- Kiểm tra tạp nhiễm virus viêm gan vịt: Chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR sử dụng hai đoạn mồi DH3F và DH4R để xác định vùng gen VP1 của hệ gen virus viêm gan vịt.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Mồi xuôi Duck DH3F: 5/ GCCCCACTC TATGGAAAT TTG 3/
Mồi ngược Duck DH4R: 5/ ATTTGGTAC GATTCAATT TCC 3/
- Kiểm tra tạp nhiễm những virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu như virus Newcastle và virus cúm gia cầm: Thực hiện phản ứng HA.
+ Chuẩn bị: Hỗn dịch virus và hồng cầu gà 1%: Lấy 10 ml máu tim gà + 5ml xitrat natri 5% để chống đông. Ly tâm 2.000 vòng/phút, hút bỏ nước phía trên đi, thu lấy hồng cầu đặc. Cho PBS vào rửa hồng cầu, ly tâm, hút bỏ phần nước trong (làm như vậy 3 lần). Lấy 1 ml hồng cầu gà + 99 ml nước sinh lý, lắc nhẹđược dung dịch hồng cầu gà 1%.
+ Tiến hành: Trên đĩa 96 giếng đáy chữ v theo các bước Cho 50 µl PBS vào giếng từ 1-12.
Cho 50 µl hỗn dịch kháng nguyên vào giếng 1. Pha loãng kháng nguyên theo bậc 2; Chuyển 50 µl từ giếng 1 sang giếng 2. Trộn đều hỗn dịch giếng 2, hút 50 ml từ giếng 2 sang giếng 3, trộn đều. Tiếp tục làm như vậy đến giếng 11, hút 50ml bỏđi.
Giếng 12 làm đối chứng chỉ chứa 50 µl PBS. Cho 50 µl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng.
Lắc nhẹ tấm nhựa, để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm sau 20 phút đọc kết quả.
+ Phản ứng dương tính: Hồng cầu bị ngưng kết nằm rải đều ở đáy giếng như chiếc dù lộn ngược. Chứng tỏ trong hỗn dịch kháng nguyên có chứa virus gây ngưng kết hồng cầu.
Hiệu giá của phản ứng ngưng kết hồng cầu: Hiệu giá của phản ứng HA là
độ pha loãng virus lớn nhất mà ở đó vẫn còn một lượng virus có khả năng làm ngưng kết hồng cầu. Người ta gọi đó là một đơn vị HA.
+ Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn, nước bên trên trong nhưđối chứng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36