phân lập và nhận diện nấm colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây ăn quả và rau màu

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM COLLETOTRICHUM sp. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ĂN QUẢ VÀ RAU MÀU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ LIÊN NGUYỄN NHẬT ANH MSSV: 3103944 LỚP : VSVH K36 Cần Thơ, Tháng 05/2014 i Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM COLLETOTRICHUM sp. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ĂN QUẢ VÀ RAU MÀU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ LIÊN NGUYỄN NHẬT ANH MSSV: 3103944 LỚP : VSVH K36 Cần Thơ, Tháng 05/2014 ii Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Thị Liên Nguyễn Nhật Anh DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG iii Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Trong suốt trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học nhận nhiều đóng góp quý báu từ phía cán hướng dẫn, Ban Giám Đốc Viện, bạn bè quan tâm ủng hộ gia đình. Trước tiên chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện cho học tập, nghiên cứu nâng cao trình độ năm qua. Xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên hết lòng dìu dắt, dạy dỗ nâng đỡ suốt thời gian học đại học. Cảm ơn cô dẫn đồng hành từ đầu trình thực đến luận văn hoàn thành cách tốt đẹp. Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện NC & PT Công nghệ sinh học tạo điều kiện trang thiết bị, dụng cụ hỗ trợ đắc lực trình thực luận văn, cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai cô Nguyễn Thị Pha phòng Công Nghệ Gen Thực Vật nhiệt tình bảo suốt thời gian học tập nghiên cứu phòng thí nghiệm. Tất bạn lớp Vi sinh vật học khóa 36 bên cạnh động viên, cổ vũ giúp suốt trình học khoảng thời gian làm luận văn. Bên cạnh đó, gián tiếp tạo nên thành công luận văn động viên, cổ vũ gia đình. Xin cảm ơn cha, mẹ chia sẻ tiếp thêm sức mạnh cho lúc khó khăn mệt mỏi nhất. Một lần xin gửi lời tri ân đến tất người, người yêu thương, quan tâm hết lòng giúp đỡ ba năm học tập trường. iv Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Bệnh thán thư ăn rau màu nấm Colletotrichum sp. gây ra. Trong phạm vi nghiên cứu này: Từ 75 mẫu bệnh thu ba địa điểm khác thuộc huyện Phụng Hiệp, Châu Thành A thuộc tỉnh Hậu Giang quận Cái Răng thuộc Thành phố Cần Thơ; phân lập 18 dòng nấm chủng. Đa số khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng nhung mượt len xốp, độ mô lài, bìa dày, gợn sóng mỏng (chiếm 39%); vàng nhạt, dạng bột mịn len xốp, độ phẳng mô, bìa dày mỏng (chiếm 33.3%); trắng tím, dạng nhung mượt len xốp, độ phẳng lài, bìa dày, gợn sóng mỏng (chiếm 16,7%); cam nhạt, dạng nhung mượt, độ lài, bìa dày (chiếm 5,5%) trắng hồng, dạng len xốp, độ mô, bìa mỏng sợi (chiếm 5,5). Về đặc điểm khuẩn ty bào tử, tất 18 dòng nấm khuẩn ty có vách ngăn ngang; có dòng nấm có bào tử dạng hình trụ dài, nhọn hai đầu có nhiều giọt dầu tế bào chất (chiếm 38,9%); dòng nấm có bào tử dạng hình trụ ngắn (chiếm 50%); dòng lại có dạng bào tử hình trụ, thuôn nhọn đầu (chiếm 11,1%). Từ khóa: Bệnh thán thư, ăn trái, rau màu, Colletotrichum sp. vi Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang TÓM LƯỢC i MỤC LỤC .vi DANH SÁCH BẢNG . viii DANH SÁCH HÌNH .ix TỪ VIẾT TẮT .x CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .3 2.1. Bệnh thán thư 2.1.1. Sơ lược bệnh thán thư .3 2.1.2.Tác nhân gây bệnh thán thư số loại trồng .3 2.1.3. Triệu chứng .4 2.1.4. Cơ chế gây bệnh .5 2.2. Nấm Colletotrichum sp. 2.2.1 Giới thiệu chung 2.2.2 Colletotrichum gây bệnh thán thư .10 2.2.3 Các triệu chứng bệnh thán thư Colletotrichum gây 11 2.2.4 Phổ chủ Colletotrichum 13 2.2.5 Một số loài Colletotrichum gây bệnh thán thư nghiêm trọng trồng 14 2.3. Tình hình nghiên cứu .17 2.3.1 Ngoài nước .17 2.3.2 Trong nước .18 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 vi ii Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT 3.1 Phương tiện nghiên cứu 19 3.1.1 Thời gian - địa điểm 19 3.1.2. Đối tượng phạm vi nghiên cứu 19 3.1.3. Dụng cụ thiết bị 19 3.1.4. Nguyên vật liệu 20 3.1.5. Hóa chất .20 3.2 Phương pháp nghiên cứu .21 3.2.1 Thu mẫu .21 3.2.2 Phân lập nấm bệnh .21 3.2.3 Đặc điểm dòng nấm phân lập 23 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .26 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO .34 vii iii Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Báo cáo loài Colletotrichum gây nhiễm trái nhiệt đới 13 Bảng 2: Công thức môi trường PDA .20 Bảng 3: Thuốc nhuộm Cotton blue 24 Bảng 4: Thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine .24 Bảng 5: Dung dịch cố định mẫu acid lactic .25 Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc 18 dòng nấm Colletotrichum sp. phân lập .28 Bảng 7: Đặc điểm khuẩn ty bào tử 18 dòng nấm Colletotrichum sp. phân lập .31 iv viii Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Bệnh thán số loại ăn rau màu Hình 2: Cơ chế gây bệnh nấm (Phạm Văn Kim, 1999) .7 Hình 3: Sơ đồ mô tả cách phát triển bên mô đậu Hà Lan nấm Colletotrichum lindemuthianum (Phạm Văn Kim, 2003) .8 Hình 4: Bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides .9 Hình 5: Khuẩn lạc dòng nấm Colletotrichum sp. phân lập 27 Hình 6: Hình dạng bào tử dòng nấm Colletotrichum sp. phân lập .30 v ix Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT Bp Base pair, cặp bazo DNA Deoxyribo nucleic acid PDA Potato Dextrose Agar pH hydrogen power UV Ultra Violet xvi Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Thu mẫu Thời điểm thu mẫu bệnh thích hợp giai đoạn đầu bệnh, vi sinh vật gây hại trạng thái hoạt động. Những mẫu bệnh bị nhiễm nặng thường không sử dụng giai đoạn vi sinh vật hại không hoạt động nữa, thay vào vi sinh vật hoại sinh xâm nhập vào mô bệnh chết. Vì vậy, phân lập vi sinh vật gây hại từ mẫu bệnh giai đoạn thường khó. Việc lựa chọn vị trí lấy mẫu bệnh quan trọng. Trong số trường hợp, triệu chứng xuất vị trí vi sinh vật gây hại tìm thấy vị trí khác. Các bệnh xác định nhờ triệu chứng dấu hiệu đặc trưng. Triệu chứng thay đổi bên phận bị nhiễm bệnh mà mắt thường nhìn thấy được. Triệu chứng xuất thực vật bị suy giảm khả quang hợp, sinh sản, hút nước trao đổi chất. Triệu chứng bệnh thán thư vết hoại sinh màu đen Colletotrichum gây ra. Chọn có vết bệnh xuất nấm thường phát triển mạnh mô 3.2.2 Phân lập nấm bệnh 1. Rửa mẫu bệnh nước máy để loại bỏ bụi bẩn. 2. Rửa mẫu cồn 70%. 3. Cẩn thận dùng kéo dao vô trùng cắt mẫu thành mẩu nhỏ (5x5mm) phần tiếp giáp mô khỏe mô bệnh. 4. Nhúng mô bệnh vào dung dịch cồn 700 phút (có thể thay đổi nồng độ phụ thuộc vào tính chất mô cây, ví dụ số có bề mặt xốp, hấp thụ dung dịch khử trùng đủ làm chết vi sinh vật hại). 5. Lấy mẫu khỏi dung dịch khử trùng bề mặt rửa lại nước cất, sau làm khô mẫu cách đặt mẫu lên giấy lọc tiệt trùng (nếu nên để tủ cấy có hệ thống thổi lọc không khí). Cắt mẫu bệnh thành miếng cấy nhỏ khoảng x mm sau đặt lên môi trường agar - nước cất môi trường khoai tây - đường - agar. Việc để mẫu khô trước cấy có tác dụng hạn chế phát triển vi khuẩn lẫn tạp. Khi đặt mẫu cấy lên môi trường agar cần 21 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT mở đóng nắp hộp Petri nhanh để tránh vi sinh vật lẫn tạp từ không khí xung quanh. 6. Sau cấy xong, đặt ngược đĩa Petri để tránh đọng nước bề mặt môi trường nuôi cấy. Hầu hết nấm bệnh thực vật phát triển tốt 25°C. 7. Để đạt mẫu nấm thuần, không lẫn tạp dùng phương pháp cấy đơn bào tử. Phương pháp cấy đơn bào tử Cấy đơn bào tử trình cấy truyền bào tử nảy mầm để tạo mẫu nấm thuần. Phương pháp thích hợp cho việc làm chi nấm tạo bào tử môi trường nhân tạo, Fusarium, Colletotrichum, Alternaria, Stemphylium, Bipolaris, Verticillium Phoma. Quy trình cấy đơn bào tử: 1. Khử trùng que cấy. 2. Tạo dung dịch bào tử cách dùng que cấy lấy lượng nhỏ sợi nấm mặt thạch có lẫn bào tử lấy chút bào tử từ khối bào tử lớn nấm cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng. 3. Lắc ống nghiệm để phân tán bào tử kiểm tra mật độ bào tử cách quan sát ống nghiệm trước ánh sáng kiểm tra giọt dịch bào tử kính lúp soi nổi. Tránh tạo dịch bào tử với mật độ bào tử cao 4. Làm loãng với nước vô trùng cần. 5. Đổ dịch bào tử vào đĩa Petri có chứa lớp mỏng môi trường thạch nước cất. 6. Đổ dịch bào tử thừa từ đĩa Petri đi. Một số bào tử nằm lại mặt thạch. 7. Để đĩa Petri khoảng 18 bào tử nảy mầm. 8. Kiểm tra đĩa Petri kính lúp soi với nguồn sáng phía dưới. (Điều chỉnh nguồn sáng cẩn thận để có tương phản tốt thạch, bào tử, ống mầm.) 9. Dùng kim mũi mác cắt lấy khối agar có chứa bào tử nảy mầm chuyển sang đĩa môi trường 22 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT 3.2.3 Đặc điểm dòng nấm phân lập Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty bào tử nấm phân lập được. - Quan sát mô tả đặc điểm khuẩn lạc: Sau cấy chuyển phân lập nấm đĩa môi trường đặc, ta tiến hành quan sát mô tả đặc điểm khuẩn lạc bao gồm tiêu sau: hình dạng, màu sắc, độ hình dạng bìa mắt thường (Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2008). - Quan sát khuẩn ty bào tử nấm: Sau phân lập tách ròng nấm, tiến hành quan sát hình dạng bào tử khuẩn ty nấm bẳng phương pháp giọt ép kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần. Có nhiều dạng nấm Colletotrichum tự nhiên từ hoại sinh đến kí sinh ký chủ đặc hiệu. Các loài thường tồn thời gian dài xác bã thực vật, mặt đất với đặc điểm chung sau:  Sợi nấm: mảnh, phân nhánh, có vách ngăn, từ suốt đến nâu nhạt, bên tế bào chất có giọt dầu.  Đĩa cành: nằm biểu bì đến biểu bì, có vách ngăn không, tạo thành màu suốt nâu, có vách mỏng dày, có dạng giả nhu mô.  Lông cứng: có không có, hình thành không đồng đều, thẳng đứng thẳng, không phân nhánh, đỉnh nhọn tù, nâu, mịn, vách dày, có vách ngăn.  Cuống bào tử đính: có vách ngăn, phân nhánh, có màu từ suốt đến nâu nhạt, mịn, hình thành tế bào giả nhu mô đĩa cành.  Bào tử đính: suốt, vách ngăn, có nhiều giọt dầu nhỏ, hình trụ, hình chùy dài, hình liềm, hình thoi, nảy mầm chuyển sang màu nâu nhạt có vách ngăn tạo thành dạng sợi áp (Singh et al., 2007). - Cách làm tiêu giọt ép:  Nhỏ khoảng 20 µl nước cất vô trùng lên miếng lam sạch.  Khử trùng kim mũi mác que cấy vòng cách đốt cho nóng đỏ lửa đèn cồn. 23 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT  Dùng kim mũi mác khử trùng lấy sinh khối nấm từ khuẩn lạc làm trải vào giọt nước lame. Sử dụng kim mũi mác khử trùng khác để tách rời đám khuẩn ty thật mỏng để dễ quan sát.  Đậy lamelle lên giọt huyền phù nấm. Quan sát tiêu kính hiển vi để thấy hình dạng bào tử khuẩn ty nấm. - Nhuộm màu nấm: Hầu hết nấm vi khuẩn quan sát kính hiển vi phương pháp làm tiêu giọt ép. Ngoài ra, sử dụng acid lactic làm môi trường cố định nấm. Việc nhuộm màu thường áp dụng cấu trúc nấm không màu sắc. Hai hóa chất nhuộm màu thường dùng cho nấm thuốc nhuộm xanh (cotton blue) lacto- fuchsine. Bảng 3: Thuốc nhuộm Cotton blue Cotton blue (hay trypan blue) Cotton blue (Trypan blue) 0,1g Acid lactic 25ml Glycerol 50ml Nước cất 25ml (*Nguồn:http://www.daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_c ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013) Bảng 4: Thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine Lacto-Fuchsine Acid Fuchsine 0,1g Acid lactic 100ml (*Nguồn:http://www.daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_c ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013) 24 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT Bảng 5: Dung dịch cố định mẫu acid lactic Dung dịch cố định mẫu acid lactic Acid lactic 100ml Glycerol 200ml Nước cất 100ml (*Nguồn:http://www.daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_c ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013) Các bước thực hiện:  Nhỏ khoảng 20 µl dung dịch nhuộm màu Lacto-Fuchsine, Cotton blue dung dịch cố định mẫu acid lactic lên miếng lam sạch.  Khử trùng kim mũi mác que cấy vòng cách đốt cho nóng đỏ lửa đèn cồn.  Dùng kim mũi mác khử trùng lấy phần nhỏ mô có bào tử đặt vào giọt dung dịch thuốc nhuộm.  Đậy lamelle lên giọt huyền phù nấm Quan sát mẫu nấm kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần. 25 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập nấm mốc Colletotrichum sp. từ mẫu ăn rau màu Từ mẫu bệnh có triệu chứng bệnh thán thư thu địa điểm khác thuộc huyện Phụng Hiệp, Châu Thành A thuộc tỉnh Hậu Giang, quận Cái Răng thuộc Thành phố Cần Thơ, phân lập 18 dòng nấm thuần. Các dòng nấm đặt tên theo nguyên tắc đối tượng ký chủ, nguồn gốc nơi thu mẫu. Các dòng có đặc điểm khuẩn lạc hình dạng tế bào đặc trưng nấm Colletotrichum sp. Trong có 14 dòng từ huyện Phụng Hiệp, dòng từ huyện Châu Thành A, dòng từ quận Cái Răng. Kết cụ thể sau:  Về đặc điểm khuẩn lạc: + Trắng đục, dạng nhung mượt len xốp, độ mô lài, bìa dày, gợn sóng mỏng (chiếm 39%). + Vàng nhạt, dạng bột mịn len xốp, độ phẳng mô, bìa dày mỏng (chiếm 33.3%) + Trắng tím, dạng nhung mượt len xốp, độ phẳng lài, bìa dày, gợn sóng mỏng (chiếm 16,7%) + Cam nhạt, dạng nhung mượt, độ lài, bìa dày (chiếm 5,5%) + Trắng hồng, dạng len xốp, độ mô, bìa mỏng sợi (chiếm 5,5%) 26 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT Hình 5: Khuẩn lạc dòng nấm Colletotrichum sp. phân lập Chú thích: Màu sắc mặt trước, mặt sau khuẩn lạc dòng nấm Colletotrichum sp. môi trường PDA sau ngày nuôi cấy: 1-2 XCT1; 3-4. SUHG4; 5-6. CCT1; 7-8. MAHG4; 910. MCHG1; 11-12. DHHG2. (Đường kính đĩa: cm) 27 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc 18 dòng nấm Colletotrichum sp. phân lập Tên dòng nấm Màu sắc khuẩn lạc Mặt trước STT Đường kính khuẩn lạc (cm) Chiều cao (mm) Độ Dạng bề mặt khuẩn lạc Dạng bìa Tốc độ mọc Sắc tố hòa tan Dày +++ vàng Mặt sau CCT1 Trắng đục Trắng đục 8,5 Mô Len xốp, có SNKS toàn bề mặt khuẩn lạc XCT1 Trắng đục Trắng xen tím 8,4 Mô Len xốp Dày +++ Xám XHG3 Trắng đục Trắng, vàng nhạt từ tâm 6,2 Mô Len xốp Dày ++ vàng SRHG1 Trắng tím Vàng xen tím Lài Len xốp Dày + Tím, vàng nhạt SRHG2 Trắng đục Trắng đục 5,4 1,7 Lài Len xốp Dày, gợn sóng + - MCHG1 Trắng tím Trắng tím nhạt dần từ tâm 5,2 Lài Nhung mượt Dày, gợn sóng + - DHHG2 Vàng nhạt Vàng nhạt dần từ tâm 8,1 Mô Len xốp Dày +++ Vàng nhạt OHG3.4 Trắng đục Trắng đục 6,4 1,5 Lài Nhung mượt Mỏng ++ - MAHG4 Cam nhạt Cam nhạt dần từ tâm 8,7 1,1 Lài Nhung mượt Dày +++ - 10 ĐĐCT3 Vàng nhạt Vàng 7,3 Mô Bột, mịn Dày ++ Vàng nhạt 28 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Tên dòng nấm STT Màu sắc khuẩn lạc Trường ĐHCT Đường kính khuẩn lạc (cm) Chiều cao (mm) Độ Dạng bề mặt khuẩn lạc Bột, mịn Mặt trước Mặt sau Vàng nhạt Vàng 6,5 2,4 Mô Trắng 7,4 Mô Tím 5,3 2,7 Phẳng Dạng bìa Tốc độ mọc Sắc tố hòa tan Dày + Vàng nhạt Nhung mượt Nhung mượt Mỏng ++ - Mỏng + Tím 11 ĐĐHG1 12 MHG1 13 MHG4 14 BHG2 Vàng nhạt Vàng 6,8 Phẳng Bột mịn Mỏng + Vàng nhạt 15 KHHG2 Trắng đục Trắng 6,8 3,3 Mô Nhung mượt Dày ++ - 16 ĐQHG3 Vàng nhạt Vàng 5,4 Mô Bột, mịn Mỏng + Vàng nhạt 17 DLHG5 Vàng nhạt Vàng 6,7 2,3 Phẳng Bột, mịn Mỏng + Vàng nhạt 18 SUHG4 Trắng hồng Hồng 8,1 Mô Len xốp Mỏng, sợi +++ - Trắng đục Trắng tím Chú thích: - Tốc độ mọc: +++: Nhanh : ++ : Vừa + : Chậm 29 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT  Về đặc điểm khuẩn ty bào tử: Sau quan sát nấm tiêu giọt ép độ phóng đại 400 lần 1000 lần kính hiển vi quang học Olympus tất 18 dòng nấm khuẩn ty có vách ngăn ngang. Tuy nhiên dòng nấm có khác biệt hình dạng bào tử sau: có dòng nấm có bào tử dạng hình trụ dài, nhọn hai đầu có nhiều giọt dầu tế bào chất (chiếm 38,9%); dòng nấm có bào tử dạng hình trụ ngắn (chiếm 50%); dòng lại có dạng bào tử hình trụ, thuôn nhọn đầu (chiếm 11,1%). Kết tương tự nghiên cứu số tác giả khác (Damm et al., 2009), (Meizhu Du et al., 2005) nghiên cứu nấm Colletotrichum sp. đối tượng khác nhau. Hình 6: Hình dạng bào tử dòng nấm Colletotrichum sp. phân lập Chú thích: A: CCT1; B: XHG3; C: ĐĐCT3. 30 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT Bảng 7: Đặc điểm khuẩn ty bào tử 18 dòng nấm Colletotrichum sp. phân lập. STT 10 11 Tên dòng nấm Hình dạng bào tử Kích thước bào tử (µm) Khuẩn ty Nguồn gốc thu mẫu CCT1 Trụ dài, thuôn nhọn hai đầu 15,4 - 20,5 x 2,62,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Lê Bình, Cái Răng 5,7-7.8 x 1,4-2,4 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Lê bình,Cái Răng 4,2-5,5 x 1,3-1,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Châu Thành A, Hậu Giang 3,4-5,9 x 1,71-2,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Bình, Phụng Hiệp 5,3-5,9 x 2-2,5 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Bình, Phụng Hiệp 13-15,2 x 2,6-3,4 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Bình, Phụng Hiệp 14,2-15,1 x 1,4-2,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Châu Thành A, Phụng Hiệp 6,1-7,5 x 2,6-2,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Bình, Phụng Hiệp 15,4-18,8 x 2,6-2,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Bình, Phụng Hiệp 4,4-5,7 x 1,8-2,7 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Lê Bình, Cái Răng 5,9-8,5 x 2,1-3,3 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Hiệp, Phụng Hiệp XCT1 XHG3 SRHG1 Trụ ngắn Trụ ngắn Trụ ngắn SRHG2 Trụ ngắn MCHG1 Trụ dài, thuôn nhọn hai đầu DHHG2 Trụ dài, thuôn nhọn hai đầu OHG3.4 Trụ ngắn MAHG4 Trụ dài, thuôn nhọn hai đầu ĐĐCT3 Trụ ngắn, thuôn nhọn đầu ĐĐHG1 Trụ ngắn 31 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 STT 12 13 14 15 16 17 18 Tên dòng nấm Hình dạng bào tử MHG1 Trụ dài, thuôn nhọn hai đầu MHG4 Trụ dài, thuôn nhọn hai đầu BHG2 Trụ ngắn KHHG2 Trụ ngắn ĐQHG3 Trụ ngắn, thuôn nhọn đầu DLHG5 Trụ dài, thuôn nhọn hai đầu SUHG4 Trụ ngắn Trường ĐHCT Kích thước bào tử (µm) Khuẩn ty Nguồn gốc thu mẫu 15,4-17,1 x 2,2-2,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Long, Phụng Hiệp 14,3-15,3 x 1,4-2,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Long, Phụng Hiệp 5,3-6,6 x 1,7-2,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Long, Phụng Hiệp 5,9-8,5 x 2,6-3,4 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Long, Phụng Hiệp 4,7-5,8 x 2-2,6 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Long, Phụng Hiệp 15,4-18,8 x 2,6-2,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Long, Phụng Hiệp 4,3-5,3 x 1,8-2,9 Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào gian bào, có nhiều hạt dầu tế bào khuẩn ty nấm Tân Long, Phụng Hiệp 32 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đã phân lập 18 dòng nấm từ 75 mẫu bệnh thu thập địa điểm khác huyện Phụng Hiệp, huyện Châu Thành A thuộc tỉnh Hậu Giang, quận Cái Răng thuộc Thành phố Cần Thơ. 5.2. Đề nghị Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để định danh xác dòng nấm phân lập được. Cần thu thập thêm nhiều mẫu bệnh loại khác nằm hai tỉnh phân lập để phục vụ cho việc thống kê tình hình dịch bệnh có biện pháp phòng trừ hiệu quả. 33 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp (2008). Giáo trình thực tập vi sinh đại cương. Nxb. Đại học cần thơ, Tr.32. Cao Ngọc Điệp Nguyễn Văn Thành (2010). Giáo trình Nấm Học. Nxb. Đại học cần thơ. Tr.105-111. Lê Hoàng Lệ Thủy Phạm Văn Kim. 2008. Phân loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư xoài sầu riêng Đồng Bằng Sông Cửu Long thử hiệu lực sáu loại thuốc loài nấm nầy. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ (10), tr. 31-42. Phạm Văn Kim (1999). Giáo trình Các nguyên lý bệnh hại trồng. Nxb. Đại học Cần Thơ, tr.66-75. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề, Nguyễn Kim Vân, Đỗ Tấn Dũng, Nguyễn Ngọc Châu, Ngô Thị Xuyên, Nguyễn Văn Viên, Vũ Hữu Yêm, Ngô Bích Hảo. 2007. Giáo trình Bệnh đại cương. Trường đại học nông nghiệp I - Hà Nội, tr. 48-53. Tiếng Anh Damm U, Woudenberg JHC, Cannon PF, Crous PW. 2009. Colletotrichum species with curved conidia from herbaceous hosts. Fungal Diversity 39, pp.45–87. Freeman S, Minq D, Maymon M, Zverbil A. 2001. Genetic diversity within Colletotrichum acutatum sensu Simmonds. Phytopathology 91, pp.586–592. Freeman S, Shabi E, Katan T. 2000. Characterization of Colletotrichum acutatum causing anthracnose of anemone (Anmone coronaria L.) Applied and Environmental Microbiology 66, pp.5267–5272. Freeman S, Katan T, Shabi E. 1996. Differentiation between Colletotrichum gloeosporioides from avocado and almond using molecular and pathogenicity tests. Applied and Environmental Microbiology 62, pp.1014–1020. Hyde KD, Cai L, Cannon PF, Crouch JA, Crous PW, Damm U, Goodwin PH, Chen H, Johnston PR, Jones EBG, Liu ZY, McKenzie EHC, Moriwaki J, Noireung P, Pennycook SR, Pfenning LH, Prihastuti H, Sato T, Shivas RG, Tan YP, Taylor 34 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT PWJ, Weir BS, YangYL, Zhang JZ. 2009. Colletotrichum: names in current use. Fungal Diversity 39, pp.147–182. Hyde KD, Cai L, McKenzie EHC, Yang YL, Zhang JZ, Prihastuti H. 2009 – Colletotrichum: a catalogue. Fungal Diversity 39, pp.1–17. Hyde KD, McKenzie EHC, KoKo TW. 2011. Towards incorporating anamorphic fungi in a natural classification: checklist notes for 2010. Mycosphere 2, pp.1–88. Hyde KD, Bahkali AH, Moslem MA. 2010 – Fungi an unusual source. Fungal Diversity 43, pp.1–9. Kim H, Lim TH, Kim J, Kim YH, Kim HT. 2009. Potential of cross-infection of Colletotrichum species causing anthracnose in persimmon and pep. Pathology Journal 25, pp.13–20 Liu Xie, Jing-ze Zhang, Yao Wan, and Dong-wei Hu. 2010. Identification of olletotrichum spp. isolated from strawberry in Zhejingang Province and Shanghai, China. Journal of Zhejiang University SCIENCE B 11, pp.61-70. Nguyen THP, Sall T, Bryngelsson T, Liljeroth E. 2009. Variation among Colletotrichum gloeosporioides isolates from infected coffee berries at different locations in Vietnam. Plantpathology 58, pp.898–909 Ralph Dean, Jan A. L. Van Kan, Zacharias A. Pretorius, Kim E. Hammond-Kosack, Antonio Di Pietro, Pietro D. Spanu, Jason J. Rudd, Marty Dickman, Regine Kahmann, Jeff Ellis and Gary D. Foster. 2012. The Top 10 fungal pathogens inmolecular plant pathology. Molecular Plant Pathology, pp.1-17 Simmonds JH. 1965. A study of the species of Colletotrichum causing ripe fruit rots in Queensland. Queensland Journal Agriculture and Animal Science 22,pp.437– 459 Shenoy D, Lam WH, Jeewon R, Baht DJ, Than PP, Taylor P, Hyde KD. 2007. Morphomolecular characterization and epitypification of Colletotrichum capsici (Glomerallaceae, Sordariomycetes), the causative agent of anthracnose in chilli. Fungal Diversity 27, pp.197–211 35 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT Sack Phoulivong. 2011. Colletotrichum, naming, control, resistance, biocontrol of weeds and current challenges. Current Research in Environmental & Applied Mycology, pp.53-67 Than PP, Jeewon R, Hyde KD, Pongsupasamit S, Mongkolporn O, Taylor PWJ. 2008 .Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species associated with anthracnose disease on chili (Capsicum spp.) in Thailand. Plant Pathology 57, pp.562–572. Trang web http://dc217.4shared.com/doc/N6rzN4Fd/preview.html, (ngày 13/07/13) http://www.haiduong.gov.vn/vn/congdan/Pages/C%C3%A1chph%C3%B2ngtr%E1%B B%ABb%E1%BB%87nhth%C3%A1nth%C6%B0h%E1%BA%A1iraum%C3%A 0u.aspx, (ngày 22/07/2013) http://www.baovecaytrong.com/tracuubanghinhconchitiet.php?masp=134 (ngày 11/5/2014) http://www.baovecaytrong.com/tracuubanghinhconchitiet.php?masp=45 ( ngày 11/5/2014) http://www.tstcantho.com.vn/?mod=article&id=197§ion_id=3 (ngày 11/5/2014) 36 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH [...]... 1996) Nhận thấy được thiệt hại do nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây trồng là rất to lớn Do đó việc nghiên cứu biến động gây bệnh của loài Colletotrichum là quan trọng và sự hiểu biết về phổ ký chủ của tác nhân gây bệnh cụ thể có thể giúp trong việc quản lý và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả Vì vậy mà đề tài Phân lập và nhận diện nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây ăn trái và rau màu ... Phân lập được các dòng nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư từ các loại cây ăn quả và rau màu 2 Chuyên ngành vi sinh vật học Viện NC&PT CNSH Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36-2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Bệnh thán thư 2.1.1 Sơ lược bệnh thán thư Bệnh thán thư gây ra bởi nấm Colletotrichum, đây là loại bệnh rất phổ biến trên cây trồng Bệnh thán thư có thể xảy ra trên trái và. .. các cây trồng trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các cây vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Sutton, 1992; Hyde et al., 2009, 2010) Hình 1: Bệnh thán trên một số loại cây ăn quả và rau màu (*Nguồn:http://www.kinhtenongthon.com.vn/Story/khoahoc/khuyennong/2011/7/29149 html ) (ngày 3/8/2013) 2.1.2.Tác nhân gây bệnh thán thư trên một số loại cây trồng - Thán thư trên xoài: Bệnh do nấm Colletotrichum gloeosporioides... số loài Colletotrichum gây bệnh thán thư nghiêm trọng trên cây trồng a Colletotrichum gloeosporioides Theo Kim và cộng tác viên (2008) thì Colletotrichum gloeosporioides được biết đến là nguyên nhân gây bệnh thán thư trên nhiều loại cây trồng Nấm Colletotrichum gloeosporioides có mặt ở hầu hết các nước trên thế giới, đặc biệt phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở vùng nhiệt đới, nấm Colletotrichum. .. Thán thư trên chuối: Bệnh do nấm Colletotrichum muase gây ra (Nguồn: http://robinson.vn/forum/viewtopic.php?f=21&t=292, ngày 31/07/2013) - Bệnh thán thư trên khổ qua: Bệnh do nấm Colletotrichum lagenarium gây ra (Nguồn: http://www.ninhthuan.gov.vn/chinhquyen/sonnnt/Pages/Ky-thuat-trong-caymuop-dang-(kho-qua).aspx, ngày 31/07/2013) - Bệnh thán thư bầu, bí, dưa: do nấm nấm Colletotrichum orbiculare gây. .. bệnh thán thư những nghiên cứu ở nước ta còn chưa nhiều Lê Hoàng Lệ Thủy và Phạm Văn Kim (2008) phân lập được 105 chủng nấm gây bệnh thán thư, trên xoài (73 chủng) và sầu riêng (32 chủng), được phân lập từ các mẫu bệnh thu thập tại các tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, An Giang, Sóc Trăng, Cần Thơ, Cà Mau và Trà Vinh; và được khảo sát các đặc tính sinh học Dựa trên đặc tính sinh học và bảng phân. .. hai loài Colletotrichum capsici và Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên ớt Nguyễn Thị Hằng Phương (2010) đã tiến hành nghiên cứu bệnh thán thư trên cà phê đã xác định loài C gloeosporioides gây bệnh chủ yếu, các loài C acutatum, C capsici, C boninense và một loài nấm còn lại chưa xác định được tên là Colletotrichum sp cũng được tìm thấy Nguyễn Thị Thảo Nguyên (2013) đã phân lập được... ngàn loài nấm gây bệnh cây thì nấm Colletotrichum là một trong những chi phổ biến và quan trọng nhất của nấm gây bệnh trên cây ở vùng nhiệt đới gió mùa như ở Việt Nam Theo xếp hạng của tạp chí Molecular Plant Pathology (2012) thì nấm Colletotrichum được xếp ở vị trí thứ 8 trong 10 nấm gây bệnh cây hàng đầu Hầu như tất cả các cây trồng trên toàn thế giới thì dễ bị nhiễm một hoặc nhiều loài Colletotrichum. .. giới thì dễ bị nhiễm một hoặc nhiều loài Colletotrichum Những loại nấm này gây ra các điểm cháy thán thư của các bộ phận trên mặt đất của cây và gây thối sau thu hoạch Các thành viên của chi này gây thiệt hại lớn cho các cây trồng quan trọng, đặc biệt là cây ăn quả, rau màu và cây cảnh Thiệt hại do nấm Colletotrichum spp bao trùm đến các cây lương thực quan trọng, bao gồm chuối, sắn, lúa miến, được trồng... đen nhỏ li ti nổi trên các đường vòng) Nếu trời ẩm, trên vết bệnh thán thư còn xuất hiện một lớp mốc màu hồng Khi gặp nắng, vết bệnh khô giòn và rách Bệnh nặng, các vết bệnh liên kết với nhau và làm lá thối hỏng hoặc khô rụng Trên thân: Vết bệnh màu nâu xám, hơi lõm (hơi khuyết) Bệnh nặng làm thân teo lại, cháy khô Trên quả: Vết bệnh tròn, úng nước, màu nâu xám đến đen, lõm vào Trừ các quả thuộc họ bầu . sp. gây bệnh thán thư trên cây ăn trái và rau màu được thực hiện. 1.2. Mục tiêu đề tài - Phân lập được các dòng nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư từ các loại cây ăn quả và rau màu. . TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM COLLETOTRICHUM sp. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ĂN QUẢ VÀ RAU MÀU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH. CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM COLLETOTRICHUM sp. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ĂN QUẢ VÀ RAU MÀU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH