịch tả vịt

nhược độc DP-EG-2000 sau thời gian bảo tồn 3 năm ở -860C 38 3.1.1 Xác định khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus dịch tả vịt

3.1.2 Kết quả xác định chỉ số ELD50 của chủng virus dịch tả vịt nhược

3.3 Kết quả xác định chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết của hỗn dịch

3.4 Kết quả xác định chỉ tiêu an toàn và hiệu lực của hỗn dịch kháng

3.4.1 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của hỗn dịch kháng nguyên 49 3.4.2 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của hỗn dịch kháng nguyên 51 3.5 Nghiên cứu các điều kiện bảo tồn virus dịch tả vịt nhược độc DP-

3.5.3 Nghiên cứu xác định thời gian bảo quản của hỗn dịch kháng nguyên

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

RT-PCR : Reverse Transcription – Polymerase chain reaction

DANH MỤC BẢNG

2.1 Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR 33

3.1 Kết quả cấy truyền chủng gốc virus dịch tả vịt nhược độc

3.2 Kết quả kiểm tra bệnh tích đại thể trên phôi sau khi gây nhiễm virus

3.7 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của hỗn dịch kháng nguyên dịch tả

3.8 Kết quả xác định chỉ tiêu hiệu lực của vacxin dịch tả vịt nhược độc

3.9 Kết quả kiểm tra chỉ số ELD50 của chủng virus dịch tả vịt nhược

độc DP-EG-2000 sau 12 tháng bảo quản bằng những môi trường

3.10 Kết quả kiểm tra chỉ số ELD50 của chủng virus dịch tả vịt nhược độc

DP-EG-2000 sau 12 tháng bảo quản bằng những phương pháp khác

3.11 Kết quả kiểm tra chỉ số EID50 của hỗn dịch kháng nguyên chế từ

chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 sau thời gian bảo

DANH MỤC ĐỒ THỊ

3.2 Kết quả PCR phát hiện virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 46

MỞ ĐẦU

Cho đến nay, vịt là loài thủy cầm được người dân chăn nuôi nhiều nhất Trên thế giới có khoảng 500-600 triệu vịt, trong đó châu Á chiếm tới 80-86% tổng đàn vịt Theo số liệu thống kê của FAO (2006) tổng số vịt của Việt Nam là

60 triệu con, đứng thứ 2 thế giới sau Trung Quốc

Trong đó, phương thức chăn nuôi chủ yếu hiện nay là nuôi vịt chạy đồng, thả lan giúp tận dụng nguồn thức ăn từ đồng ruộng, tiết kiệm chi phí chăn nuôi Tuy nhiên việc này lại gây khó khăn trong việc kiểm soát dịch bệnh đặc biệt là bệnh dịch tả vịt

Bệnh dịch tả vịt được phát hiện đầu tiên ở nước ta vào năm 1963 và năm

1969 virus đã được phân lập và giám định Nguyên nhân bệnh là do herpesvirus, một loại ADN virus Bệnh có thể gây chết vịt ở mọi lứa tuổi với tỷ lệ chết cao đến 90% ở các đàn vịt không được tiêm vacxin Ở Việt Nam hàng năm thiệt hại

do bệnh dịch tả vịt gây ra ước tính vào khoảng 20% trong tổng số thiệt hại do các bệnh khác gây ra Theo Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN và Quyết định số 64/2005/QĐ-BNN được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 13/10/2005 đây là một trong 7 bệnh phải tiêm phòng bắt buộc và yêu cầu tỷ lệ tiêm phòng phải đạt 100%

Để phòng chống bệnh dịch tả vịt có hiệu quả, việc thu thập và lưu giữ nguồn gen của các virus gây bệnh với mục đích cung cấp giống cho việc chế tạo kháng huyết thanh, kháng nguyên dùng trong chẩn đoán bệnh nhanh và đặc biệt

là việc lựa chọn các chủng tiêu chuẩn, có đặc tính sinh học đặc trưng và ổn định

để tạo ra giống chủng sản xuất vacxin là việc làm cần thiết

Hiện tại khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đang lưu giữu được chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 đạt tiêu chuẩn để nghiên cứu và sản xuất vacxin Tuy nhiên, nếu chủng virus này không được bảo quản tốt sẽ thay đổi đặc tính sinh học, nhất là tính kháng nguyên, không ổn định độc lực

chúng có thể bị cường độc trở lại làm ảnh hưởng đến việc sản xuất vacxin và các chế phẩm sinh học Vì vậy chủng virus này cần được lưu giữ và bảo tồn trong điều kiện tối ưu nhất, đảm bảo sự ổn định lâu dài các đặc tính sinh học để phục

vụ yêu cầu nghiên cứu và sản xuất

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu biện pháp bảo tồn quỹ gen virus dịch tả vịt nhược độc

DP-EG-2000 dạng tươi ở -86 0

C”

Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá được tính ổn định đặc tính sinh học, sinh học phân tử của chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000

- Nghiên cứu được điều kiện bảo tồn virus dịch tả vịt nhược độc

DP-EG-2000 từ đó đưa ra được phương pháp bảo tồn phù hợp

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Những nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt ở trong nước và nước ngoài

1.1.1 Những nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam

Năm 1963, bệnh lần đầu tiên xuất hiện tại Cao Bằng làm thiệt hại trên 3.000 vịt

Tháng 5/1969, trong vòng 3 tháng bệnh dịch tả vịt đã làm thiệt hại tới 15.000 vịt ở 4 huyện ngoại thành Hà Nội Cũng năm này, chủng virus dịch tả vịt nhược độc thích nghi trên phôi vịt đã được sử dụng để sản xuất vacxin phòng bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam (Trần Minh Châu,1980)

Năm 1987, Trần Minh Châu đã nghiên cứu chủng vacxin nhược độc dịch

tả vịt thích nghi trên phôi gà Tác giả cho biết, chủng virus này gây chết phôi gà rất ổn định, thời gian chết phôi 72-120 giờ Virus vacxin có ELD50 từ 10-3,31/0,2

ml đến 10-4,5/0,2 ml Vacxin khi sử dụng an toàn cho vịt nhưng về hiệu lực cần nghiên cứu thêm Tác giả còn nghiên cứu chế thử 4 loại vacxin vô hoạt và đưa ra kết luận: Vacxin vô hoạt cũng tạo được miễn dịch cho đàn vịt nhưng đáp ứng miễn dịch không mạnh mà giá thành lại cao

Năm 1989, Phạm Thị Lan Thu, Thân Thị Hạnh cho biết đàn vịt của Phú Khánh trong những năm 1980-1986 thường phát ra bệnh và lây lan nhanh ở nhiều nơi Các tác giả đã tiến hành phân lập virus dịch tả vịt trên đàn vịt ở Phú Khánh

Lê Văn Lãnh (1991) nghiên cứu đặc tính sinh học của virus vacxin dịch tả vịt chủng Jansen và cho biết virus vacxin có tính ổn định khi nuôi cấy trên phôi

gà và tế bào xơ phôi gà 1 lớp; chỉ số ELD50 biến động trong khoảng từ 10-3,31/0,2

ml đến 10-3,36/0,2 ml; CPE50 biến động từ 10-4,36 đến 10-4,54 Vacxin an toàn cho mọi lứa tuổi vịt, hiệu lực của vacxin cao Vacxin được chế biến dưới 2 dạng là vacxin tươi và vacxin đông khô

Nguyễn Đức Hiền (1999) đã chẩn đoán xác định virus gây bệnh dịch tả vịt

ở Cần Thơ và theo kết quả chẩn đoán lâm sàng thì trên 1.176 vịt bệnh được mổ

khám có 455 vịt mắc bệnh dịch tả vịt Tác giả cũng nghiên cứu về vacxin dịch tả vịt kết luận phương pháp nhỏ mắt hoặc tiêm bắp hoặc kết hợp cả hai đều cho đáp ứng miễn dịch tương đối giống nhau và đạt tỷ lệ bảo hộ hơn 70%

Nguyễn Ngọc Huân (2006) khuyến cáo sử dụng vacxin dịch tả vịt đông khô của Navetco trong quy trình thú y an toàn dịch bệnh áp dụng cho vịt nuôi ở nông hộ

Từ năm 2000 đến nay, bộ môn VSV-TN Học viện Nông nghiệp Việt Nam đang có những nghiên cứu về việc chế tạo vacxin mới với chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 có xuất xứ từ nước ngoài Những kết quả thử nghiệm ban đầu khá khả quan, dần đáp ứng được yêu cầu trong nghiên cứu và sản xuất

1.1.2 Những nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt ở nước ngoài

Ở nước ngoài, bệnh dịch tả vịt đã được nghiên cứu về triệu chứng và bệnh tích từ lâu Cho đến nay, những hiểu biết về virus dịch tả vịt là rất sâu và đều được các tác giả tập trung vào lĩnh vực sinh học phân tử của virus

Shawky S (2000) nghiên cứu về tế bào đích của virus dịch tả vịt trong các

cơ quan lâm ba Các tác giả cho biết kháng nguyên dịch tả vịt được tìm thấy ở trong lách, tuyến ức, và túi Fabricius vào ngày thứ 3, 6 và thứ 8 sau khi gây nhiễm Kháng nguyên được xác định trong tế bào biểu mô của tất cả các cơ quan Lympho được kiểm tra Tế bào B di chuyển ra từ túi Fabricius và không thể tuần hoàn ngược về, sự di chuyển của tế bào B tới lách chỉ xuất hiện vào ngày thứ 8 sau khi gây nhiễm Các tác giả kết luận, tế bào đích của virus dịch tả vịt là tế bào biểu mô và tế bào B

Shengwang Liu (2007) và cộng sự đã nghiên cứu tính tương đồng về mặt phân tử của herpes simplex virus 1 (HSV-1), UL25 và UL30 trong virus dịch tả vịt

Qi Xuefeng và cộng sự (2007) đã phân tích định lượng virus dịch tả vịt ở đàn vịt bị công cường độc và cho biết tỷ lệ nhiễm của virus dịch tả vịt ở túi Fabricius và ruột non là rất cao

Năm 2008, Shengwang Liu và cộng sự tiếp tục nghiên cứu về sự phát sinh

loài của virus dịch tả vịt và quan hệ tiến hoá trong họ Herpesviridae Từ phân tích phả hệ các tác giả cho biết virus dịch tả vịt và những herpesvirus khác đều bắt nguồn từ một nhánh và virus gây bệnh dịch tả vịt thuộc phân nhóm dưới họ Alphaherpesvirinae Trong hầu hết các trường hợp, virus gây bệnh dịch tả vịt có quan hệ gần với chi Mardivirus, nhưng tách ra một nhánh riêng

Renyong Jia và cộng sự (2009) trong nghiên cứu của mình đã công bố ở vịt trắng Bắc Kinh bị gây nhiễm bởi chủng DEV-97, 3 tuần sau khi gây nhiễm, không thể xác định được virus ở các mô và swab ổ nhớp (cloacal swabs (CSs))

Từ 7 đến 9 tuần sau khi gây nhiễm, DNA của virus được xác định bằng phương pháp PCR trong hạch thần kinh Tác giả cho rằng đây là hiện tượng virus ở thể

ẩn DNA virus được xác định trong hạch lâm ba ngoại vi, lách, tuyến ức, túi Fabricius và hạch thần kinh trong điều kiện in vitro Đồng thời các tác giả cũng tiến hành dòng hoá, giải trình tự, tinh sạch và tìm hiểu đặc tính sinh học của phân đoạn protein UL24 của virus dịch tả vịt

Chanjuan Shen và cộng sự (2009) đã định vị phân bố protein UL51 của virus dịch tả vịt trong tế bào bằng sử dụng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Xuefeng Qi (2009) đã nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch ở niêm mạc ruột với sự gây nhiễm virus dịch tả vịt cường độc bằng phương pháp tinh sạch IgA Kết quả cho thấy các mức độ DNA của dịch tả vịt tiếp tục tăng trong máu và nhiều cơ quan khác Hơn nữa, IgA và IgG đặc hiệu dịch tả vịt tăng lên trong mật, huyết thanh và ruột Mật độ IgA trong ruột được xác định từ 1-12 ngày sau khi gây nhiễm Các tác giả kết luận gây nhiễm virus dịch tả vịt có thể kích thích cả IgA trong ruột và IgG trong huyết thanh

Đáng kể nhất là công trình nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của hệ gen virus dịch tả vịt của các tác giả Yufeng Li, Bing Huang, Xiuli Ma, Jing Wu, Feng Li, Wu Ai, Minxun Song và Hanchun Yang công bố vào tháng 9 năm

2009 Các tác giả đã xác định toàn bộ trình tự gen của virus dịch tả vịt Theo các tác giả, hệ gen của virus có độ dài là 158.091 bp, mã hoá 78 protein và có sự

tương đồng với những virus thuộc họ Alphaherpesvirinae về mặt tổ chức và kết hợp gen Hệ gen của virus bao gồm các vùng gen unique long (UL), unique short (US), unique short internal repeat (IRS) và unique short terminal repeat (TRS) Cách thức sắp xếp hệ gen (UL-IRS-US-TRS) tương ứng với D-type herpesvirus

và phù hợp với những thành viên của Varicellovirus và Iltovirus Phân tích trình

tự cho thấy hệ gen của virus chứa 67 gen tương đồng với những virus thuộc họ Alphaherpesvirinae Ngoài những gen này ra, có một gen tương đồng với herpesvirus 8 ở loài linh trưởng, là virus thuộc họ Betaherpesvirinae, và 5 gen tương đồng với herpesviruse ở gia cầm Mặt khác, hệ gen có 3 gen duy nhất không tương đồng với bất cứ một loại herpesvirus nào Giống hầu hết các thành viên thuộc họ Alphaherpesvirinae, những gen thuộc vùng gen UL có tính bảo tồn cao, trong khi trình tự sắp xếp gen IRS-US lại tương tự với virus gây bệnh Marek và herpesvirus 1 gây bệnh trên ngựa Do vậy, từ những dữ liệu phân tích

hệ gen, các tác giả đề nghị xếp virus gây bệnh dịch tả vịt vào họ Alphaherpesvirinae

1.2 Bệnh dịch tả vịt

Dịch tả vịt (Pestisanatum) là một bệnh truyền nhiễm có tính lây lan mạnh của loài thủy cầm do một loại Herpesvirus thuộc họ Herpesvirideae gây ra với đặc điểm là xuất huyết nội tạng và ỉa chảy nặng nề (Nguyễn Như Thanh, 2001)

1.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh

* Lịch sử bệnh

Bệnh dịch tả vịt xuất hiện vào năm 1923 tại Hà Lan với triệu chứng ủ rũ, khát nước và chết sau 1 ngày Baudet (1923) khi nghiên cứu về bệnh này và đi đến kết luận có thể nguyên nhân do một loại virus

Tiến hành nghiên cứu trên một ổ dịch mới, Bos.A (1943) xác định thêm một số đặc trưng của bệnh về bệnh tích, triệu chứng, đáp ứng miễn dịch của vịt

và khẳng định virus không gây bệnh cho gà, bồ câu, thỏ, chuột lang, chuột bạch

và mầm bệnh cũng không phải là virus gây bệnh dịch tả gà

Năm 1949, tại Hội nghị Thú y thế giới lần thứ XIV, Jansen và Kunst đã đề nghị gọi tên bệnh là Duck virus enteritis (DVE) (OIE, 2000)

* Phân bố bệnh

Tại Châu Âu, bệnh dịch tả vịt đã được Devos phát hiện ở Bỉ năm 1964 Năm 1970, Gaudry phát hiện bệnh dịch tả vịt ở Pháp; Asplin phát hiện bệnh ở Anh Bela Toth và Voxapeer Suwathanaviroij công bố bệnh dịch tả vịt xảy ra ở Đức Do sự lan rộng của virus cúm gia cầm nên chính phủ các nước châu Âu, đặc biệt là Đức đã đề cao biện pháp cách ly thủy cầm bằng lưới trong khoảng thời gian từ 20/10/2005-15/12/2005 Tuy nhiên tỷ lệ chết đã tăng đột biến trong những ngày này Tổng cộng có 17/124 (14%) loài chim trưởng thành và 149/184 (81%) loài chim 1 năm tuổi bị chết Phản ứng trung hòa sử dụng kháng huyết thanh dịch tả vịt đã phát hiện vịt và các loài chim chết do bệnh dịch tả vịt (Kaleta E.F và cộng sự, 2007)

Tại Châu Mỹ, bệnh dịch tả vịt được chẩn đoán lần đầu tiên ở tây bán cầu vào năm 1967 từ một vùng sản xuất vịt thương phẩm tập trung tại hạt Suffolk, New York (Leibovitz và Hwang, 1967) Vụ dịch đầu tiên xảy ra trên đàn thủy cầm hoang ở Mỹ xuất hiện vào tháng 1 và 2 năm 1973, tại hồ Andes, miền nam Dakota Vụ dịch này đã tấn công với sự tàn phá nhanh chóng và khốc liệt Gần 40% của 100.000 loài thủy cầm trú đông, hầu hết là vịt trời đã bị chết Vào thời

kỳ cao điểm của dịch, mỗi ngày chết hơn 1.000 chim Những mẫu máu được lấy

từ những vịt sống sót ở hồ Andes đã chỉ ra rằng có tới 30% số vịt đã bị phơi nhiễm virus

Tại Châu Á, năm 1944 bệnh xảy ra ở Ấn Độ và tái phát vào năm 1963 Năm

1968, Jansen công bố bệnh xảy ra ở Trung Quốc Năm 1976, 1977 bệnh đã phát ra ở Thái Lan gây thiệt hại tới 650.000 vịt (Voxapeer Suwathanaviroij, 1978)

Hình 1.1: Bản đồ phân bố bệnh dịch tả vịt trên thế giới (2011)

2002, bệnh xảy ra ở 33.831 vịt gây chết 15.680 con và năm 2004 số vịt chết vì bệnh dịch tả vịt là 22.447 (xem bảng 1.1)

Trong phòng thí nghiệm, vịt con là cảm nhiễm nhất đối với bệnh Virus

dịch tả vịt có khả năng nhân lên ở gà nhỏ hơn 2 tuần tuổi (Jansen, 1968)

1.2.2.2 Mùa vụ phát bệnh

Bệnh dịch tả vịt xảy ra nhiều nhất vào tháng 4-6 Sự bùng nổ dịch bệnh phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa sinh sản của vịt và ảnh hưởng của nhân tố stress (Sarmah R and Sarmah A.K., 1996)

Theo Phạm Sỹ Lăng (2002), ở Việt Nam, bệnh dịch tả vịt xảy ra quanh năm nhưng phát triển mạnh vào thời vụ chăn nuôi vịt và trùng với thời vụ thu hoạch lúa: Vụ chiêm tháng 5-6, vụ mùa tháng 10-11

1.2.2.3 Lứa tuổi mắc bệnh

Bệnh xảy ra ở vịt mọi lứa tuổi, tuy nhiên vịt từ 15 ngày tuổi trở đi bị nhiễm nhiều nhất (Nguyễn Xuân Bình, 2006)

1.2.2.4 Chất chứa virus

Ở vịt bị nhiễm bệnh, virus có trong máu, các cơ quan phủ tạng, nhiều nhất

là ở gan, lách và óc Tại Việt Nam đã nghiên cứu sự nhân lên của virus ở cơ thể vịt bị gây nhiễm nhân tạo Sau khi gây nhiễm virus 24 giờ, virus đã nhân lên, xâm nhập vào máu nhưng số lượng còn ít Đến 48 giờ, virus đã xuất hiện trong nước mắt, nước mũi Và đến 72 giờ, khi vịt bị bệnh nặng, bắt đầu ỉa chảy thì tế bào niêm mạc đường tiêu hoá do tác động của virus bị hủy hoại, tróc ra cùng với dịch tiết có nhiều virus, theo phân bài xuất ra ngoài (Trần Minh Châu, 1987) Vịt bệnh mang virus rất lâu và có thể tái phát bệnh ở thể ẩn tính Người ta có thể phát hiện bệnh bằng kiểm tra nốt rộp ở mặt dưới của lưỡi vịt

Shawky S., Schat K.A (2002) cho biết virus dịch tả vịt có thể tiềm tàng trong cơ thể vịt và có khả năng tái hoạt động trở lại Sau 3 tuần gây nhiễm không tìm thấy virus dịch tả vịt trong lỗ huyệt nhưng 7-9 tuần sau gây nhiễm, bằng phản ứng PCR, tác giả đã phát hiện thấy DNA virus dịch tả vịt trong thần kinh trung ương, hạch lâm ba ngoại vi, lách, tuyến ức và túi Bursa

1.2.2.5 Đường xâm nhập và cách lây lan

Trong thí nghiệm, có thể gây bệnh bằng cách tiêm dưới da, bắp thịt, tiêm tĩnh mạch hoặc nhỏ mũi Trong tự nhiên, đường xâm nhập chủ yếu của virus

dịch tả vịt là đường tiêu hoá Bệnh lây lan nhanh, mạnh theo phương thức truyền lây gián tiếp nhưng phương thức truyền lây trực tiếp từ mẹ sang con cũng có thể xảy ra (Burgess E.C and TM Yuill, 1981)

1.2.3 Triệu chứng và bệnh tích

1.2.3.1 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh đối với bệnh dịch tả vịt là 3-4 ngày, có thể dài hơn hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào bệnh lần đầu tiên xảy ra hay đã từng xảy ra đối với đàn vịt

Ở đàn vịt, nhiều con tự nhiên lờ đờ, rớt lại sau đàn Ở đàn vịt đẻ khi bệnh xuất hiện sản lượng trứng giảm xuống hoặc ngừng đẻ Vịt bệnh thường ủ rũ, bỏ ăn, đứng một chân, đầu rúc vào cánh Vịt thường sưng mi mắt, niêm mạc mắt đỏ Lúc đầu chảy nhiều nước mắt, sau nước mắt đặc lại có màu vàng như mủ đóng đầy khoé mắt Vịt bệnh có khi khó thở, tiếng thở khò khè Từ mũi chảy ra chất niêm dịch lúc đầu trong, sau đặc lại Nhiều con đầu sưng to, sờ nắn có cảm giác mềm như quả chuối chín Hầu, cổ cũng có thể sưng do tổ chức liên kết dưới da bị phù thũng Lúc mới bị bệnh, vịt khát nên uống nhiều nước Sau vài ngày vịt ỉa chảy, phân rất loãng,

có mùi khắm và có màu trắng xanh Hậu môn bẩn, lông dính bết đầy phân (Nguyễn Như Thanh, 2001)

1.2.3.2 Bệnh tích

Bệnh tích của bệnh dịch tả vịt đặc trưng là ở đường tiêu hoá có những chấm xuất huyết, nhiều nhất là ở cuống mề và trực tràng, bên trên phủ lớp màng giả khó bóc Ruột non xuất huyết thành những vòng nhẫn nhìn từ ngoài vào thấy

có màu nâu hoặc tím rất đặc trưng (Trần Minh Châu, 1996)

1.2.4 Chẩn đoán

Để chẩn đoán bệnh dịch tả vịt có nhiều phương pháp được sử dụng, dưới đây là quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả vịt theo tiêu chuẩn ngành của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 10 TCN 815-2006

1.2.4.1 Chẩn đoán lâm sàng

Dựa vào dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh

1.2.4.2 Chẩn đoán virus học

a Phát hiện virus

- Mẫu gan, lách, thận được xử lý thành huyễn dịch 10% với PBS (Phosphate Buffered Saline) có chứa 1.000.000 UI/lit Penicillin và 1.000 mg/lit Streptomycin

- Ly tâm 2.000 vòng/15phút Lấy dịch trong ở trên

- Kiểm tra vô trùng: Trên môi trường nước thịt BHI, hoặc trên môi trường thạch máu

b Phân lập virus

* Phân lập trên vịt con

Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm đã được xử lý như trên cho vịt con (0,7-1 kg) với liều 0,5 ml/con vào dưới da hay bắp lườn Nếu bệnh phẩm có virus dịch tả vịt, vịt sẽ biểu hiện triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả vịt giống như đã mô tả ở phần 1.1.3

* Phân lập trên trứng vịt có phôi

Tiêm 0,2 ml huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý vào xoang niệu mô hoặc màng nhung niệu phôi vịt 11-12 ngày Virus dịch tả vịt gây chết phôi sau 4-10 ngày với đặc trưng: Xuất huyết lan rộng Thu hoạch gan phôi và nước niệu để phân lập virus

* Phân lập trên tế bào xơ phôi vịt (Duck Embryo Fibroblast-DEF)

Cấy tế bào DEF trên các lọ nuôi cấy T25 hoặc đĩa nuôi cấy (đĩa nuôi cấy 6

lỗ, 24 lỗ), sau 2-3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70%) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý: 500µl/lỗ hoặc lọ Việc cấy chuyển 2 lần là cần thiết trong quá trình phân lập

Quan sát bệnh tích tế bào (CPE): đặc trưng với đám tế bào to, tròn và trở nên hoại tử sau 2-4 ngày sau đó

Thu hoạch hỗn dịch tế bào, đông tan, ly tâm và thu phần nước trong cho giám định virus

c Phương pháp giám định virus

* Phương pháp trung hòa trên trứng vịt có phôi (VN-Virus Neutralization)

- Chuẩn bị:

+ Pha loãng virus phân lập: Nồng độ 10-1-10-9 với dung dịch PBS

+ Lô đối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

+ Lô đối chứng âm: Trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

+ Ủ hỗn hợp trên ở nhiệt độ 370C/1giờ

Tính toán chỉ số trung hòa NI (neutralization index) Nếu kết quả phân lập

và giám định dương tính với kháng huyết thanh chuẩn (bằng phương pháp trung hòa VN), kết luận có virus dịch tả vịt

* Phương pháp trung hòa trên tế bào xơ phôi vịt (DEF)

- Chuẩn bị:

+ Tế bào DEF trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 lỗ đã nuôi cấy được 2-3 ngày + Pha loãng virus phân lập: các nồng độ 10-1-10-9 với môi trường MEM + Lô đối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

+ Lô đối chứng âm: trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

- Tiến hành:

+ Gây nhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đã nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 lỗ), 100µl/lỗ, 8 lỗ/nồng độ

+ Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C/1h

+ Đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100µl/lỗ

+ Tiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C

+ Kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE) trong 3-7 ngày với biểu hiện tế bào co tròn và tụ lại thành đám, thời gian lâu tế bào có hiện tượng hoại tử

- Đánh giá kết quả:

Tính toán chỉ số trung hòa NI (neutralization index) Nếu thủy cầm chưa tiêm phòng, phát hiện có kháng thể dịch tả vịt (bằng phương pháp trung hòa SN), kết luận thủy cầm đã nhiễm virus dịch tả vịt

1.2.4.3 Chẩn đoán bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Năm 1999, Pritchard L.I & cs đã phát triển phương pháp PCR để phục vụ cho việc phân lập virus dịch tả vịt ở Việt Nam Phương pháp này cho phép phân biệt nhanh và chính xác giữa bệnh dịch tả vịt với một số bệnh do Herpesvirus gia cầm khác gây nên như bệnh Marek, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm và bệnh do Herpesvirus gây ra ở ngỗng

Một phản ứng PCR gồm có 6 thành phần tham gia:

1) DNA làm khuôn;

2) Hai đoạn mồi (bao gồm mồi xuôi và mồi ngược);

3) Enzym DNA-polymerase chịu nhiệt;

4) Môi trường đệm cung cấp ion Magiê (Mg++);

5) Phần nucleotide ở dạng deoxynucleotide (ký hiệu dNTP);

6) Nước tinh khiết

Về nguyên lý, PCR là một phản ứng tổng hợp dây chuyền nucleic acid tương tự xảy ra trong cơ thể sinh vật Từ trình tự nucleotidee của mạch DNA khuôn mẫu với sự xúc tác của enzyme DNA polymerase, một mạch DNA mới được tổng hợp Quá trình này cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi

là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ

chỉ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa hai mồi này

Về cơ chế, phản ứng tổng hợp dây chuyền có sự xúc tác của enzyme DNA polymerase là sự hình thành cầu nối phospho-diester giữa nhóm OH đầu 3’ của đoạn oligonucleotidee mồi với nhóm Phosphate đầu 5’ mononucleotidee cần gắn vào và giải phóng pyrophosphate

Trong quá trình diễn ra phản ứng, trên lý thuyết, số lượng mạch DNA mới được tổng hợp phụ thuộc vào số lượng khuôn mẫu ban đầu và sẽ tăng lên theo cấp số nhân ở mỗi chu kỳ tiếp theo, do một mạch DNA được tổng hợp ở chu kỳ trước, sau khi biến tính, tham gia vào quá trình tổng hợp ở chu kì lại trở thành 2 khuôn mẫu để tạo nên 2 mạch DNA mới Như vậy khoảng 20 chu kì, số lượng bản sao mới được tổng hợp lên đến hàng triệu

Trên thực tế, quá trình phản ứng diễn ra rất phức tạp, không giống nhau ở mọi chu kì do sự thay đổi thành phần các chất tham gia phản ứng Ở đây là sự cân bằng thích hợp của các phân tử như sản phẩm mới được tổng hợp, khuôn mẫu, số lượng, hoạt tính DNA polymerase, mồi, các deoxyribonucleotidee Sự lai giữa các phân tử DNA bổ sung với nhau có thể xảy ra giữa mồi và khuôn mẫu, mồi và sản phẩm mới hoặc giữa sản phẩm mới với sản phẩm mới thay đổi theo mỗi chu kì

Mỗi chu kì của phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: giai đoạn biến tính, tất cả DNA mạch kép làm khuôn mẫu ban đầu hoặc sản phẩm mới được làm biến tính thành các mạch đơn bởi nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của các phân tử DNA, thường là 940C-950C với thời gian 30 giây-1 phút Ở nhiệt độ này các liên kết hydro giữa các base của 2 mạch

bổ sung bị phá hủy

Giai đoạn 2: Giai đoạn lai, bắt cặp xảy ra khi nhiệt độ được hạ thấp đến nhiệt độ thích hợp (thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi 50C) và mồi sẽ bắt cặp với khuôn mẫu Trong thực nghiệm nhiệt độ này trong khoảng 40-700C tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi sử dụng

Giai đoạn 3: Giai đoạn tổng hợp kéo dài nhiệt độ được tăng lên 720C là

nhiệt độ thích hợp nhất cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA polymerase kết hợp với phức hợp mồi-khuôn nhận các deoxyribonucleotidee tự

do ngoài môi trường gắn vào đầu 3’của mồi và kéo dài sản phẩm (Kidd and Ruano, 1995)

Hình 2.1: Các giai đoạn của phản ứng PCR

Sản phẩm của PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose nồng độ 0,8%-2%,

Kỹ thuật điện di trên gel là hết sức quan trọng đối với người làm kỹ thuật

di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một đặc tính là các phân tử acid nucleic ở pH trung tính, chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester

của các sợi acid nucleic Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic

sẽ chuyển dịch về cực dương Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch đặc biệt khác, các phân tử acid nucleic tùy theo kích thước sẽ chuyển dịch với các tốc độ khác nhau: loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn Kiểu loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử acid nucleic, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel Có hai loại gel được

sử dụng phổ biến là agarose và polyacrylamid Agarose được chiết xuất từ tảo biển, có thể mua ở dạng bột khô, bị nóng chảy ở nhiệt độ trên 450C, trong dung dịch đệm ở nồng độ thích hợp, thường trong khoảng 0,3-2,0% (w/v) Khi làm nguội (dưới 450C), agarose đông lại thành gel Gel agarose thường được dùng để chạy trong máy điện di Gel polyacrylamid thường được dùng để phân tách các phân tử acid nucleic có kích thước nhỏ hơn Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó Trạng thái đó được duy trì cho đến khi chất nhuộm đánh dấu (xanh Bromophenol) bổ sung vào mẫu trước khi đưa vào gel chạy tới đầu cuối của gel Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại Kích thước các băng DNA được so sánh với chỉ thị di truyền DNA (DNA marker) được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR (Lê Thanh Hoà, 2002)

Theo Vũ Minh Thục (2004), nhược điểm chính của phương pháp PCR là

sự nhạy cảm khác thường của chúng, làm cho chúng rất dễ có kết quả “dương tính sai” và thường diễn ra bởi một số lượng nhỏ DNA bị nhiễm chéo trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, riêng với bệnh dịch tả vịt, Hansen (1999) đã khẳng định sự đặc trưng của đoạn mồi đã được kiểm tra với bộ gen khuôn mẫu của các loại Herpesvirus gây bệnh ở gia cầm khác như đại bàng, chim câu, gà Kết quả cho thấy sự khuếch đại vẫn không cho sản phẩm Điều này có nghĩa là phản ứng này đặc hiệu rất cao cho DNA của virus dịch tả vịt Với hai đoạn mồi sẽ có khả

năng phát hiện 1 fg của DNA từ virus dịch tả vịt và phản ứng PCR được đánh giá là nhạy bén hơn gấp 20 lần so với việc chẩn đoán bệnh dịch tả vịt bằng nuôi cấy

tế bào

1.2.5 Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt

1.2.5.1 Biện pháp can thiệp

Bệnh dịch tả vịt là bệnh không chữa được Tuy nhiên với đàn vịt mới chớm mắc vài con thì có thể can thiệp bằng cách vacxin nhược độc cho toàn đàn Những vịt chưa bị nhiễm virus nặng sẽ được bảo hộ bằng hiện tượng cản nhiễm Nếu tiêm sớm và kết hợp với chăm sóc đàn vịt tốt thì có thể cứu được tới 90% vịt (Trần Minh Châu, 1980) Nên tăng cường thêm các biện pháp chăm sóc bồi dưỡng nhằm tăng cường sức đề kháng cho vịt (sử dụng chất điện giải và vitamin)

Theo Archie Hunter (2002) nếu có ổ dịch xảy ra, vịt khoẻ mạnh có tiếp xúc với mầm bệnh phải được tiêm phòng vì vịt phát triển miễn dịch chỉ trong một ngày sau khi tiêm phòng

- Điều kiện nuôi dưỡng tốt, máng ăn, máng uống phải sạch sẽ Thức ăn, nước uống phải vệ sinh Thực hiện tiêu độc, sát trùng dụng cụ, chuồng trại giữa hai lứa vịt Chú ý tiêu diệt chuột và các loài gặm nhấm quanh khu vực trại

- Vịt mới mua về phải nuôi cách ly ít nhất 3 tuần lễ

* Tiêm phòng bằng vacxin

-Vacxin vô hoạt:

Để vô hoạt virus dịch tả vịt, trước đây thường dùng hoá chất là formol, gần đây sử dụng chất BPC (β propiolactone) Tại Việt Nam đã chế thử vacxin vô hoạt như: vacxin dịch tả vịt gan máu glyxerin tím, vacxin formol gan Theo OIE (2000) vacxin vô hoạt tạo được miễn dịch cho đàn vịt nhưng hiệu lực thấp hơn

so với vacxin nhược độc, hiện nay vacxin vô hoạt chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng trong sản xuất

- Vacxin nhược độc:

Ngày nay người ta thường sử dụng chủng virus vacxin là virus dịch tả vịt nhược độc thích nghi trên phôi vịt và virus dịch tả vịt chủng Jansen thích nghi trên phôi gà và trên nuôi tế bào Fibroblast phôi gà một lớp Đây là 2 loại vacxin

có độ an toàn cao và hiệu lực tốt, thời gian miễn dịch dài, sau khi tiêm vacxin 9 tháng vịt vẫn còn miễn dịch Vacxin sử dụng an toàn với cả vịt con một ngày tuổi Vacxin được chế biến dưới 2 dạng vacxin tươi và vacxin đông khô (Lê Hồng Mận, 1999)

- Với đàn vịt ở vùng dịch bị uy hiếp, cần tiêm phòng cho vịt con ngay sau khi vịt nở

- Vịt nuôi thịt chỉ cần tiêm phòng 1 lần Ở nơi không bị dịch uy hiếp, có thể tiêm phòng cho vịt vào lúc vịt từ 2-3 tuần tuổi

- Theo Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn việc tiêm phòng vacxin bắt buộc đối với bệnh dịch tả vịt gồm:

Đối tượng tiêm phòng: Vịt, ngan các lứa tuổi

Phạm vi tiêm phòng: Các cơ sở chăn nuôi tập trung, chăn nuôi hộ gia đình trong phạm vi cả nước

Tiêm phòng định kỳ mỗi năm 2 lần, tuỳ theo lứa tuổi

Liều lượng, đường tiêm, gia cầm trong diện tiêm theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất vacxin

1.3 Virus gây bệnh dịch tả vịt

Virus gây bệnh dịch tả vịt là loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae

nhóm Herpesvirus Virus chỉ có một serotyp được biết đến nhưng có nhiều chủng có độc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên (Nguyễn Như Thanh, 2001) Theo Li H., Liu S., Kong X (2006) virus gây bệnh dịch tả vịt có thể được phân loại vào phân họ Alphaherpesvirinae trong họ Herpesviridae

1.3.1 Hình thái và kích thước

Nhìn qua kính hiển vi điện tử thấy virus dịch tả vịt có hình thái gần tròn,

có lớp vỏ bọc bên ngoài và có một lõi ở giữa Ở những tế bào được gây nhiễm virus, sau 24 giờ thấy các hạt vùi trong nhân và nguyên sinh chất Đó là những tập hợp không có hình thù, trông giống như bụi Trong nhân của những tế bào có hay không có thể vùi xuất hiện những khoảng trống, ở đó có những virus hoặc tập hợp virus có capxit hình cầu hoặc sáu cạnh Nucleocapxit có đường kính là 93,5 nm; Sau khi qua màng vào nguyên sinh chất đường kính của hạt virus tăng lên

có thể đo được 136 nm và thành thục ở không bào với đường kính 250 nm (Nguyễn Như Thanh, 2001)

Virus dịch tả vịt qua được lọc Chamberland, Berkefeld nhưng không qua được màng lọc Seitz Bằng phương pháp lọc qua màng lọc; Hess và Dardini (1968) đã nhận xét, virus dịch tả vịt nhược độc chủng Jansen và virus cường độc

có kích thước 150-250 nm

1.3.2 Sức đề kháng

Theo Nguyễn Như Thanh (2001), Virus mẫn cảm với ether, chloroform Cồn 750 diệt vi khuẩn trong 5-30 phút Ở 220C NaOH 2%, NH4OH 0,5% cũng diết chết virus sau 30 phút Virus ổn định ở pH từ 5-10 và bất hoạt khi pH < 3 và pH> 10

Virus đề kháng kém với sức nóng: virus bị diệt ở 300C sau 2 giờ, ở 700C sau 20 phút; 800C trong 5 phút Trong điều kiện lạnh -100C đến -200C virus có thể tồn tại hàng năm Làm đông khô các chất chứa virus như máu, tim, gan, màng nhung niệu của phôi trứng vịt có thể giữ virus nhiều năm mà không mất hiệu lực

Trong điều kiện tự nhiên, virus có thể tồn tại một thời gian khá dài tới 30

ngày (OIE, 2006), 5 ngày kể từ khi con vật cuối cùng chết vẫn có thể làm lây bệnh cho vịt khoẻ nếu nhốt nó vào chuồng cũ (Trần Minh Châu, 1987)

Năm 2005, tác giả Nguyễn Ngọc Điểm cũng đã phân lập thành công chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 Qua bước đầu khảo sát đặc tính sinh học của chủng virus này tác giả cho biết virus dịch tả vịt chủng VG-2004 có độc lực mạnh hơn virus dịch tả vịt chủng 769 do tác giả Trần Minh Châu phân lập

1.3.4 Đặc tính nuôi cấy

1.3.4.1 Nuôi cấy trên phôi

Theo Nguyễn Như Thanh (2001), nuôi cấy virus trên màng niệu đệm hoặc xoang niệu mô của thai vịt ấp 12 ngày, thai sẽ chết sau 4-6 ngày với các bệnh tích xuất huyết trên da vùng lưng, rìa cánh, đầu; gan và quả tối có điểm xuất huyết và hoại tử Một số phôi có biểu hiện phù, một số phôi có hiện tượng màng nhung niệu sưng dày

Virus dịch tả vịt có thể cảm nhiễm với phôi ngỗng ấp 12 ngày tuổi và giết chết phôi sau 3-5 ngày Virus cường độc dịch tả vịt ít mẫn cảm ở những lần cấy truyền đầu tiên trên phôi gà Đối với phôi gà 9-10 ngày tuổi phải tiếp truyền virus sau ít nhất 12 đời liên tiếp virus mới thích nghi

Qua nhiều lần cấy truyền virus trên phôi vịt, phôi gà độc lực của virus sẽ giảm dần với vịt Người ta sử dụng những chủng virus nhược độc này qua phôi

gà, phôi vịt để chế tạo vacxin

1.3.4.2 Nuôi cấy trên tế bào

Virus dịch tả vịt có thể nuôi cấy trên môi trường tế bào phôi vịt, phôi gà một lớp và gây ra biến đổi bệnh lý cho tế bào (Jansen, 1968) Burgess (1981) công bố virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên trên loại tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan, gan phôi ngan, xơ phôi gà Theo Ronald Atlanasio thì không quan sát thấy biến đổi bệnh lý tế bào khi nuôi cấy virus trên tế bào thận lợn dòng PK 15,

tế bào WI-38, RD Hela, Hep-2, Vero, LleMK, BGM và BD (Trần Minh Châu, 1987)

Ở Việt Nam, khi nghiên cứu nuôi cấy virus cường độc trên tế bào xơ phôi vịt, sau 36 giờ có hiện tượng tế bào co tròn lại, thoái hoá và rụng khỏi thành bình tạo thành khoảng trống, xung quanh là những hợp bào (synciticum) như những dải đăng ten Lớp tế bào này sẽ bị phá hủy hoàn toàn vào ngày thứ 4 Riêng đối với virus nhược độc chủng Jansen, virus rất thích ứng trên môi trường tế bào xơ phôi gà Chỉ sau 24 giờ nuôi cấy virus, tế bào đã bắt đầu có hiện tượng hủy hoại

Tế bào bị biến dạng, co tròn, phình to ra, tập trung thành từng đám và có thể nhìn rõ dưới kính hiển vi quang học (Nguyễn Như Thanh, 2001)

Trong các bình nuôi cấy virus ở nồng độ loãng, có thể phát hiện được Plague (những ổ tế bào bị virus gây thoái hoá bằng cách nhuộm lớp tế bào với dung dịch fushin kiềm hoặc đỏ trung tính hoặc tím kết tinh (Nguyễn Lân Dũng, 1972) Nếu nhuộm bằng fushin kiềm trong vài giây, sẽ quan sát thấy Plague hiện ra trên nền đỏ, hình tròn, bờ không gọn và có đường kính 1-2 mm (Trần Minh Châu, 1987)

Theo Dardini và Hess (1968) Plague của virus dịch tả vịt cường độc hình tròn, to nhỏ không đều, có đường kính từ 1-8 mm Plague của virus dịch tả vịt nhược độc thì đều hơn, có bờ gọn và sáng, đường kính là 3-4 mm Nguyễn Như Thanh (2001) mô tả, với các chủng virus nhược độc, Plague đều, gọn và sáng rõ, ở ngày thứ 3 có đường kính 3 mm, sau 6 ngày là 4-7 mm và sau 14 ngày sẽ là 10 mm

1.3.4.3 Nuôi cấy trên động vật thí nghiệm

Có thể dùng vịt con 1 ngày tuổi để nuôi cấy virus 3-12 ngày sau vịt chết

với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh Ngoài vịt con có thể dùng ngan con, ngỗng con, gà con mới nở để gây bệnh

1.4 Miễn dịch chống virus dịch tả vịt

1.4.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

Khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của vịt đối với virus dịch tả vịt thể hiện bằng sự sản sinh các chất miễn dịch không đặc hiệu, bao gồm: Interferon, Tế bào NK và các loại bổ thể có vai trò khởi phát viêm và opsonin hoá các yếu tố gây bệnh Từ đó tạo điều kiện cho các tế bào thực bào bắt nuốt, tiêu diệt và trình diện kháng nguyên

* Miễn dịch chủ động nhân tạo

Vịt có được khả năng miễn dịch này nhờ được tiêm vacxin Hiệu lực và

độ dài đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại vacxin, đường đưa vacxin vào cơ thể, Trên thực tế, khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn vịt khi sử dụng vacxin dịch tả vịt vô hoạt thấp hơn khi dùng vacxin nhược độc Việc tiêm nhắc lại nhiều lần hoặc tiêm nhắc lại với số lượng lớn kháng nguyên làm sản sinh ra một lượng kháng thể lớn hơn (Fenner, 1974) Về đường đưa vacxin, Shawky S.A & Sandhu T.S (1997) cho rằng đường đưa vacxin vào cơ thể tốt nhất là tiêm bắp hoặc tiêm dưới da

* Miễn dịch bị động tự nhiên

Kháng thể của vịt mẹ được truyền cho vịt con qua lòng đỏ trứng Lượng kháng thể dịch tả vịt ở trong lòng đỏ cao hay thấp phụ thuộc vào hàm lượng

kháng thể trong huyết thanh vịt mẹ Ở những vịt con một ngày tuổi, hàm lượng kháng thể dịch tả vịt trong máu xấp xỉ bằng hàm lượng kháng thể trong lòng đỏ Theo thời gian, hàm lượng kháng thể sẽ giảm dần và chỉ tồn tại ở vịt con tối đa

là tới ngày 21 Ngoài ra, dù vịt con có được hưởng kháng thể từ vịt mẹ, nhưng nếu bị nhiễm nhiều virus thì vẫn có thể bị chết vì bệnh dịch tả vịt Như vậy, kháng thể do vịt mẹ truyền cho chỉ có thể bảo vệ được vịt con trong những ngày đầu sau khi nở nếu chúng bị nhiễm một lượng virus rất ít (Fenner, 1974), (Leibovitz, 1991)

* Miễn dịch bị động nhân tạo

Là trường hợp can thiệp vào đàn vịt (đã bị mắc bệnh dịch tả vịt tự nhiên) bằng kháng thể dịch tả vịt Tuy nhiên, việc tạo miễn dịch dạng này không tồn tại lâu trong cơ thể và cũng không mang lại nhiều ý nghĩa trong thực tiễn

1.4.2.2 Các loại kháng thể chống virus dịch tả vịt

* Kháng thể dịch thể:

Là các Globulin miễn dịch hoạt động chủ yếu khi virus còn ở ngoài tế bào như trong máu Chúng phong bế sự hấp thụ virus với receptor tương ứng trên bề mặt tế bào, ngăn cản sự hòa màng giữa vỏ virus với màng tế bào và tiêu diệt bằng kết hợp kháng nguyên-kháng thể, có thể có sự tham gia của bổ thể IgA hoạt động tại dịch tiết niêm mạc, diệt virus ngay tại hàng rào niêm mạc tại cửa ngõ cơ thể Vai trò kháng thể dịch thể chống virus đặc biệt quan trọng trong giai đoạn sớm của quá trình nhiễm Khi phức hợp kháng nguyên-kháng thể bị nuốt vào bên trong tế bào thực bào thì kháng thể đặc hiệu còn ngăn cản virus phá vỡ màng của hốc thực bào, phá mạng phân tử vỏ virus và ngăn không cho chúng tái sao được nữa

Tính đặc hiệu khá cao của kháng thể dịch thể đã giúp cho việc xác định typ của chủng gây bệnh nhờ vào huyết thanh học Hiệu quả của một số vacxin cũng nhờ vào cơ chế này Nhưng đáp ứng dịch thể cũng bị hạn chế do chúng chỉ

có tác dụng nếu xảy ra trong thời gian ngắn khi virus chưa ẩn mình trong tế bào; đôi khi chúng không có tác dụng tiêu diệt vì chúng chỉ chống lại những epitop

không quan trọng của virus gây bệnh Cụ thể trong thực nghiệm đã cho thấy các kháng thể này không gây nổi miễn dịch thụ động trên những con vật đã được mẫn cảm mà chỉ có kháng thể dịch thể (Vũ Triệu An, 1997) Trong miễn dịch dịch thể, hàm lượng kháng thể sinh ra nhiều hay ít phụ thuộc vào loại kháng nguyên được sử dụng, số lượng kháng nguyên, số lần được kích thích, và khả năng đáp ứng miễn dịch của con vật Đối với bệnh dịch tả vịt, lượng kháng thể dịch thể được sinh ra trong những trường hợp vịt bị nhiễm bệnh tự nhiên thường thấp và chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn Vịt được tiêm vacxin nhược độc có kháng thể thấp còn vịt bị nhiễm virus cường độc thì hàm lượng kháng thể cao hơn

* Miễn dịch tế bào:

Đáp ứng miễn dịch tế bào là phương thức bảo vệ chính của cơ thể chống lại virus thông qua những tế bào lympho độc Tc (hay CTL: Cytotoxic T Lymphocyte) Đa số các tế bào này mang dấu ấn CD8+ (Cluster of Differenciation 8+: glycoprotein bề mặt tế bào thường có trên tế bào Tc nhận biết phân tử MHC lớp I trên tế bào đích) và hoạt động theo cơ chế có hạn chế bởi MHC (Major Histocompatibility Complex: phức hòa hợp mô - những phân tử có mặt trên tế bào làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên) nghĩa là chúng chỉ có tác dụng khi tế bào bị nhiễm mang cùng phân tử MHC I Hầu hết các tế bào trong cơ thể đều có phân tử MHC I nghĩa là có thể bị Tc tấn công khi có nhiễm virus Cơ chế hoạt động của CTL là gây chết tế bào bị nhiễm theo chương trình (apoptosis) đồng thời tiết cytokin như IFN (Interferon), TNF (Tumoz necrosin factor: yếu tố hoại tử u) để ức chế virus tái sao và hoạt hoá những tế bào khác tăng biểu lộ các phân tử MHC Nhưng chính cơ chế này trong một số trường hợp lại gây ra một

sự phá hủy tế bào rộng lớn hơn Trong nhiều trường hợp sự phối hợp của cả hai đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào là nguyên nhân của trạng thái bệnh lý nặng nề Guiping Y and cs (2007) bước đầu nghiên cứu về khả năng chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào lympho ở vịt đã kết luận rằng: Quá trình chết theo chương trình và hoại tử của tế bào lympho gây ra bởi

sự tiêm truyền virus dịch tả vịt dẫn đến sự phân hủy tế bào lympho Sự chết theo chương trình của tế bào lỵmpho có thể đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của bệnh dịch tả vịt

Đáp ứng miễn dịch tế bào có vai trò quan trọng trong miễn dịch của cơ thể với virus dịch tả vịt Qua kết quả nghiên cứu của Jansen thấy rằng: Một số vịt sau khi được tiêm vacxin có hàm lượng kháng thể dịch thể rất thấp nhưng khi đem thử thách với virus dịch tả vịt cường độc thì vẫn được bảo hộ Jansen cho rằng trường hợp này rõ ràng có vai trò đáng kể của kháng thể tế bào và nhấn mạnh đến tầm quan trọng của việc dùng virus cường độc để thử hiệu lực vacxin

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

2.1.1 Kiểm tra một số đặc tính sinh học của chủng gốc virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 sau thời gian bảo tồn 3 năm ở -86 0

2.1.4 Nghiên cứu đánh giá chỉ tiêu an toàn và hiệu lực của hỗn dịch kháng nguyên virus dịch tả vịt nhược độc DP -EG -2000

2.1.5 Nghiên cứu các điều kiện bảo tồn virus dịch tả vịt nhược độc

Chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH-EG-2000 dùng làm đối chứng kiểm tra tạp nhiễm viêm gan vịt

Chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-2009 dùng để kiểm tra hiệu lực của hỗn dịch virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000

Ba chủng virus trên do Bộ môn VSV-TN khoa Thú y Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp

Vịt các lứa tuổi (vịt con, vịt 35-60 ngày, vịt đẻ) ngoài thực địa để kiểm tra

an toàn và hiệu lực của hỗn dịch kháng nguyên virus dịch tả vịt DP-EG-2000

2.2.4 Dụng cụ và hóa chất phòng thí nghiệm

a Máy móc:

- Tủ lạnh âm: -15 đến -200C, tủ lạnh thường: +2 đến +80C, tủ ấm

- Nồi đun cách thuỷ

- Buồng cấy BSC (Bio-safety cabinet)

- Máy ly tâm, đèn soi trứng, tủ ấp trứng…

- Micropipet nhiều đầu (8-12): 5-50, 50-300 ml

- Cối chày sứ, khăn bông, dao, kéo, panh kẹp