phân lập nấm gây bệnh thán thư trên cây ớt

... Thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2013 Nguyễn Thị Thảo Nguyên TÓM LƢỢC Hai mươi tám dòng nấm Colletotrichum sp phân lập tuyển chọn từ mẫu bệnh thán thư ớt với dòng phân lập từ 24 dòng phân lập từ trái... thu mẫu nhiều địa điểm loại ớt nhằm tăng tính đa dạng dòng nấm Colletotrichum thu thập Kết phân lập 28 dòng nấm, có dòng nấm phân lập 24 dòng nấm phân lập trái Các dòng nấm đặt tên theo nguyên tắc... số phƣơng pháp phân lập nấm Kỹ thuật phân lập để tìm loài nấm hay nấm hữu ích quan trọng trình nghiên cứu Không có quy luật chung dùng cho phân lập vi sinh vật Phương pháp phân lập tốt phương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP NẤM GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ỚT

NGUYỄN THỊ LIÊN NGUYỄN THỊ THẢO NGUYÊN

MSSV: 3103971 LỚP : VSVH K36

Cần Thơ, tháng 12/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM COLLETOTRICHUM SP

GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ỚT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:

MSSV: 3103971 LỚP : VSVH K36

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Nguyễn Thị Liên Nguyễn Thị Thảo Nguyên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(Kí tên)

Để hoàn thành luận văn không chỉ có sự nổ lực và cố gắng của bản thân mà còn

có sự động viên và giúp đở rất nhiệt tình và chân thành của quý thầy cô, gia đình, bạn

bè Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến:

Quý thầy cô Giảng viên viện NC và PT Công nghệ Sinh học của trường Đại học Cần Thơ đã truyền dạy cho tôi nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báo trong quá trình học tập và nghiên cứu tại viện

Tôi xin cảm ơn cố vấn học tập cô Nguyễn Thị Pha, thầy Võ Văn Song Toàn và tập thể lớp Vi sinh vật học khóa 36 đã động viên, chia sẽ và hỗ trợ nhiệt tình trong suốt quá trình học vừ qua Đồng thời tôi xin cảm ơn các thầy cô phụ trách các phòng thí nghiệm của Viện đã tạo điều kiện cho tôi sử dụng trang thiết bị để hoàn thành luận văn

Thành kính cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt tiến trình làm thí nghiệm để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân chân thành đến những người thân trong gia đình

đã nuôi dưỡng, dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập

Xin chân thành cảm ơn tất cả!

Cần Thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2013

Nguyễn Thị Thảo Nguyên

Hai mươi tám dòng nấm Colletotrichum sp đã được phân lập và tuyển chọn từ các mẫu bệnh thán thư trên ớt với 4 dòng được phân lập từ lá và 24 dòng phân lập từ trái ở các địa điểm ở huyện Phong Điền thuộc thành phố Cần Thơ; huyện Long Mỹ, huyện Châu Thành, huyện Châu Thành A tỉnh Hậu Giang; Tân Bình và Tân Quới thuộc huyện Bình Tân tỉnh Vĩnh Long Kết quả quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường PDA đặc cho thấy: Nhóm 1 (chiếm 68%) có tốc độ mọc vừa và nhanh Hầu hết mặt trên khuẩn lạc có màu trắng, từ tâm lan ra màu vàng hoa cau, tím hoặc xám trắng; mặt dưới có màu vàng hoa cau, hồng nhạt, đen hoặc tím;bề mặt khuẩn lạc dạng nhung mượt len xốp với độ nổi mô; bìa sợi, phẳng mỏng hoặc dày mô Nhóm 2 (chiếm 32%) có tốc độ mọc chậm Bề mặt các khuẩn lạc có dạng bột mịn, độ nổi mô và dạng bìa sợi Mặt trên khuẩn lạc có màu xám trắng; mặt dưới khuẩn lạc có màu cam hoặc màu xám đen

Ngoài ra, các khuẩn lạc còn có các sắc tố hòa tan như màu vàng hoa cau (7.2%), hồng (3.6%), cam (21.4%), tím (3.6%) hay xám đen (3.6%) Về hình dạng bào tử: có dạng hình thoi, liềm hay hình trụ

Từ khóa: Colletotrichum sp., ITS1 và ITS4, ớt, thán thư

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về cây ớt 2

2.2 Bệnh thán thư trên cây ớt 3

2.2.1 Tác nhân gây bệnh 4

2.2.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến bệnh thán thư 5

2.2.3 Triệu chứng bệnh 5

2.2.4 Cơ chế xâm nhiễm 6

2.2.5 Tình hình nhiễm bệnh 8

2.3 Tổng quan về nấm Colletotrichum sp 9

2.3.1 Phân loại 9

2.3.2 Lịch sử nghiên cứu 10

2.3.3 Đặc điểm chung 12

2.4 Sơ lược một số phương pháp phân lập nấm 13

3.1 Thời gian 15

3.2 Địa điểm 15

3.3 Phương tiện 15

3.3.1 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 15

3.3.2 Vật liệu thí nghiệm 16

3.3.3 Hóa chất 16

3.4 Phương pháp nghiên cứu 16

3.4.1 Thu thập và xử lý mẫu 16

3.4.2 Phân lập nấm bệnh 17

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Nhận diện các dòng nấm bằng phương pháp truyền thống 19

4.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường đặc 19

4.1.2 Quan sát các đặc điểm hình thái 26

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Kiến nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC 37

Phụ lục 1: Thành phần môi trường PDA 37

Phụ lục 2: Vị trí mẫu được phân lập của các dòng nấm Colletotrichum sp trên lá và trái ớt 38

Bảng 1 Bảng báo cáo về tác nhân gây ra bệnh thán thư trên ớt ở một số quốc gia 4

Bảng 2 Bảng báo cáo một số loài Colletotrichum sp nhiễm trên các cây trồng nhiệt

đới 10

Bảng 3 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng nấm Colletotrichum sp sau khi cấy 7 ngày

trên môi trường PDA 20

Bảng 4 Đặc điểm khuẩn ty và hình dạng bào tử của các dòng nấm Colletotrichum sp

được phân lập 27

Hình 1: Một số loại ớt 3

Hình 2: Biểu hiện bệnh thán thư trên trái ớt 4

Hình 3 Cơ chế xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp 7

Hình 4: Vùng và mùa mà bệnh thán thư xuất hiện thường xuyên và nghiêm trọng 8

Hình 5 Bào tử một số loài Colletotrichum sp 13

Hình 6 Sơ đồ quy trình phân lập nấm 17

Hình 7 Khuẩn lạc nấm Colletotrichum sp sau khi cấy 7 ngày trên môi trường PDA 26 Hình 8 Các dạng bào tử nấm Colletotrichum sp ở độ phóng đại 1000 lần 31

bp Base pair, cặp bazo

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ớt (Capsicum sp ) là loại cây đã được con người trồng trọt và thu hái từ lâu đời

Với nhiều người, ớt được dùng làm gia vị nhằm làm tăng cảm giác ngon miệng hay dùng để trang trí bởi lẽ ớt cũng là loại cây cảnh đẹp Bên cạnh đó, ớt còn có tác dụng rất tốt trong việc điều trị bệnh Ngày nay, ớt là loại cây gia vị trồng được ở vùng nhiệt đới nhưng được tiêu thụ khắp thế giới do đó có giá trị cao ở thị trường trong nước và xuất khẩu, đem lại lợi nhuận kinh tế và là mặt hàng xuất khẩu đứng vị trí số một trong các loại cây gia vị

Vì lí do đó mà ngày nay diện tích trồng ớt đã tăng lên rất nhiều nhưng năng xuất thật sự chưa cao Là loại cây dễ trồng nhưng rất tốn công chăm sóc và luôn gặp những

tổn thất lớn trong vấn đề về dịch bệnh đặc biệt là bệnh thán thư do nấm Colletotrichum

sp gây ra Bệnh lây lan mạnh do bào tử nấm phát tán xa và nhiều theo gió Vì vậy, đây

là dịch bệnh nghiêm trọng và gần như bất trị dù có phun nhiều loại thuốc đặc trị Bệnh xuất hiện trên lá, thân và đặc biệt là trên trái làm giảm năng xuất và chất lượng nông sản từ 28 – 35%, thiệt hại lên đến 70 – 80% Theo Than et al (2008) Colletotrichum

sp là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất trên toàn thế giới gây ra bệnh thán thư trên một loạt các cây trồng bao gồm ngũ cốc, các loại đậu, rau, cây lâu năm và cây ăn quả (Bailey et al., 1992)

Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải có biện pháp phòng trừ bệnh hiệu quả nhằm nâng cao nâng xuất cũng như chất lượng ớt nhằm cải thiện kinh tế cho người dân Đề tài:

“Phân lập và nhận diện nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây ớt”

được thực hiện với mục đích là nhận diện chính xác các dòng nấm Colletotrichum sp

để tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm Colletotrichum

sp nhằm quản lí và kiểm soát nguồn dịch bệnh một cách hiệu quả, đồng thời có hướng phòng trị bệnh như: trồng các giống kháng hoặc bằng các biện pháp sinh học

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập các dòng nấm Collectotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây ớt

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây ớt

Cây ớt (Capsicum ssp.) thuộc chi Capsicum của họ cà (Solanaceae) gồm 5 loài thuần hóa (C annuum, C baccatum, C Chinense, C frutescens, C pubescens) với

hơn 20 loài hoang dại Là loài cây chịu nhiệt, nhiệt độ thích hợp tăng trưởng là 18 –

280C khi nhiệt độ cao trên 320C và thấp dưới 150C sẽ làm cây tăng trưởng kém và hoa

Cho đến nay, ớt có rất nhiều công dụng Với nhiều người, ớt là gia vị không thể thiếu trong các bữa ăn hằng ngày Nếu ăn cay vừa phải sẽ giúp tăng tiết dịch vị, giúp tiêu hóa tốt hơn, ăn ngon miệng hơn, đồng thời tránh bị đầy hơi Khi ăn ớt, vị cay kích thích thần kinh vị giác để được chuyền lên não bộ Não bộ phản ứng bằng cách tăng nhịp tim, giãn mạch cục bộ, tăng tiết nước bọt, hắt hơi Để giảm cảm giác đau nóng của ớt, não bộ sẽ tiết ra chất giảm đau là endorphin Với nồng độ cao chất này gây cảm giác thoải mái Theo Than et al (2008) ớt có nhiều lợi thế ẩm thực

(http://giaoduc.net.vn/Utilities/PrintView.aspx?ID=282172, ngày 02/08/2013)

Theo Than et al (2008) trong trái ớt bao gồm nhiều chất hóa học bao gồm nhiều loại dầu dễ bay hơi, dầu béo, capsaicinoid, carotenoid, vitamin, protein, chất xơ và các chất khoáng (Bosland và Votava, 2003) Trong ớt có nhiều thành phần quan trọng có giá trị dinh dưỡng, hương vị, mùi thơm và màu sắc Ớt có ít natri và cholesterol, giàu vitamin A và C và là một nguồn cung cấp kali, axit folic và vitamin E Ớt xanh tươi chứa nhiều vitamin C hơn trái cam quýt và ớt đỏ tươi có nhiều vitamin A hơn cà rốt (Osuna-García et al., 1998; Marin et al., 2004) Hai nhóm hóa chất được sản xuất bởi

ớt là capsaicinoid và carotenoids Các capsaicinoid là alkaloid làm cho ớt có vị cay Một số lượng lớn carotenoid cung cấp giá trị dinh dưỡng cao và màu sắc cho ớt

(Britton và Hornero-Méndez, 1997; Hornero-Méndez et al., 2002; Pérez-Gálvez et al.,

Theo Than et al (2008) bệnh thán thư, xuất phát từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là

“than”, còn gọi là bệnh đốm trái hay nổ trái Thán thư là tên gọi phổ biến dùng chung cho cây trồng bị bệnh với triệu chứng bệnh là màu ngăm ngăm đen, tổn thương sâu và

có chứa các bào tử (Isaac, 1992) Bệnh thán thư trên ớt lần đầu tiên được báo cáo ở New Jersey, Mỹ bởi Halsted Trong năm 1890, Halsted đã mô tả nguyên nhân gây ra

bệnh thán thư là hai loài Gloeopsorium piperatum và Colletotrichum nigrum Đơn vị

phân loại sau đó được xem xét như là từ đồng nghĩa của C gloeosporioides bởi Arx

(1957)

Hình 2: Biểu hiện bệnh thán thƣ trên trái ớt

(*Nguồn: Jaw Fen Wang và Paul Gniffke, 2010)

2.2.1 Tác nhân gây bệnh

Bệnh thán thư chủ yếu do nấm Colletotrichum sp gây ra

Bảng 1 Bảng báo cáo về tác nhân gây ra bệnh thán thƣ trên ớt ở một số quốc gia

Quốc gia và khu vực Tác nhân gây bệnh Trích dẫn

Australia Colletotrichum acutatum, C

atramentarium, C dematium, C

gloeosporioides var minor, C

gloeosporioides var gloeosporioides

Simmonds, 1965

Paul and Behl, 1990 Indonesia C acutatum, C capsici, C gloeosporioides Voorrips et al., 2004 Korea C acutatum, C gloeosporioides, C

coccodes, C dematium

Park and Kim, 1992

Myanmar (Burma) Gloeosporium piperatum E and E., C

nigrum E and Hals

Dastur, 1920

Quốc gia và khu vực Tác nhân gây bệnh Trích dẫn

Papua New Guinea C capsici, C gloeosporioides Pearson et al., 1984

1997 Taiwan C acutatum, C capsici, C gloeosporioides Manandhar et al., 1995 Thailand C acutatum, C capsici, C gloeosporioides Than et al., 2008

UK C acutatum, Glomerella cingulata Adikaram et al., 1983 USA C acutatum Roberts et al., 2001 Vietnam C acutatum, C capsici, C gloeosporioides,

sự xâm nhiễm và tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh trên cây chủ Nói chung là xâm nhiễm xảy ra trong thời tiết ấm áp, ẩm ướt Nhiệt độ khoảng 270C và độ ẩm cao (trung bình 80%) là tối ưu cho sự phát triển bệnh thán thư (Roberts et al., 2001)

2.2.3 Triệu chứng bệnh

Triệu chứng bệnh trên lá và thân: vết bệnh hình tròn hoặc không có hình dạng nhất định, xếp theo chiều dài của gân lá Lúc đầu, đốm bệnh ở mặt dưới lá có màu nâu nhạt, sau chuyển màu nâu sậm, có viền đỏ, lan rộng và lõm sâu Trên cuống lá và thân cây vết bệnh cũng lõm xuống tạo thành vết dọc màu nâu đen Cây bị bệnh kém phát triển, lá vàng và rụng sớm

Trên trái: Vết bệnh lúc đầu là một đốm nhỏ hơi lõm, trên bề mặt vỏ trái Vết bệnh, thường có hình bầu dục hoặc hình thoi, màu nâu đen hoặc màu vàng trắng, kích thước vết bệnh có thể trên dưới 1cm tuỳ thuộc vào giống ớt Phần ranh giới giữa mô

bệnh và mô khoẻ thường có một đường vạch màu đen chạy dọc theo vết bệnh Trên bề mặt mô bệnh có những chấm nhỏ màu đen đó là đĩa cành của nấm

2.2.4 Cơ chế xâm nhiễm

Theo Than et al (2008) các loài Colletotrichum sp sử dụng các cách khác nhau

cho sự xâm chiếm các mô chủ, mà thay đổi từ bán ký sinh nội bào đến hoại dưỡng ở

vách dưới biểu bì (Bailey et al., 1992) Loài Colletotrichum sp sản xuất một loạt các

cấu trúc xâm nhiễm chuyên hóa như đĩa áp và vòi xâm nhiễm, khuẩn ty nấm sơ cấp và khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Perfect và et al., 1999) Giai đoạn trước xâm nhiễm của cả hai rất giống nhau, trong đó bào tử bám chặt vào và nảy mầm trên bề mặt cây trồng, sản xuất đĩa áp và hình thành vòi xâm nhiễm sau đó thâm nhập vào các lớp biểu

bì (Bailey et al., 1992) Sau khi xâm nhập, các mầm bệnh ở trong vùng vách bên dưới lớp biểu bì sống một cách hoại dưỡng và nhanh chóng lan rộng khắp các mô (O'Connell et al., 1985) Không có giai đoạn ký sinh phát hiện trong hình thức hoại sinh Ngược lại, các mầm bệnh thán thư cho thấy sự nhiễm dinh dưỡng hoại sinh vào hình thức ký sinh bằng cách sống ở các màng sinh chất và thành tế bào trong tế bào Sau khi ký sinh, khuẩn ty nấm trong tế bào sống ở trong một hoặc hai tế bào và sau đó sản sinh khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Bailey et al., 1992) Do đó các tác nhân

gây bệnh được coi là bán ký sinh hoặc hoại dưỡng (Kim et al, 2004) Ví dụ, C gloeosporioides trên bơ, ớt và chanh có thể sản xuất cả hai loại của sự xâm chiếm: ký

sinh trong tế bào ở giai đoạn đầu và hoại dưỡng (O'Connell et al., 2000)

Chỉ có một vài nghiên cứu chi tiết về cơ chế xâm nhiễm của nhiều loài Colletotrichum sp trên ớt Kim et al (2004) nhận thấy rằng nhiễm hoại sinh được tìm thấy trong quá trình lây nhiễm của C gloeosporioides trong ớt (C annuum cv jejujaerae) Biểu bì tế bào chất của cây chủ trở nên cô đặc và nhỏ, không bào tăng lên

và phá hủy tế bào đến các tế bào dưới biểu bì của thực vật, trong đó có thể bị phá hủy bởi các enzyme của mầm bệnh Ở các giai đoạn sau của bệnh, các mô đã bị xâm chiếm giữa và trong tế bào bởi các mầm bệnh Đặc điểm cấu trúc này chỉ ra rằng xâm nhiễm

bị chi phối bởi sự tăng trưởng nấm hoại sinh

Hình 3 Cơ chế xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp

(*Nguồn: Wharton và Diéguez-Uribeondo, 2004)

C: Bào tử

A: Đĩa áp

Cu: Biểu bì

PP: Hình thành vòi xâm nhiễm

ILS: Đốm sáng (Internal Light Spot)

PH: Sợi nấm sơ cấp

E: Mô biểu bì M: Tế bào thịt lá N: Hoại sinh SH: Sợi nấm thứ cấp ScH: Dưới lớp biểu bì

Bào tử (C) mọc mầm và hình thành đĩa áp (A), đĩa áp hình thành vòi xâm nhiễm (PP) xâm nhập qua lớp biểu bì (Cu) của tế bào chủ và trên đĩa áp xuất hiện đốm màu sáng (ILS) Ở hình A, với cách xâm nhiễm bán kí sinh, vòi xâm nhiễm xuyên qua

tế bào biểu bì của tế bào chủ và phòng to lên tạo ra khoang xâm nhiễm với sợi nấm có kích thước lớn, được gọi là sợi nấm thứ cấp (PH) Sợi nấm này có thể định vị lan sang các mô biểu bì (E) và tế bào thịt lá (M) kế bên Trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm này, sự tương tác giũa kí chủ và mầm bệnh là kí sinh bắt buộc Tiếp theo là giai đoạn hoại sinh (N), sự tương tác được thể hiện qua sự hình thành sợi mầm thứ cấp (SH) Các sợi nấm thứ cấp này đâm xuyên vào trong tế bào và len lõi vào các ngã gian bào đồng thời tiết enzyme phân hủy vách tế bào và giết chết tế bào chủ Ở hình B, là cách xâm nhiễm hoại sinh, sự định cư bên dưới tế bào kí chủ bắt đầu ở bên dưới biểu bì (ScH) và thường không có giai đoạn kí sinh của sợi nấm bên trong vách hoặc nếu có

thì giai đoạn này rất ngắn Nấm lây lan nhanh chóng qua các mô, đi vào trong tế bào

và qua các gian bào (Wharton và Diéguez-Uribeondo, 2004)

2.2.5 Tình hình nhiễm bệnh

Bệnh thường phát triển trong thời tiết mưa nhiều và ẩm độ cao Ở miền Nam, những tháng 7, 8 và tháng 9 trong năm là thời điểm bệnh thán thư phát triển mạnh nhất

do ẩm độ không khí rất cao kết hợp với lượng mưa lớn

Trên thế giới bệnh thán thư gây hại mạnh ở các nước vùng nhiệt đới Trong đó, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam, Indonesia và cả Trung Quốc là những nước chịu thiệt hại nặng nề, thất thoát về sản lượng có thể lên đến 80% Bệnh không chỉ nhiễm trên trái chín mà còn có cả trên trái non hay trái sau khi thu hoạch được vận chuyển đi nơi khác vẫn bị nhiễm bệnh Một số khu vực và mùa mà bệnh thán thư xuất hiện được thể hiện trong hình 4

Hình 4: Vùng và mùa mà bệnh thán thư xuất hiện thường xuyên và nghiêm

trọng

(*Nguồn: Jaw-Fen Wang và Paul Gniffke, 2010)

(*Nguồn : Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010; Phoulivong, 2011)

Giai đoạn hữu tính thường hiếm khi xuất hiện và không có ngoài tự nhiên nên

tên Coletotrichum sp vẫn được duy trì và thường sử dụng trong chi này

2.3.2 Lịch sử nghiên cứu

Theo Phoulivong (2001) Colletotrichum lần đầu tiên được báo cáo bởi Tode (1790) đặc tên là Vermicularia, nhưng sau đó đã được mô tả lại là Colletotrichum

(Corda, 1837) trong họ Melanconiales; lớp Coelomycetes; ngành Deuteromycotina

Loài Colletotrichum sp có đơn vị phân loại bao gồm chưa hoàn chỉnh hoặc nhóm vô tính trong đó có một giai đoạn hữu tính Glomerella (Sutton, 1992) Colletotrichum sp

bao gồm số lượng các loài gây bệnh sống trong mô thực vật, sống trên mô thực vật đã chết, gần đây bệnh xuất hiện phổ biến trên một loạt các cây trồng có giá trị kinh tế cao,

cây cảnh (Cai et al., 2009; Hyde et al., 2009a; Prihastuti et al., 2009; Yang et al., 2009;

Phoulivong et al., 2010)

Bảng 2 Bảng báo cáo một số loài Colletotrichum sp nhiễm trên các cây

trồng nhiệt đới

Lê tàu (avocado)

Citrus spp C acutatum,

C gloeosporioides

Hindorf et al., 2000 ; Chen et al.,

2005 ; Fischer et al., 2009 ; Coffee

Trái cây Một số loài Colletotrichum Tài liệu trích dẫn

C gloeosporioides Alahakoon & Brown 1994;

Pongpisutta and Sangchote 1994; Freeman et al., 1996

C gloeosporioides Farungsang et al., 1994; Sivakumar

et al., 1997; Wijeratnam et al.,

Therbroma cacao, Colletotrichum ignotum Rojas et al., 2010

Tetragastri panamensis Colletotrichum tropicale Rojas et al., 2010

(*Nguồn : Phoulivong, 2011)

2.3.3 Đặc điểm chung

Colletotrichum sp là một trong những chi nấm gây bệnh thán thư trên nhiều loại

cây trồng quan trọng, đặc biệt là các cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới ảnh hưởng đến nền kinh tế (Phoulivong, 2011)

Theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành (2010) hiện nay nấm

Colletotrichum sp được mô tả có 11 loài (Arx, 1957; Sutton, 1962) Nhưng

Alexopoulos và Mins (1979) thì đề xuất trên 1000 loài hình thức trong giống này đã được mô tả trước đây, phần lớn chúng trùng tên Theo ý kiến gần đây nhất của Baxter

et al., (1985), Colletotrichum được giới thiệu có 11 loài: C coccodes, C gloeosprioides, C graminicola, C capsici… là những loài thường gây bệnh thán thư

Khuẩn ty: Hệ khuẩn ty có gian bào và nội bào và ở mỗi tế bào chứa nhiều nhân Nhiều hạt dầu được sản xuất trong hệ khuẩn ty; khi chín khuẩn ty trở nên nhạt màu và xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ lớp ngoài cùng Khuẩn ty già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử (Chlamydospore), nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa khuẩn ty nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách

ra chúng cũng mọc mầm để hình thành khuẩn ty mới Nấm Colletotrichum sp có hệ

khuẩn ty thật, gồm có sự phát triển của khuẩn ty mảnh phân nhánh, không màu và có vách ngăn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010)

Sinh sản: Collectotrichum sp nội sinh, sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử

đính phát triển trên cuống bào tử; cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào

tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ cứng Frost

(1964) mô tả một vài loài của Colletotrichum sp có hoặc không có tơ cứng có thể

được kiểm soát bởi sự thay đổi độ ẩm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010)

Đặc điểm hình thái học được sử dụng để xác định các loài Colletotrichum sp là

hình dạng và kích thước của đĩa cành, bào tử, cuống bào tử đính, tơ cứng, giác bám và

tơ cứng trong nuôi cấy (Sutton, 1992; Cai et al., 2009, Than et al., 2008) Các bào tử

của Colletotrichum gloeosporioides có hình thuôn dài với đầu hơi nhọn và nói chung

là rộng hơn so với bào tử của C fragariae và C acutatum (Gunell & Gubler, 1992) Nhìn chung, các bào tử của C acutatum là hình elip đến hình thoi, trong khi bào tử của

C gloeosporioides thuôn dài với đầu hơi nhọn (Freeman et al., 1998) Tuy nhiên đặc

điểm hình thái giữa các loài thì chồng lên nhau và chỉ riêng hình thái học không cung

cấp đầy đủ thông tin cho một nhận dạng chính xác, đặc biệt là đối với những loài trong

phức hệ các loài C gloeosporioides và C dematium

Hình 5 Bào tử một số loài Colletotrichum sp

(*Nguồn: Jaw-Fen Wang và Paul Gniffke, 2010)

2.4 Sơ lược một số phương pháp phân lập nấm

Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong

quá trình nghiên cứu Không có một quy luật chung nào dùng cho phân lập vi sinh vật

Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh

vật mà ta cần Tùy điều kiện mà chúng ta chọn cách phân lập sao cho phù hợp

Có nhiều cách phân lập nấm như: Sử dụng kim nhọn nhặt bào tử, phân lập bào tử

đơn độc, phương pháp pha loãng; phân lập từ bào tử đảm…

Phương pháp dùng kim nhọn:

Sử dụng phương pháp này để phân lập tất cả mọi loại nấm phát triển trên bất kỳ

một cơ chất nào

Cách thực hiện:

 Đặt cơ chất cần phân lập (lá, cành cây mục, ) lên kính hiển vi vật kính X10 (độ phóng đại 10 lần) hoặc lên kính lúp

 Chỉnh tiêu cự để quan sát được bào tử, cuống sinh bào tử từ cơ chất

 Khử trùng que nhọn trên ngọn lửa đèn cồn

 Đưa que nhọn vào khoảng giữa vật kính và cơ chất, nhặt bào tử chuyển sang môi trường phân lập

 Nuôi cấy bào tử ở nhiệt độ 250C ngày đến khi hình thành khuẩn lạc thì chuyển sang môi trường thạch nghiêng

Phương pháp phân lập bào tử đơn độc:

Sử dụng phương pháp này để phân lập nấm gây bệnh thực vật

Cách thực hiện:

 Chuẩn bị dịch huyền phù bào tử:

 Dùng kim nhọn đánh bẹt 1 đầu, gắn vào một cái tay cầm chắc chắn, dùng que

đó cào vào chỗ trên lá cây bệnh có xuất hiện đốm nấm, đặt sang lam kính đã có sẵn một giọt nước vô trùng, khuấy đều

 Dùng đầu kim lấy một giọt nước có hoà tan bào tử đó vẽ một hình tam giác lên môi trường thạch nước (Water agar) Ủ 200

tử nảy mầm ra, chuyển sang ống nghiệm môi trường thạch nghiêng để nuôi cấy

(Nguồn: Burgess et al., 2009)