hiệu quả phòng trị bệnh héo xanh do ralstonia solanacearum và bệnh thán thư do colletotrichum spp gây ra trên ớt của chế phẩm sinh học bacillus spp

TRƯỜNG ÐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT Chứng nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo vệ thực vật với tên đề tài: HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BỆNH HÉO XANH

Cần thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

HUỲNH THANH TOÀN

HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BỆNH HÉO XANH DO

RALSTONIA SOLANACEARUM VÀ BỆNH THÁN

THƯ DO COLLETOTRICHUM SPP GÂY RA

TRÊN ỚT CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC

BACILLUS SPP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Tên đề tài:

HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BỆNH HÉO XANH DO

RALSTONIA SOLANACEARUM VÀ BỆNH THÁN

THƯ DO COLLETOTRICHUM SPP GÂY RA

TRÊN ỚT CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC

BACILLUS SPP

Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS Trần Vũ Phến Huỳnh Thanh Toàn

MSSV: 3103693

Cần thơ, 2014

TRƯỜNG ÐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Chứng nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo vệ thực vật với tên đề tài:

HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BỆNH HÉO XANH DO

RALSTONIA SOLANACEARUM VÀ BỆNH THÁN

THƯ DO COLLETOTRICHUM SPP GÂY RA

TRÊN ỚT CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC

BACILLUS SPP

Do sinh viên Huỳnh Thanh Toàn thực hiện

Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Cán bộ hướng dẫn

TRƯỜNG ÐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư chuyên ngành Bảo vệ thực vật với tên đề tài:

HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BỆNH HÉO XANH DO

RALSTONIA SOLANACEARUM VÀ BỆNH THÁN

THƯ DO COLLETOTRICHUM SPP GÂY RA

TRÊN ỚT CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC

BACILLUS SPP

Do sinh viên Huỳnh Thanh Toàn thực hiện và bảo vệ trước Hội đồng

Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:………

Luận văn tốt nghiệp được Hội đồng đánh giá ở mức………

Chủ tịch Hội đồng

Tóm tắt quá trình học tập của bản thân:

1999 – 2003: là học sinh Truờng Tiểu Học Bình Tấn

2004 – 2006: là học sinh Trường Trung Học Cơ Sở Bình Tấn

2006 – 2007: là học sinh Trường Trung Học Cơ Sở Tràm Chim

2007 – 2010: là học sinh Trường Trung Học Phổ Thông Tràm Chim

2010 – 2014: là sinh viên ngành Bảo Vệ Thực Vật khóa 36, khoa Nông Nghiệp

và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Ðại Học Cần Thơ

Xin được chân thành cảm ơn các Thầy, Cô khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng và tất cả Thầy, Cô Trường Ðại Học Cần Thơ đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức quý báo cho em trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường Xin được mãi mãi ghi ơn các Thầy, Cô!

Chân thành biết ơn!

Anh Huỳnh Văn Nghi và tất cả các anh, chị trong Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật đã tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt thí nghiệm

Các bạn lớp BVTV K36, các anh, chị cao học K18, K19, các bạn sinh viên K37, K38 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Trân trọng !

Huỳnh Thanh Toàn

LỜI CAM ÐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào trước đây

Tác giả luận văn

Huỳnh Thanh Toàn

Huỳnh Thanh Toàn, 2014 “Hiệu quả phòng trị bệnh héo xanh do vi khuẩn

Ralstonia solanacearum và bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra trên

ớt của chế phẩm sinh học Bacillus spp.” Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo Vệ Thực

Vật, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường

Ðại học Cần Thơ Cán bộ hướng dẫn TS Trần Vũ Phến

TÓM LƯỢC

Đề tài “Hiệu quả phòng trị bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia

solanacearum và bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra trên ớt của chế phẩm sinh học Bacillus spp.” được thực hiện nhằm chọn được dạng chế phẩm với tỉ

lệ phần trăm nội bào tử thích hợp có khả năng kiểm soát và phòng trị bệnh héo xanh

do vi khuẩn Ralstonia solanacearum và bệnh thán thư do Colletotrichum spp gây ra

và kích thích tăng trưởng cây trồng

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm, khu nhà lưới bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Ðại học Cần Thơ và xã Tân Bình, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long từ tháng 3/2013 đến tháng 1/2014

Kết quả khảo sát hiệu quả của chế phẩm sinh học (Bacillus spp.) trong quản lý bệnh héo xanh trên ớt do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trong điều kiện nhà lưới

kết hợp với thí nghiệm ngoài đồng cho thấy các chế phẩm với tỉ lệ nội bào tử lần lượt

là 5%, 50%, 100% đều có khả năng kiểm soát bệnh héo xanh và có khả năng kích thích tăng trưởng cây ớt Vào thời điểm 21 NSCB, chế phẩm 5%, 50%, 100% có khả năng kháng bệnh tốt với tỉ lệ bệnh lần lượt 12,0%, 0%, 0%

Đối với bệnh thán thư trên ớt do Colletotrichum spp gây ra, kết quả thí nghiệm

trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy cả 3 dạng chế phẩm với tỉ lệ nội bào tử

Bacillus spp khác nhau đều có hiệu quả trong kiểm soát bệnh thán thự trên trái ớt, trong đó chế phẩm 100% nội bào tử có hiệu tốt nhất và biện pháp xử lý phun vi khuẩn trước và sau khi chủng bệnh là có hiệu quả nhất trong phòng trị bệnh thán thư

Từ khóa: Bệnh héo xanh, bệnh thán thư ớt, Colletotrichum, Ralstonia solanacearum,

Vi khuẩn vùng rễ

1.3.3 Đặc tính 6 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh thán thư 7

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả của chế phẩm sinh học

(Bacillus spp.) quản lý bệnh héo xanh trên ớt do vi khuẩn R

solanacearum

17

2.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu quả của chế phẩm sinh học

(Bacillus spp.) đối với bệnh héo xanh trên ớt do vi khuẩn R

solanacearum gây ra trong điều kiện ngoài đồng

21

2.2.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả của chế phẩm sinh học

(Bacillus spp.) đối với bệnh thán thư trên ớt do nấm Colletotrichum

spp gây ra

22

3.1 Khả năng phòng trị bệnh héo xanh cây ớt trong điều kiện nhà lưới 25

3.1.2 Chỉ số bệnh héo xanh của cây ớt 26

3.1.4 Diễn biến mật số của vi khuẩn gây bệnh R solanacearum trong

3.2 Sự sống sót của vi khuẩn vùng rễ trong đất sau khi được xử lý 31

3.4 Hiệu quả phòng trị sinh học bệnh thán thư trên ớt của chế phẩm sinh

DANH SÁCH BẢNG

2.2 Cấp bệnh héo xanh (dựa theo He et al (1983) và Deberdt et al.,

3.1 Diễn biến tỉ lệ bệnh của các nghiệm thức qua các thời điểm quan sát 25

3.2 Diễn biến chỉ số bệnh của các nghiệm thức qua các thời điểm quan

5 cfu/g đất) của R solanacearum ở các thời điểm khảo

3.6 Mật số ( x 105 cfu/g đất) của các nghiệm thức xử lý chế phẩm ở các

3.7 Diễn biến chiều cao thân của cây ớt (cm) ở các nghiệm thức quan sát 34

3.8 Trọng lượng thân và rễ sau khi sấy của các nghiệm thức (g/lặp lại 3

3.12 Năng suất trái của các nghiệm thức 40

3.13 Đường kính vết bệnh thán thư trên ớt của các nghiệm thức tại thời

3.14 Đường kính vết bệnh thán thư trên ớt của các nghiệm thức tại thời

3.15 Đường kính vết bệnh thán thư trên ớt của các nghiệm thức tại thời

2.3 Khuẩn lạc nấm Colletotrichum nuôi trên đĩa petri để tạo bào tử 24

3.1 Triệu chứng bệnh héo xanh ở nghiệm thức ĐC 1 so với nghiệm

3.2 Vi khuẩn R solanacearum khi chà trên môi trường TZC ở giai

3.3 Sự hiện diện vi khuẩn vùng rễ của chế phẩm sinh học ban đầu bổ

3.4 Chiều cao cây của các nghiệm thức ở thời điểm 28 ngày sau khi

3.5 Năng suất trái ở các nghiệm thức trong lần đầu tiên thu hoạch 37

TỪ VIẾT TẮT

R solanacearum Ralstonia solanacearum

B amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens

GIỚI THIỆU

Sản phẩm từ cây ớt (Capsicum frutescens L.) là nông sản có giá trị kinh tế cao vì

không chỉ là gia vị tươi mà còn được sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm

và làm dược liệu để bào chế thuốc, Do nhu cầu thị trường trong nước và xuất khẩu tăng, diện tích trồng ớt gần đây có chiều hướng gia tăng (Trần Văn Hai, 2005) Theo

số liệu của FAO (2011), ở nước ta, diện tích trồng ớt là 64 nghìn ha, với sản lượng đạt

90 nghìn tấn Tuy nhiên, việc canh tác ớt thường gặp nhiều khó khăn do mầm bệnh tấn công như bệnh khảm do virut, bệnh héo cây con, bệnh thối đọt non… Ðặc biệt là bệnh

héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra, vi khuẩn này có phạm vi kí chủ

rộng và lưu tồn rất lâu trong đất, bệnh thường phát triển và gây hại nặng trong điều kiện nhiệt độ cao, mùa mưa (Phạm Văn Kim, 2000; Hà Viết Cường, 2008) Bên cạnh

đó, bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp cũng là một bệnh hại quan trọng trên ớt,

nấm tồn tại trên hạt giống dưới dạng sợi nấm và bào tử phân sinh và trên tàn dư cây bệnh Bào tử phân sinh có sức sống cao, trong điều kiện khô mặc dù tàn dư bị vùi

trong đất vẫn có thể nảy mầm vào vụ sau (Vũ Triệu Mân, 2007)

Hiện nay, biện pháp phòng trừ hai bệnh này chủ yếu là dùng thuốc hóa học, nhưng việc phòng trị bệnh héo do vi khuẩn bằng hóa chất là rất khó khăn và không hiệu quả, bên cạnh đó việc sử dụng nông dược quá mức sẽ làm ô nhiễm môi truờng, ảnh hưởng đến sức khỏe con nguời Do đó, các biện pháp phòng trừ bệnh bằng tác nhân sinh học đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Theo kết quả nghiên cứu của Đào Thị Thu Hằng và ctv., (2003) đã ghi nhận được chế phẩm sinh học có

nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng Pseudomonas monteilli 58 có thể kiểm soát tốt bệnh héo xanh trên cà chua trong điều kiện nhà lưới Bên cạnh đó, theo Nayaka et al.,

(2009) cũng ghi nhận một số tác nhân có hiệu quả phòng trừ bệnh thán thư trên ớt như:

Pseudomonas fluorescens, Trichoderma và Bacillus subtilis…

Trên cơ sở đó, đề tài: “Hiệu quả phòng trị bệnh héo xanh do vi khuẩn

Ralstonia solanacearum và bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra trên

ớt của chế phẩm sinh học Bacillus spp.” được thực hiện nhằm khảo sát hiệu quả của

các chế phẩm sinh học với phần trăm tỉ lệ nội bào tử khác nhau trong việc phòng trừ bệnh héo xanh và thán thư trên ớt Bên cạnh đó cũng xác định được biện pháp xử lý cho hiệu quả phòng trị bệnh cao nhất

CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây ớt

1.1.1 Nguồn gốc và sơ lược

Cây ớt có tên khoa học là Capsicum frutescens L., thuộc họ cà (Solanaceae) Ớt

có nguồn gốc ở Nam Mỹ, được đưa đến Châu Á ở thế kỷ XVI do nhà thám hiểm Bồ Ðào Nha và Tây Ban Nha thông qua con đường thương mại từ Nam Mỹ và sau đó được trồng trên tất cả các châu lục Ớt là loại cây phát triển tốt trên đất thoát nước tốt,

pH 5,5-6,8, với lượng mưa trung bình từ 600-1250mm, nhiệt độ phát triển thích hợp 25-270C, cho năng suất tối đa ở nhiệt độ 18-300C, thời gian thu hoạch cao điểm từ 4-7 tháng sau khi gieo, có thể sống 2-3 năm nếu điều kiện thuận lợi Màu sắc và hương vị được chiết xuất làm thực phẩm, dược phẩm, thức ăn gia cầm (CABI, 2001)

1.1.2 Tình hình sản xuất

Theo FAO (2011) diện tích trồng ớt trên thế giới là 1,9 triệu ha đạt sản lượng 3,4 triệu tấn Nước có diện tích trồng ớt nhiều nhất là Trung Quốc, Đại lục, Mexico,… Ở Việt Nam, diện tích trồng ớt là 64 nghìn ha, với sản lượng 90 nghìn tấn

1.2 Bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum

1.2.1 Lịch sử phát hiện

Năm 1986, Erwin Smith phát hiện bệnh này đầu tiên trên cây họ cà ở Mỹ Đến nay, bệnh đã gây hại trên 278 loài cây thuộc trên 44 họ thực vật khác nhau, trong đó đáng kể nhất là các cây có ý nghĩa kinh tế như cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, lạc vừng, hồ tiêu, đậu tương, dâu tằm, chuối… (Vũ Triệu Mân, 2007)

1.2.2 Sơ lược về vi khuẩn R solanacearum

Năm 1896, Smith nghiên cứu, mô tả, định tên là Pseudomonas solanacearum

Những năm sau đó, bệnh héo xanh được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu một cách toàn diện như Kelman 1953, Hayward 1964, Cook and Baker 1983, Yabuuchi 1992, 1995 (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)

Theo Floyd (2008) thì R solanacearum thuộc:

Lớp: Betaproteobacteria

Bộ: Burkholderiales

Họ: Ralstoniaceae

Ở Việt Nam loài R solanacearum được xác định có chủng (race) 1, gồm nòi sinh

học 3 & 4 (biovar), đây là chủng có phạm vi ký chủ rộng tồn tại lâu dài trong đất (Đỗ Tấn Dũng, 2005) Biovar có đặc tính tạo ra axit oxy hóa cả 6 loại lactose, mantose, cellobiose, dulditol, mannitol và sorbitol Biovar 4 chỉ oxy hóa (phản ứng cộng) ba

loại dulcitol, mannitol và sorbitol (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Trong đó, các races phân loại dựa trên phổ kí chủ và vùng địa lý phân bố

Race 4: Gây hại trên cây gừng

Race 5: Gây hại trên cây dâu tằm (China)

Bên cạnh đó thì các biovar được phân loại dựa vào đặc tính sinh lý, sinh hóa khác nhau của các mẫu phân lập Bốn biovar có thể nhận dạng khi dựa vào khả năng

sử dụng và oxi hóa ba đường (cellobiose, lactose, maltose) và ba rượu có sáu cacbon (dulcitol, mannitol, sorbitol) (Hayward, 1964; Buddenhagen, 1986)

Theo Hà Huy Niên và Nguyễn Thị Cát (2004) thì bệnh thường biểu hiện ngay khi

bị vi khuẩn xâm nhập, cây nhiễm bệnh ban ngày lá biến màu, tái xanh, héo cụp xuống Vào ban ngày các lá gốc bị héo rũ nhưng đến buổi tối và ban đêm có thể phục hồi nhưng chỉ trong vòng 2-3 ngày sau đó cây chết hẳn

Triệu chứng điển hình để nhận biết bệnh là thân cây bệnh có các sọc nâu dọc theo mạch nhựa ở rễ hoặc cổ rễ (Phạm Văn Kim, 2000)

1.2.5 Đặc điểm xâm nhiễm bệnh

Vi khuẩn này xâm nhiễm vào rễ, thân cuống lá và qua các vết thương cơ giới hoặc do tuyến trùng tạo ra, do chăm sóc vun trồng… Vi khuẩn cũng có thể xâm nhập vào qua các lỗ hở tự nhiên Sau khi đã xâm nhập vào rễ thì vi khuẩn lan tới các bó mạch dẫn xylem, sinh sản phát triển ở trong đó Sản sinh ra các enzyme pectinase và cellulase để phân huỷ mô, sinh ra các độc tố ở dạng exopolysaccarit (EPS) và lipopolysaccarit (LPS) làm tắc mạch dẫn cản trở sự vận chuyển nước và nhựa trong cây, dẫn tới cây héo nhanh chóng (Cook and Sequeira, 1991; trích dẫn bởi Lê Lương

và Vũ Triệu Mân, 1999) Tuyến trùng bướu rễ làm bệnh phát triển nhanh hơn so với

tuyến trùng dạng thận (Deberdt et al., 1999)

1.2.6.2 Lưu tồn

Vi khuẩn chủ yếu lưu tồn trên rễ của cây ký chủ phụ: Gừng (Zingiber

officinale), thầu dầu (Ricinus communis), lạc (Arachis hypogaea), khoai sọ

(Colocasia esculenta), cây nghệ (Curcuma longa),… tàn dư thực vật nhiễm bệnh, hoặc của cây ký chủ vụ trước Vi khuẩn ít có khả năng lưu tồn trong đất, nhưng trong một số trường hợp cũng được ghi nhận, vi khuẩn lưu tồn ở những tầng đất sâu, nơi ít bị

tác động cạnh tranh của vi sinh vật tại chỗ (Graham et al., 1979)

Bên cạnh đó, vi khuẩn R solanacearum có thể lưu tồn được nhiều năm ở nhiệt

môi trường nước thịt có bổ sung glycerol (Van Elsas, 2001) Vi khuẩn phát triển kém trong môi trường nuôi cấy có chứa 0,5% natri clorua và ở nồng độ 2% thì không tăng trưởng (Kado, 2010)

1.2.7 Biện pháp quản lý

1.2.7.1 Biện pháp canh tác

Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1999) thì có thể tiêu hủy tàn dư cây bệnh, luân canh với lúa nước hoặc các loại cây phi ký chủ như ngô, mía, bông Tăng cường bón phân hữu cơ, phân hoai mục và bón vôi

Biện pháp luân canh cây trồng được xem là biện pháp tốt nhất nhằm giảm thiệt hại do bệnh héo xanh do vi khuẩn gây ra Luân canh với ngô, đậu tương đã được chứng minh rất hiệu quả trong kiểm soát bệnh (Sharma, 2006)

et al., 2004; Vũ Triệu Mân, 2007)

Bào tử nấm được tạo ra nhanh chóng và có thể lẩn khắp ruộng, kết quả là đến 100% ruộng ớt mất mùa Ngoài ra, vết bệnh cũng có thể xuất hiện ở trên cành và lá, hình dạng là những đốm màu nâu xám không đều với đường mép màu nâu sẫm (AVRDC, 2004)

1.3.2 Tác nhân

Do nấm Colletotrichum spp gây ra, là nguyên nhân gây hại trên nhiều loại cây

trồng như: xoài, cây họ cà, dưa tây, dưa bầu bí, ớt, một số loại hoa kiểng,… (Agrios, 2005)

Nhiều loài nấm Colletotrichum khác nhau được tìm thấy trên ớt Bốn loài phổ biến là C capsici, C gloeosporioides, C coccodes, C acutatum (AVRDC, 2003; Roberts et al., 2004), trong đó, hai loài C capsici và C gloeosporioides được báo cáo

là hai tác nhân chính gây ra bệnh thán thư trên ớt ở Bắc Mỹ và Châu Á (Roberts et al.,

2004)

Theo Vũ Triệu Mân (2007) loại nấm Colletotrichum nigrum Ell et Hals cũng

được ghi nhận là tác nhân gây bệnh thán thư trên ớt

Theo Smith and Black (1990) việc xác định đặc tính của loài Colletotrichum dựa

trên đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng của bào tử và đĩa áp (appressoria),

sự tồn tại của gai cứng hoặc sự hiện diện của hình thái, màu sắc của sợi nấm, sự phát triển bề mặt của sợi nấm Tuy nhiên việc xác định loại nấm dựa vào cách phân loại này

đôi khi không mang lại hiệu quả đáng tin cậy vì giữa các nòi nấm Colletotrichum luôn

có sự thay đổi về hình thái khi bị ảnh hưởng bởi môi trường Để khắc phục những bất cập trên, kỹ thuật phân tử được áp dụng để xác định những đặc tính của nấm Việc sử dụng kết hợp các công cụ chuẩn đoán phân tử cùng với phân loại truyền thống là cách

phù hợp và tốt nhất để nghiên cứu Colletotrichum (Hyde et al., 2009)

1.3.3.2 Đặc điểm hình thái

Colletotrichum capsici: bào tử đơn bào, không màu, có dạng hình lưỡi liềm hơi

cong, khuẩn lạc có màu trắng đến xám (trích CABI, 2001) Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn Đĩa đài có dạng bán cầu với nhiều gai cứng màu nâu đen (Sharma, 2006)

Colletotrichum coccodes: bào tử hình trụ, đĩa áp hình trứng, màu nâu sẫm kích

thước khoảng 11-16,5 x 6-9,5 µm, hạch nấm ban đầu nhẵn và màu xám nhưng sau đó trở nên sẫm màu và có gai cứng (Sutton, 1980)

Colletotrichum gloeosporioides: bào tử hình trụ với một đầu cùn, một đầu hẹp ở

đế, trong suốt, không có vách ngăn, kích thước 9-24 x 3-6 µm Nang chứa 8 bào tử nang Gai cứng có độ dài thay đổi, hiếm khi dài hơn 200 µm, rộng từ 4-8 µm Khuẩn

lạc trên môi trường PDA có màu hơi xám đến xám xẫm Đĩa áp có dạng trứng, dạng trứng ngược, ít khi có dạng chùy, 6-20 x 4-12 µm, có màu nâu nhạt (CABI, 2001)

Colletotrichum acutatum: sợi nấm thường có màu trắng, màu xám nhạt hoặc màu

cam, không có gai cứng, bào tử đính hình thoi hoặc có ít nhất một đầu nhọn, kích thước bào tử 8-16 x 2,5-4 µm (Mordue, 1979; Sutton, 1980)

Colletotrichum nigrum: Theo Vũ Triệu Mân (2007) thì bào tử hình bầu dục hoặc

hình trụ, hai đầu tròn, đơn bào, không màu, kích thước 18-25 x 3 µm

1.3.3.3 Điều kiện phát sinh phát triển

Bào tử phân sinh của nấm thường nảy mầm trong nước sau 4 giờ, nhiệt độ thích hợp để nấm gây bệnh là 28-300C Bệnh phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao, ẩm độ cao (trên 80%) Bệnh gây hại lớn vào những tháng mưa nhiều, thường vào tháng 5-7 khi cây ớt đang ở thời kỳ thu hoạch trái Bệnh còn gây hại vào giai đoạn sau thu hoạch

trong quá trình bảo quản và vận chuyển (Vũ Triệu Mân, 2007)

1.3.3.4 Lan truyền lưu tồn

Nấm có thể lưu tồn qua mùa đông trên những cây khác thuộc cùng họ cà, lưu tồn trên xác bã thực vật, cỏ dại Trên rễ các loài cây cùng họ trên đồng ruộng Nhiều loài

Colletotrichum sẽ hình thành hạch nấm trong đất khi gặp thời tiết bất lợi như mùa

đông, stress về nhiệt độ nhờ đó có thể lưu tồn nhiều năm (Pring et al., 1995) Theo Manandhar et al (1995) nấm có thể tồn tại bên trong hay bên ngoài hạt đó là cách xâm

nhiễm bằng cách lây lan trong vườn ươm Quá trình xâm nhiễm của nấm có diễn ra trên vỏ hạt hay qua các lỗ thở trên vỏ hạt

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh thán thư

pH: pH tối hảo để nấm Colletotrichum phát triển tốt nhất là 7-8 và pH thích hợp

cho bào tử mọc mầm là 5-6

nấm Colletotrichum Nếu vụ trước trồng ớt có bệnh thán thư xuất hiện thì phải luân

canh ít nhất 2 năm để cắt mầm bệnh Vào cuối vụ, nên thu gom các cây bệnh ra khỏi ruộng sau đó tiêu hủy (Trần Thị Ba và ctv., 1999)

1.3.5.2 Biện pháp hóa học

Kiểm soát bệnh thán thư bằng phương pháp hóa học được báo cáo lần đầu vào năm 1976 Ngày nay, việc sử dụng thuốc hóa học để phòng ngừa và kiểm soát bệnh thán thư là biện pháp được sử dụng rất phổ biến Tuy nhiên, thuốc trừ nấm đặc biệt là các loại thuốc có gốc thuốc đơn thường dẫn đến việc kháng thuốc rất nhanh (Lenné

and Parbery, 1976; Staub, 1991; trích dẫn bởi Than et al., 2008)

Các hoạt chất có khả năng phòng trị bệnh thán thư như: Benomyl, Mancozeb,

Copper oxychloride (CABI, 2001) Theo Gopinath et al (2006) thì propiconazole có

khả năng kiểm soát bệnh hiệu quả nhất so với difenoconazole và carbendazim với hiệu quả kiểm soát bệnh lần lượt là 86%, 63% và 60%

1.3.5.3 Biện pháp sinh học

Ngày nay, việc quản lý bệnh thán thư bằng biện pháp sinh học nhận được nhiều

sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu Vi khuẩn vùng rễ được phân lập xung quanh rễ

cây ớt như Bacilus subtilis có khả năng kiểm soát được 65% mầm bệnh bằng cách áo hạt (Ashwini and Srividya, 2013) Hay áo hạt với Tricoderma viride với liều lượng 4kg/ha hoặc với Pseudomonas fluorescens liều lượng 10kg/ha trong 24 giờ trước khi

gieo sẽ kiểm soát được bệnh

Vi khuẩn B amyloliquefaciens IN937a và B pumilus IN937b chống lại bệnh thán thư trên Capsicum annuum var acuminatum do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra (Antoun and Prévost, 2005)

1.4 Phòng trừ bệnh cây bằng biện pháp sinh học

1.4.1 Vi khuẩn vùng rễ

Theo Hiltner (1904) thì vùng rễ (rhizosphere) là khu vực xung quanh hệ thống rễ

và ảnh hưởng lên rễ (trích dẫn bởi Hartman, 2008) Vùng rễ là môi trường rất phức tạp với các tác động của vi sinh vật lên cây trồng và ngược lại và chúng phụ thuộc lẫn nhau Rễ cây sẽ tiết dịch và các sản phẩm phân hủy để thu hút và làm thức ăn cho vi sinh vật ngược lại cây trồng sẽ được một số lợi từ vi sinh vật Thành phần của dịch tiết

ở rễ chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như loài thực vật, từng vùng của rễ, các yếu tố vô sinh và hữu sinh (Siddiqui, 2006)

Vi khuẩn vùng rễ (rhizobacteria) là những vi khuẩn sống và định cư ở vùng rễ cây trồng, chúng có thể nhân mật số và định cư ở tất cả các ổ sinh thái ở rễ vào mọi giai đoạn phát triển của cây (Antoun and Prévost, 2005)

Có khoảng 2-5% vi khuẩn vùng rễ khi được chủng vào đất có hệ vi sinh vật cạnh tranh, biểu hiện có lợi cho sự tăng trưởng của cây được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng của cây (Plant Growth Promoting Rhizobacteria = PGPR) (Kloepper and Schorch, 1978)

1.4.2 Mối quan hệ giữa PGPR với cây trồng

1.4.2.1 Vi khuẩn ngoại sinh rễ

Nhiều vùng trên rễ non được định cư bởi vi khuẩn, nơi đây có nhiều hốc sinh thái

thích hợp mà những vi khuẩn thuộc các chi như Azotobacter, Arthrobacter, Bacillus và

Pseudomonas có thể phát triển Những vi khuẩn này có khả năng ngăn chặn vi sinh vật

có hại Nhiều báo cáo cho thấy tác động có lợi của vi khuẩn vùng rễ lên sự tăng trưởng của cây trồng là do chúng có khả năng kiềm hãm hay chiếm chỗ mầm bệnh (Lambert

et al., 1987)

1.4.2.2 Vi khuẩn nội sinh rễ

Theo Zinniel et al (2002) thì vi khuẩn nội sinh là những vi khuẩn sống trong mô

cây, chúng có thể tác động gây hại hoặc có lợi cho cây ký chủ Vi khuẩn nội sinh có thể được phân lập từ bề mặt hoặc bên trong mô cây

Vi khuẩn vùng rễ thường là các vi khuẩn sống tự do nhưng một số loài có thể xâm nhập vào vào mô cây sống mà không làm cây biểu hiện triệu chứng bị xâm nhiễm, được gọi là vi khuẩn nội sinh rễ (endophytes) (Autoun và Prévost, 2005)

Theo Kado (1992) and Kloepper (2006) thì vi khuẩn nội sinh có khả năng tạo một ổ sinh thái giống như ổ sinh thái của vi khuẩn gây bệnh và không gây hại cho cây

ký chủ Đây là một đặc điểm để xử lý vi khuẩn vào hạt hoặc rễ của cây trước khi trồng

1.4.3 Khả năng kích thích sinh trưởng của vi khuẩn vùng rễ

1.4.3.1 Sự tạo ra indol acetic acid (IAA)

Theo Phạm Việt Cường và ctv (2003) thì việc sử dụng đa chủng trong thực tế

làm tăng hoặc không làm ảnh hưởng tới các chủng vi khuẩn chi Bacillus được phân lập

từ đất trồng tại Việt Nam Nhưng khả năng sinh tổng hợp IAA phụ thuộc rất mạnh vào chủng, chi vi khuẩn, môi trường nuôi cấy và một số nhân tố khác Có 80% vi khuẩn phân lập từ vùng rễ có khả năng sản sinh IAA và chúng được nghiên cứu không chỉ vì hiệu ứng sinh lý của chúng lên cây trồng mà còn có thể do vai trò của phytohocmon đáp ứng sự tương tác giữa vi khuẩn-thực vật

1.4.3.2 Tạo ra Siderophore

Vi khuẩn tạo siderophore kích thích cây tăng trưởng một cách gián tiếp qua việc

cô lập lượng sắt có giới hạn trong vùng rễ, đặc biệt trong đất trung tính và đất kiềm, làm giảm lượng sắt hữu dụng cho sự tăng trưởng của mầm bệnh (Husen, 2003)

1.4.4 Kích thích tính kháng bệnh bằng PGPR

Theo Kloepper et al (1980) thì: cơ chế kích thích tính kháng bệnh bằng vi khuẩn

là do các vi khuẩn vùng rễ có thể tiết ra các chất kháng sinh thực vật ức chế mầm bệnh, tạo ra siderophore cạnh tranh sắt trong đất và tạo ra các enzyme chitinase và β-1,3 glucanase hòa tan vách tế bào vi khuẩn gây bệnh

Cách thức xử lý thường là đổ dịch huyền phù vi khuẩn (hay hỗn hợp nhiều vi khuẩn) vào đất, hoặc nhúng rễ cây con trong dịch hỗn hợp huyền phù vi khuẩn, hay áo hạt với số lượng lớn vi khuẩn trước khi gieo Sau đó, cây con được chủng mầm bệnh ở một phần khác không tiếp xúc với vi khuẩn vùng rễ, nếu sự kích kháng xảy ra thì hiệu quả ức chế mầm bệnh do vi khuẩn vùng rễ có thể biểu hiện lên những mô cây bên trên không trực tiếp tiếp xúc với vi khuẩn vùng rễ Có nhiều vi khuẩn vùng rễ cũng có thể

ức chế trực tiếp sinh trưởng của mầm bệnh, do đó để đánh giá khả năng kích kháng lưu

dẫn, vi khuẩn phải không có mặt ở vị trí tấn công của mầm bệnh (Van Loon et al.,

1998; trích dẫn bởi Trang Thanh Bình, 2009)

Sự kích kháng lưu dẫn không phụ thuộc vào sự phát triển của phản ứng siêu nhạy cảm, nhưng có khả năng ngăn chặn tối đa khi việc kích thích của mầm bệnh gây ra vết

hoại tử Trái lại, việc kích thích do VKVR không gây ra bất kỳ một triệu chứng nào

trên cây ký chủ, và tăng cường sự sinh trưởng của cây (Van Loon et al., 1998)

1.4.5 Một số đặc điểm của vi khuẩn thuộc chi Bacillus

1.4.5.1 Đặc điểm chung về hình thái, sinh học và sinh thái

Bacillus spp thường có dạng hình que với kích thước 1,0-1,2×3,0-5,0µm, gram

dương, không có lớp capsule, hiếu khí Vi khuẩn tạo nội bào tử có kích thước

1,0x1,5µm (Cook and Baker, 1989) Bacillus cereus là vi khuẩn gram dương có khả năng tạo nội bào tử và rất phổ biến trong đất và cây trồng (Huang, 2005) B

amyloliquefaciens là vi khuẩn gram dương, có dạng hình que với kích thước

0,7-0,9x1,8-3µm, các tế bào thường kết thành chuỗi, các tiêm mao được đính ở trung tâm

hoặc hơi lệch tâm Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của B amyloliquefaciens là

30-400C Tăng trưởng không xảy ra dưới 150C hoặc trên 500C (Priest et al., 1987)

1.4.5.2 Đặc tính về sự hình thành nội bào tử và khả năng lưu tồn

Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử để sống sót khi gặp điều kiện môi

trường bất lợi như nhiệt độ cao, khô, hóa chất độc hại (chất khử trùng, kháng sinh) và bức xạ tia cực tím Ở nhiệt độ 1000C, nội bào tử của một loài Bacillus có thể chịu được

từ 2,5-1200 phút (20 giờ) (Phạm Văn Kim, 2000) Nội bào tử có khả năng chịu nhiệt

do thành phần cấu tạo có hàm lượng calcium và dipicolinic acid cao, tạo thành calcium dipicolinate làm tế bào mất kiệt nước và không còn hoạt động biến dưỡng nữa; lớp vỏ ngoài và vỏ trong dầy, không thấm nước bảo vệ nội bào tử trước tác động của bức xạ

và hóa chất (Cowan, 2013) Sự thành lập nội bào tử là một tiến trình phức tạp, trải qua

nhiều giai đoạn, cần khoảng 10 giờ ở loài Bacillus megaterium (Willey et al, 2011)

Nhiều nhân tố có ảnh hưởng trên sự hình thành nội bào tử được ghi nhận như: nhiệt độ sinh trưởng, pH môi trường, điều kiện thoáng khí, sự hiện diện của một số khoáng, nguồn carbon, nitrogen và phosphorus và nồng độ của chúng, nhưng hai nhân tố môi trường có vai trò đặc biệt quan trọng được xác định là sự thiếu hụt dưỡng chất và mật

số quần thể (Logan and Halket, 2011) Tình trạng thiếu hụt dưỡng chất, đặc biệt khi nguồn carbon hoặc nitrogen đầy đủ, là tác nhân kích thích tế bào sinh dưỡng chuyển sang dạng nội bào tử Ở hầu hết các loài, tiến trình từ khi tế bào sinh dưỡng nhận biết điều kiện kích thích, cần thời gian 6-8 giờ (Cowan, 2013)

Nội bào tử có thể tồn tại trong một thời gian dài cho đến khi điều kiện môi trường thuận lợi hơn cho sự tăng trưởng Sự chuyển thành tế bào sinh dưỡng từ nội bào tử thường gồm 3 giai đoạn chính: hoạt hóa, nảy mầm và tăng sinh, trong đó nếu

không có tác động hoạt hóa nội bào tử có thể không hoạt động, ngay cả khi dinh

dưỡng đầy đủ (Willey et al, 2011) Tiến trình hoạt hóa, chuẩn bị cho nội bào tử nảy

mầm, thường có liên quan đến vai trò tác động của nhiệt Các khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự chuyển hóa từ nội bào tử thành tế bào sinh dưỡng, cho thấy nhiệt

độ kích hoạt thường là 65oC trong 45 phút, 34oC trong 48 giờ và sự hoạt hóa này là thuận nghịch Ở nhiệt độ 30oC sự hoạt hoá cũng được ghi nhận và trong thực tế nhiệt

độ này dễ dàng xảy ra trong đất hoặc đống chất hữu cơ đang phân hủy (Keynan et al.,

1964)

Trong tự nhiên, nội bào tử nảy mầm có lẻ chỉ do phản ứng với chất dinh dưỡng, thường là các amino acid, đường hoặc purine nucleoside, riêng rẻ hay kết hợp, như kết hợp của asparagine, glucose, fructose and K+ (AGFK) gợi sự nảy mầm của nội bào tử

B subtilis, giai đoạn gợi này chỉ xảy ra trong vòng vài giây, và tiến trình tiếp tục ngay

cả khi đã loại bỏ tác nhân khởi phát Theo Cowan (2013) tiến trình này có thể hoàn tất khá nhanh, thường trong 1½ giờ Các tác nhân kích thích hóa học có thể là các phân tử hữu cơ có trọng lượng phân tử nhỏ như amino acid hoặc muối vô cơ kích thích hoạt động của các thể màng của nội bào tử hình thành các enzyme để thủy phân lớp vỏ bao

và tạo điều kiện để tế bào hấp thu nước, hút dinh dưỡng và phát triển thành tế bào sinh dưỡng có chức năng biến dưỡng và sinh trưởng bình thường Trong sự nảy mầm, nội bào tử phồng lên, làm phân hủy và tiêu thụ các lớp vỏ bảo vệ, tăng hoạt động biến dưỡng, nên cũng mất khả năng chống chịu với nhiệt và các yếu tố khắc nghiệt của môi trường khác Ở giai đoạn tăng sinh, các thành phần mới trong tế bào chất được hình thành, từ các phần còn lại của nội bào tử, và phát triển thành tế bào vi khuẩn hoạt động

(Willey et al, 2011)

1.4.5.3 Tiềm năng ứng dụng vi khuẩn thuộc chi Bacillus trong nông nghiệp

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus được đánh giá hội tụ những tính năng căn bản cho việc ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Nhiều chủng Bacillus đã được nghiên cứu

và hiểu biết nhiều, được xác nhận tính an toàn, nói chung khi dùng làm tác nhân phòng trừ sinh học Do có khả năng tạo nội bào tử trong điều kiện môi trường không thuận

lợi, Bacillus có khả năng sống sót rất tốt với các điều kiện khác nghiệt của môi trường,

như nhiệt độ cao, pH cao hoặc thấp hơn giá trị mà các loài khác chịu đựng được, thiếu

dưỡng chất hay nước, (Cawoy et al., 2011) Trong nuôi nhân công nghiệp, nội bào tử

thường hình thành vào cuối giai đoạn nuôi nhân, do đó thuận lợi cho việc gia công các

chế phẩm dạng bột có tỉ lệ nội bào tử cao (Lolloo et al., 2010)

Chế phẩm sinh học có tác nhân là vi khuẩn tạo nội bào tử thường có thời gian hiệu quả qua tồn trữ lâu hơn so với các dạng sống khác và với khả năng tác động trong

phòng trừ sinh học và kích thích sinh trưởng thực vật theo nhiều cơ chế khác nhau,

nhiều chủng Bacillus được xem như là những tác nhân sinh học an toàn và có tiềm năng cao trong phòng trừ sinh học (Silo-suh et al., 1998; Cawoy et al., 2011)

1.5 Một số kết quả nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn vùng rễ

Trong nước đã có những nghiên cứu thành công các chế phẩm vi sinh vật và ứng dụng thành công vào thực tế phòng trừ bệnh trong sản xuất nông nghiệp như:

Chế phẩm phân bón sinh học và thuốc trừ dịch hại là chế phẩm sinh học sử dụng

để trị mầm bệnh trong đất rất có hiệu quả, thành phần của nó là các vi khuẩn vùng rễ

mà chủ yếu là nhóm Pseudomonas và Bacillus spp (Esitken, 2006)

Năm 1935, các nhà khoa học Liên Xô đã dùng một số vi khuẩn thuộc nhóm

Pseudomonas bón vào đất để chống nấm Sclerotinia và Botrytis bảo vệ nhiều loại cây

trồng Chế phẩm Teramixin, Biomixin và một số chất kháng sinh khác để xử lý hạt

giống chống nấm Fusarium, đặc biệt còn trị bệnh do vi khuẩn Pseudomonas

malvacearum (Đường Hồng Dật và ctv., 1979)

Chế phẩm sinh học có tên Cedemon của Thụy Điển sản xuất từ Pseudomonas chế

phẩm này được sử dụng rộng rãi Ở Việt Nam các biện pháp phòng trừ sinh học sử

dụng Trichoderma spp., Bacillus spp và Streptomyces đã được nghiên cứu (Nguyễn

Ngọc Dũng và ctv., 2003)

Trần Vũ Phến và ctv (2008) đã tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng

trưởng và triển vọng trong phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum gây

ra trên cây cà chua, thí nghiệm đã tuyển chọn hơn 500 chủng vi khuẩn vùng rễ phân lập trên ruộng trồng các cây trồng cạn

Theo Lê Mộng Trai (2009) đã đánh giá hiệu quả xử lý chế phẩm vi khuẩn vùng

rễ trong kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum gây ra và khả năng

kích thích tăng trưởng cây, năng suất trái Kết quả cho thấy chế phẩm vi khuẩn vùng rễ

ở dạng bột đã cho hiệu quả kiểm soát bệnh tốt với cách xử lý áo hạt và phun chế phẩm vào đất ở thời điểm 3 ngày sau khi trồng và 10 ngày sau trồng đạt hiệu quả cao nhất Đồng thời chế phẩm vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích tăng trưởng và năng suất cao ở các nghiệm thức xử lí

Đào Thị Thu Hằng và ctv (2003) đã ghi nhận được qui trình sản xuất chế phẩm

sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng Pseudomonas monteilli 58 có thể kiểm

soát tốt bệnh héo xanh trên cà chua trong điều kiện nhà lưới Và kết quả rất khả quan: chế phẩm có thể làm giảm tỉ lệ cây chết vào khoảng 20-70% Bên cạnh đó nếu kết hợp

dùng vi khuẩn Pseudomonas monteilli 58 và giống VL2000 thì đạt hiệu quả phòng trị

cao nhất

Theo kết quả nghiên cứu của He et al (2002) hai chủng Bacillus subtilis BS-1 và

BS-2 được phân lập từ lá, thân cây ớt không chỉ ức chế sự phát triển của khuẩn ty của

nhiều loại nấm như Fusarium oxysporum f.sp cubense, Phytophthora capsici,

Sclerotium rolfsii, mà còn kiểm soát được bệnh thán thư trên trái do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra, với hiệu quả giảm bệnh từ 57,34-94,08%

Theo Tô Hoàng Kim Yến (2008) khi khảo sát đối kháng của một số chủng vi

khuẩn Bacillus spp với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên ớt ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy cả 18 chủng vi khuẩn Bacillus đều có khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty của 4 chủng nấm Colletotrichum ST3b, VL3.1, VL3a, CT8

 Bacillus amyloliquefaciens

Đây là một trong những loài vi khuẩn có hiệu quả phòng trừ sinh học đối với

nhiều loại bệnh cây trồng từ đất hoặc các tác nhân gây bệnh sau thu hoạch (Kotan et

al., 2009)

B amyloliquefaciens chủng RC-2 sản xuất ra các hợp chất kháng nấm và ức chế

sự phát triển của nấm Colletotrichum dematium gây bệnh thán thư trên dâu tằm, khi phun lên lá trước khi lây bệnh với C dematium sẽ ức chế sự phát triển của vết bệnh (Yoshida et al., 2002)

Theo Park et al (2006) thì B amyloliquefaciens có tác dụng ức chế bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum trên cà chua trong 4 tuần sau xử lý Trong thí nghiệm

này, vi khuẩn gây bệnh được chủng vào rễ cây cà chua 20 ngày tuổi và vi khuẩn được chủng trước đó 7 ngày, kết quả cho thấy vi khuẩn không chỉ ức chế bệnh héo xanh mà còn giúp gia tăng chiều cao cây

Nghiên cứu của Luz (2003) chứng minh vi khuẩn B amyloliquefaciens giúp cây

lúa mì ở Brazil tăng năng suất từ 459 đến 594 kg/ha và có liên quan đến kích kháng, hạn chế sự gây hại của những vi sinh vật gây bệnh từ 17,3 đến 22,4%

Theo nghiên cứu của Jetiyanon et al (2003) ghi nhận hỗn hợp hai dòng vi khuẩn

B amyloliquefaciens IN937a và B pumilus IN937b, qua cơ chế kích kháng lưu dẫn

bảo vệ cây chống lại các bệnh trên cà chua do nấm Sclerotium rolfsii, Colletotrichum

gloeosporioides, và cả bệnh khảm do CMV Dòng B amyloliquefaciens EXTN-1 giúp

kiểm soát bệnh thán thư do nấm Colletotrichum orbiculare trên dưa leo (Park et al.,

2001)

 Brevibacillus brevis

B brevis là một tác nhân kiểm soát sinh học có tiềm năng, trong thí nghiệm kiểm

soát bệnh do F oxysporum f.sp lycopersici gây ra trên cà chua (Chandel et al., 2010) Trong quá trình chuyển sang dạng tế bào sinh dưỡng, nội bào tử của B brevis tạo kháng sinh gramicidin S ức chế nhiều loại nấm gây bệnh (Murray et al., 1986)

1.6 Đặc tính của thuốc Starner 20WP

Hoạt chất: oxolinic acid 20%

Công thức hóa học: C13-H11-N-O5

Phân tử lương: 261,25 g/mol

Thuốc dạng bột, màu trắng, hòa tan hoàn toàn trong nước, có tác dụng nội hấp, tiếp xúc mạnh Thuốc chuyên trị vi khuẩn gây hại cây trồng, có khả năng phòng và trừ bệnh nên hiệu quả trừ bệnh rất cao, nhanh và kéo dài (Trần Văn Nhã, 2011)

Liều lượng sử dụng: Pha 10g với 8-10 lít nước Phun ướt đều thân, lá và phun khi mới xuất hiện bệnh (Nguyễn Thị Vàng, 2013)

1.7 Đặc tính của thuốc Coc 85WP

Hoạt chất: Copper - zinc

Thành phần: 60% Bordeaux khô + 25% zineb + 15% phụ gia

Thuốc dạng bột bột mịn, màu xanh lục nhạt, không tan trong nước thuốc bám dính tốt và ít bị rửa trôi

Liều lượng sử dụng: Pha 25 g với 8 lít nước Tưới vào gốc cây để ngừa bệnh trên

rễ với lượng 1-3lít/m2, nên xới đất tơi trước khi tưới

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2013 đến tháng 1/2014

Địa điểm: Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm, khu nhà lưới của bộ

môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại Học Cần Thơ và trên ruộng nông dân tại huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long

Vật liệu thí nghiệm

- Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, que chà, đũa cấy, đèn cồn,

- Thiết bị: Autoclave, tủ thanh trùng khô, tủ cấy, máy lắc ngang, tủ định ôn, cân điện tử,…

- Giống ớt: Sừng vàng Châu Phi F1 (Công ty Trang Nông)

- Chế phẩm ở các dạng khác nhau 5% NBT, 50% NBT và 100% NBT được cung cấp bởi Phòng Thí nghiệm Phòng trừ sinh học, Bm BVTV, ĐHCT

- Thuốc bảo vệ thực vật: Coc 85WP, Starner 20WP

- Phân bón: Super lân, Urê, Kali, Ca(NO3)2, 16-16-8, vôi

 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm:

- Môi trường King’s B (Atlas, 2010)

 Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả quản lý của các chế phẩm với các tỉ lệ nội bào tử

khác nhau của vi khuẩn đối với bệnh héo xanh trên ớt

 Nghiệm thức và bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được tiến hành trong bọc nilon, với 6 nghiệm thức, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lần lặp lại, mỗi lặp lại trồng 3 cây như Bảng 2.1 và Hình 2.1

 Chuẩn bị:

- Bọc nilon trồng ớt (có đường kính 35 cm) màu đen

- Đất chuẩn bị sẵn (50% đất thịt – 25% rơm mục – 25% phân hữu cơ) cho vào bọc với khối lượng (10 kg/bọc)

- Cây con: Hạt được xử lý kích thích nảy mầm bằng nước ấm (2 sôi 3 lạnh) khoảng 41-440C trong 1 giờ, sau đó để ráo rồi xử lý áo hạt với các nghiệm thức khác nhau

Bảng 2.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm

1 Chế phẩm Bacillus spp (5% nội bào tử)

2 Chế phẩm Bacillus spp (50% nội bào tử)

3 Chế phẩm Bacillus spp (100% nội bào tử)

4 Coc 85WP xử lý đất trước khi trồng,

Starner 20WP xử lý định kì sau khi xuất hiện bệnh

5 Đối chứng 1 không xử lý chế phẩm, xử lý vi khuẩn gây bệnh

6 Đối chứng 2 không xử lý chế phẩm, không xử lý vi khuẩn gây bệnh

Hình 2.1: Xử lý áo hạt bằng huyền phù vi khuẩn sống với các tỉ lệ NBT khác nhau; A) 5% NBT, B) 50% NBT, C) 100% NBT, D) Starner 20WP, E) Đối chứng

Hình 2.2 Bố trí các bao thí nghiệm trong điều kiện nhà lưới

 Tiến hành

- Xác định mật số R solanacearum trước khi xử lý đất ứng với các nghiệm thức

khác nhau

- Xử lý đất trước khi trồng 7 ngày bằng cách tưới chế phẩm (Bacillus spp.) ở các

tỉ lệ nội bào tử khác nhau (5%, 50%, 100%) ở mật số 105 cfu/g đất và thuốc hóa học

Coc 85WP theo nồng độ khuyến cáo ứng với các nghiệm thức tương ứng

+ Xử lý đất bằng Coc 85WP với liều lượng 25 g/8 lít nước

+ Thuốc Starner 20WP được xử lý với liều lượng 10g/10lít nước

- Tiến hành lây bệnh nhân tạo vào giai đoạn cây ớt 50 ngày (cây vừa mang trái) bằng cách tưới đều vào đất 50 ml huyền phù vi khuẩn R solanacearum/chậu 10 kg đất, để đạt mật số 5 x 105 cfu/g đất (rễ được tạo vết thương trước khi chủng)

- Xử lý chế phẩm và thuốc hóa học Starner 20WP ở các thời điểm 7 và 14 NSCB Chủng VKVR sau khi khi lây bệnh nhân tạo 7 ngày, tưới định kỳ 7 ngày/lần, chủng với mật số 5 x 105 cfu/g đất, tưới đều 50 ml dung dịch vi khuẩn/chậu Xử lý thuốc hóa học Starner 20WP theo nồng độ khuyến cáo của nhà sản xuất (10 g/bình 10 lít nước,

xử lý 25 ml/bọc/lần)

 Cách xác định mật số vi khuẩn và trong đất và ghi nhận chỉ tiêu:

* R solanacearum: Từ huyền phù ban đầu (1 g đất + 10ml nước cất vô trùng,

đem lắc trên máy lắc ngang 30 phút), theo phương pháp pha loãng và chà lên môi trường TZC, sau ủ trong tủ định ôn (300C) 2 ngày Trên môi trường này R

solanacearum là khuẩn lạc có rìa trắng đục tâm hồng nhạt đến đỏ.Đếm số khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa và từ đó suy ra mật số vi khuẩn trong đất

* Vi khuẩn thuộc chi Bacillus: cũng tiến hành theo phương pháp pha loãng

huyền phù, nhưng chà trên môi trường King’s B, sau đó xử lý nhiệt ở 900C trong 15 phút

Mật số vi khuẩn = số khuẩn lạc trên đĩa x hệ số pha loãng huyền phù

* Cách lấy mẫu: Mẫu đất được lấy ở gần vị trí rễ của cây.

* Chăm sóc ớt: Tưới nước đầy đủ tránh để cây bị thiếu nước Khi cây bắt đầu

cho trái thì tiến hành cắm cây chống đỡ cho cây khỏi bị đỗ ngã Tỉa bỏ những lá già, nhánh dưới cháng ba của cây để tạo sự thông thoáng tránh sâu bệnh Thường xuyên theo dõi tình hình sâu bệnh để tránh thiệt hại

Mức phân bón trung bình toàn vụ cho 1.000 m2 như sau:

Bón lót: 50 kg super lân, 3 kg KCL, 2 kg Ca(NO3)2, 10-15 kg 16-16-8, 100 kg vôi rải đều trên mặt đất

Lần 1: 20 ngày sau khi trồng Lượng bón: 4 kg Urê, 3 kg KCL, 10 kg 16-16-8 Lần 2: 55-60 ngày sau khi trồng, khi đã đậu trái đều Lượng bón: 6 kg Urê, 5 kg KCL, 10-15 kg 16-16-8

Lần 3: Khi cây 80-85 ngày sau khi trồng, bắt đầu thu trái Lượng bón: 6 kg Urê, 5

kg KCL, 10-15 kg 16-16-8

Lần 4: Khi cây 100-110 ngày sau khi trồng, thúc thu hoạch rộ Lượng bón: 4 kg Urê, 4 kg KCL, 10-15 kg 16-16-8

 Các chỉ tiêu theo dõi:

* Đánh giá sự tăng trưởng và năng suất:

- Chiều cao cây: Chiều cao được lấy từ mặt đất đến đọt cao nhất của cây và định

kỳ 7 ngày/lần, đến khi ớt mang trái thì lấy 14 ngày/lần

- Trọng lượng thân sau khi sấy ở 1050C trong 4 giờ, khi ẩm độ khoảng 18%

- Trọng lượng rễ khô (tính trên chậu 3 cây)

- Năng suất trái (cân trọng lượng trái và đếm số trái, tính trên chậu 3 cây)

* Đánh giá sự phát triển của vi khuẩn PGPR ở các thời điểm:

- Mật số vi khuẩn đối kháng trong chế phẩm sinh học (đã xử lý đất trước khi trồng), sau 14, 21 ngày sau khi chủng bệnh (xử lý chế phẩm 7 và 14 ngày)

* Đánh giá sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và mức độ nhiễm bệnh:

- Mật số vi khuẩn R solanacearum tại thời điểm trước khi tiến hành lây bệnh

nhân tạo 7 ngày và 7, 14, 21 ngày sau khi chủng bệnh

- Đánh giá tỉ lệ bệnh: số cây bệnh/ bao, và trong 5 lặp lại

Cấp bệnh được đánh giá dựa theo thang đánh giá của He et al (1983) được mô tả bởi Deberdt et al (1999) cho bệnh héo xanh

Bảng 3.2 Cấp bệnh héo xanh (dựa theo He et al (1983) và Deberdt et al (1999)

Cấp bệnh Biểu hiện héo xanh Deberdt et al (1999)

- Hiệu quả giảm bệnh được tính theo công thức:

HQGB=

Tỉ lệ bệnh của ĐC1 – tỉ lệ bệnh của các nghiệm thức xử lý

x 100

Tỉ lệ bệnh của ĐC1

2.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu quả của chế phẩm sinh học đối với bệnh

héo xanh trên ớt do vi khuẩn R solanacearum gây ra trong điều kiện ngoài đồng

 Mục tiêu:

Xác định hiệu quả của chế phẩm sinh học (Bacillus spp.) đối với bệnh héo xanh trên ớt do vi khuẩn R solanacearum gây ra trong điều kiện ngoài đồng

- Các nghiệm thức: NT 1: Chế phẩm 5% NBT

NT 2: Chế phẩm 50% NBT

NT 3: Chế phẩm 100% NBT

NT 4: Đối chứng thuốc Starner

NT 5: Đối chứng xử lý theo nông dân

 Tiến hành:

- Xử lý đất trước khi trồng bằng cách tưới chế phẩm sinh học với các tỉ lệ nội bào tử khác nhau ở mật 109 cfu/m2 và thuốc hóa học Coc 85WP theo khuyến cáo của nhà sản xuất tại thời điểm tiến hành thí nghiệm

- Xử lý chế phẩm sinh học với mật số vi khuẩn là 109 cfu/m2 và thuốc hóa học Starner định kỳ 15 ngày/lần Liều lượng sử dụng 1g/lít/5m2

 Chỉ tiêu theo dõi:

* Đặc tính nông học:

- Chiều cao cây: Định kỳ 7 ngày/lần đo từ mặt đất đến đọt cao nhất (ngẫu nhiên 5 cây trên 2 luống), đến giai đoạn ớt mang trái thì lấy định kỳ 14 ngày/lần

- Thời gian và tỷ lệ trổ bông, năng suất trái (tấn/ha)

- Đánh giá tình hình bệnh: Định kỳ (1 tháng/lần), đếm số cây bị bệnh/ô thí

nghiệm, tính tỷ lệ bệnh và thu mẫu xác định mật số R solanacearum Phương pháp

xác định mật số tương tự như thí nghiệm 1

2.2.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả của chế phẩm sinh học (Bacillus spp.)

đối với bệnh thán thư trên ớt do nấmColletotrichum spp gây ra

Mục tiêu: Tìm ra dạng chế phẩm có tỉ lệ nội bào tử thích hợp và biện pháp xử lý

cho hiệu quả kiểm soát tốt bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra

 Nghiệm thức và bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lần lặp lại gồm hai nhân tố, nhân

tố 1 là các dạng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus spp Được trình bày

trong Bảng 3.4; nhân tố 2 là 3 biện pháp xử lý: phun vi khuẩn lên trái trước chủng

bệnh (PT), phun vi khuẩn lên trái sau khi chủng bệnh (PS) và phun vi khuẩn lên trái trước và sau khi chủng bệnh (PT+PS)) và nghiệm thức đối chứng chỉ phun nước cất vô trùng

Bảng 3.3: Các nghiệm thức khảo sát trong thí nghiệm

1 Chế phẩm Bacillus spp (5% nội bào tử)

2 Chế phẩm Bacillus spp (50% nội bào tử)

3 Chế phẩm Bacillus spp (100% nội bào tử)

 Chuẩn bị:

- Trái ớt: giống Sừng vàng Châu Phi đang chuyển màu 75 ngày tuổi, chọn lựa trái đồng đều và sạch bệnh

- Chuẩn bị nguồn nấm: Nấm Colletotrichum spp được nuôi trên đĩa Petri chứa

môi trường PDA khoảng 7 ngày, sau đó được đặt ở điều kiện 12 giờ sáng, 12 giờ xen

kẽ, nhiệt độ 250C trong khoảng 7 ngày cho nấm tạo bào tử Sau đó cho nước cất thanh trùng vào đĩa, cạo và thu huyền phù bào tử nấm, dùng lam đếm mật số bào tử nấm để xác định thể tích cần pha loãng nhằm thu được huyền phù với mật số là 105 bào tử/ml

- Chuẩn bị nguồn vi khuẩn là tác nhân phòng trừ bệnh: chế phẩm được pha vào nước cất để thu huyền phù với mật số 108 cfu/ml

 Cách thực hiện

- Biện pháp chủng bệnh: Theo phương pháp lây bệnh trên trái tách rời (Susheela, 2012) Trái ớt ở giai đoạn chuyển màu sắp chín, sạch bệnh được thu từ ớt được trồng trong nhà lưới, được thanh trùng bằng cồn 700, sau đó dùng bó kim may (10 cây) được thanh trùng châm vào trái, dùng dụng cụ phun huyền phù bào tử nấm (105 cfu/ml) vào chỗ ớt bị kim châm với 5 lần phun (3ml) Trái sau khi chủng bệnh đặt vào đĩa Petri có chứa giấy thấm được bơm 1ml nước giữ ẩm, và đặt trong điều kiện mát (250C)

- Biện pháp phun vi khuẩn: Phun huyền phù vi khuẩn (108 cfu/ml) tại vị trí vết kim châm trên bề mặt trái 5 lần bằng dụng cụ phun vi khuẩn (3ml) vào 1 ngày trước khi chủng bệnh hoặc 1 ngày sau khi chủng bệnh hoặc 1 ngày trước và sau khi chủng bệnh tùy biện pháp xử lý

 Ghi nhận chỉ tiêu: Theo dõi sự phát triển bệnh từng ngày và đánh giá hiệu

quả phòng trị bệnh bằng cách đo đường kính vết bệnh trên trái vào các thời điểm 72,

96, 120 giờ sau khi chủng bệnh

3.3 Xử lý kết quả

Số liệu được xử lý bằng phần mềm EXCEL và MSTATC Dùng EXCEL để xử lý số liệu thô Phần mềm MSTATC để phân tích phương sai ANOVA và kiểm định Duncan để

so sánh sự khác biệt giữa các trung bình nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%

Hình 2.3: Khuẩn lạc nấm Colletotrichum nuôi trên đĩa petri để tạo bào tử A) Mặt trên

đĩa petri; B) Mặt dưới đĩa petri

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

 Tổng quan về thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên thực hiện trong điều kiện nhà lưới

bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ và được tiến hành trong điều kiện thời tiết với nhiệt độ trung bình trong ngày

là 20-350C và ẩm độ 70–85% tương đối thuận lợi cho sự phát sinh và phát triển của bệnh héo xanh

3.1 Khả năng phòng trị bệnh héo xanh cây ớt trong điều kiện nhà lưới

3.1.1 Tỉ lệ bệnh héo xanh của cây ớt

Kết quả phân tích Bảng 3.1 cho thấy tỉ lệ bệnh ở các nghiệm thức có xử lý chế phẩm và thuốc Starner 20WP đều thể hiện sự khác biệt ý nghĩa 1% so với đối chứng 1 Vào thời điểm 5 NSCB thì bệnh đã xuất hiện ở các nghiệm thức, nặng nhất ở nghiệm thức đối chứng 1 (46,99%), riêng ở nghiệm thức 100% NBT vẫn chưa biểu hiện bệnh

Bảng 3.1 Diễn biến tỉ lệ bệnh của các nghiệm thức qua các thời điểm quan sát

Nghiệm thức Tỉ lệ bệnh (%) qua các thời điểm

5% NBT 32,02 a 25,01 b 18,0 b 18,0 b 18,0 b 50% NBT 18,0 a 18,0 b 18,0 b 18,0 b 0 b 100% NBT 0 a 0 b 0 b 0 b 0 b Starner 20WP 25,01 a 25,01 b 18,0 b 18,0 b 18,0 b ĐC1 46,99 a 90,0 a 90,0 a 90,0 a 90,0 a

) khi phân tích thống kê