Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử nấm phân lập được.
- Quan sát và mô tả đặc điểm các khuẩn lạc:
Sau khi cấy chuyển phân lập nấm trên đĩa môi trường đặc, ta tiến hành quan sát và mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu sau: hình dạng, màu sắc, độ nổi và hình dạng bìa bằng mắt thường (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008).
- Quan sát khuẩn ty và bào tử nấm:
Sau khi phân lập và tách ròng nấm, tiến hành quan sát hình dạng bào tử và khuẩn ty của nấm bẳng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.
Có rất nhiều dạng nấm Colletotrichum trong tự nhiên từ hoại sinh đến kí sinh trên các ký chủ đặc hiệu. Các loài thường tồn tại thời gian dài trên các xác bã thực vật, trong hoặc trên mặt đất với các đặc điểm chung như sau:
Sợi nấm: mảnh, phân nhánh, có vách ngăn, từ trong suốt đến nâu nhạt, bên trong tế bào chất có các giọt dầu.
Đĩa cành: nằm trong biểu bì đến dưới biểu bì, có vách ngăn hoặc không, tạo thành màu trong suốt hoặc nâu, có vách mỏng hoặc dày, có dạng giả nhu mô.
Lông cứng: có hoặc không có, hình thành không đồng đều, thẳng đứng hoặc hơi thẳng, không phân nhánh, đỉnh nhọn hoặc tù, nâu, mịn, vách dày, có vách ngăn.
Cuống bào tử đính: có vách ngăn, phân nhánh, có màu từ trong suốt đến nâu nhạt, mịn, được hình thành trên tế bào giả nhu mô của đĩa cành.
Bào tử đính: trong suốt, không có vách ngăn, có ít hoặc nhiều giọt dầu nhỏ, hình trụ, hình chùy dài, hình liềm, hình thoi, khi nảy mầm chuyển sang màu nâu nhạt có vách ngăn tạo thành dạng sợi áp (Singh et al., 2007).
- Cách làm tiêu bản giọt ép:
Nhỏ khoảng 20 µl nước cất vô trùng lên miếng lam sạch.
Khử trùng kim mũi mác hoặc que cấy vòng bằng cách đốt cho nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn.
Dùng kim mũi mác đã khử trùng lấy một ít sinh khối nấm từ một khuẩn lạc đã được làm thuần rồi trải vào trong giọt nước trên lame. Sử dụng kim mũi mác đã khử trùng khác để tách rời đám khuẩn ty thật mỏng để dễ quan sát.
Đậy lamelle lên giọt huyền phù nấm.
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi để thấy được hình dạng bào tử và khuẩn ty của nấm.
- Nhuộm màu nấm:
Hầu hết nấm và vi khuẩn có thể quan sát được dưới kính hiển vi phương pháp làm tiêu bản giọt ép. Ngoài ra, có thể sử dụng acid lactic làm môi trường cố định nấm. Việc nhuộm màu thường áp dụng đối với các cấu trúc nấm không màu sắc. Hai hóa chất nhuộm màu thường dùng cho nấm là thuốc nhuộm bông xanh (cotton blue) và lacto- fuchsine.
Bảng 3: Thuốc nhuộm Cotton blue
Cotton blue (hay trypan blue)
Cotton blue (Trypan blue) Acid lactic Glycerol Nước cất 0,1g 25ml 50ml 25ml (*Nguồn:http://www.daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_c ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013)
Bảng 4: Thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine
Lacto-Fuchsine Acid Fuchsine Acid lactic 0,1g 100ml (*Nguồn:http://www.daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_c ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013)
Bảng 5: Dung dịch cố định mẫu acid lactic
Dung dịch cố định mẫu acid lactic
Acid lactic Glycerol Nước cất 100ml 200ml 100ml (*Nguồn:http://www.daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_c ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013) Các bước thực hiện:
Nhỏ khoảng 20 µl dung dịch nhuộm màu Lacto-Fuchsine, Cotton blue hoặc dung dịch cố định mẫu acid lactic lên miếng lam sạch.
Khử trùng kim mũi mác hoặc que cấy vòng bằng cách đốt cho nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn.
Dùng kim mũi mác đã khử trùng lấy một phần nhỏ mô có bào tử và đặt vào giọt dung dịch thuốc nhuộm.
Đậy lamelle lên giọt huyền phù nấm
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập nấm mốc Colletotrichum sp. từ các mẫu cây ăn quả và rau màu
Từ các mẫu bệnh có triệu chứng bệnh thán thư thu tại các địa điểm khác nhau thuộc huyện Phụng Hiệp, Châu Thành A thuộc tỉnh Hậu Giang, quận Cái Răng thuộc Thành phố Cần Thơ, đã phân lập được 18 dòng nấm thuần. Các dòng nấm được đặt tên theo nguyên tắc đối tượng ký chủ, nguồn gốc nơi thu mẫu. Các dòng này đều có đặc điểm về khuẩn lạc và hình dạng tế bào đặc trưng của nấm Colletotrichum sp. Trong đó có 14 dòng từ huyện Phụng Hiệp, 1 dòng từ huyện Châu Thành A, 3 dòng từ quận Cái Răng. Kết quả cụ thể như sau:
Về đặc điểm khuẩn lạc:
+ Trắng đục, dạng nhung mượt hoặc len xốp, độ nổi mô hoặc lài, bìa dày, gợn sóng hoặc mỏng (chiếm 39%).
+ Vàng nhạt, dạng bột mịn hoặc len xốp, độ nổi phẳng hoặc mô, bìa dày hoặc mỏng (chiếm 33.3%)
+ Trắng tím, dạng nhung mượt hoặc len xốp, độ nổi phẳng hoặc lài, bìa dày, gợn sóng hoặc mỏng (chiếm 16,7%)
+ Cam nhạt, dạng nhung mượt, độ nổi lài, bìa dày (chiếm 5,5%) + Trắng hồng, dạng len xốp, độ nổi mô, bìa mỏng sợi (chiếm 5,5%)
Chú thích: Màu sắc mặt trước, mặt sau khuẩn lạc của các dòng nấm Colletotrichum sp. trên môi trường PDA sau 7 ngày nuôi cấy: 1-2 XCT1; 3-4. SUHG4; 5-6. CCT1; 7-8. MAHG4; 9- 10. MCHG1; 11-12. DHHG2. (Đường kính đĩa: 9 cm)
Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc của 18 dòng nấm Colletotrichum sp. được phân lập Tên dòng nấm Màu sắc khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc (cm) Chiều cao (mm) Độ nổi Dạng bề mặt khuẩn lạc Dạng bìa Tốc độ mọc Sắc tố hòa tan STT Mặt trước Mặt sau 1 CCT1 Trắng đục Trắng đục 8,5 6 Mô Len xốp, có SNKS trên toàn bề mặt khuẩn lạc Dày +++ vàng 2 XCT1 Trắng
đục xen tím Trắng 8,4 4 Mô Len xốp Dày +++ Xám
3 XHG3 Trắng đục Trắng, vàng nhạt từ tâm ra
6,2 3 Mô Len xốp Dày ++ vàng
4 SRHG1 Trắng
tím
Vàng
xen tím 5 2 Lài Len xốp Dày +
Tím, vàng nhạt 5 SRHG2 Trắng đục Trắng đục 5,4 1,7 Lài Len xốp Dày, gợn sóng + - 6 MCHG1 Trắng tím Trắng tím nhạt dần từ tâm ra
5,2 5 Lài Nhung mượt
Dày, gợn sóng + - 7 DHHG2 Vàng nhạt Vàng nhạt dần từ tâm ra
8,1 3 Mô Len xốp Dày +++ Vàng nhạt
8 OHG3.4 Trắng đục Trắng đục 6,4 1,5 Lài Nhung mượt Mỏng ++ - 9 MAHG4 Cam nhạt Cam nhạt dần từ tâm ra
8,7 1,1 Lài Nhung mượt Dày +++ -
10 ĐĐCT3 Vàng nhạt Vàng 7,3 3 Mô Bột,
mịn Dày ++
Vàng nhạt
Tên dòng nấm Màu sắc khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc (cm) Chiều cao (mm) Độ nổi Dạng bề mặt khuẩn lạc Dạng bìa Tốc độ mọc Sắc tố hòa tan STT Mặt trước Mặt sau 11 ĐĐHG1 Vàng nhạt Vàng 6,5 2,4 Mô Bột, mịn Dày + Vàng nhạt 12 MHG1 Trắng đục Trắng 7,4 3 Mô Nhung mượt Mỏng ++ - 13 MHG4 Trắng tím Tím 5,3 2,7 Phẳng Nhung mượt Mỏng + Tím 14 BHG2 Vàng nhạt Vàng 6,8 4 Phẳng Bột mịn Mỏng + Vàng nhạt 15 KHHG2 Trắng đục Trắng 6,8 3,3 Mô Nhung mượt Dày ++ - 16 ĐQHG3 Vàng nhạt Vàng 5,4 2 Mô Bột, mịn Mỏng + Vàng nhạt 17 DLHG5 Vàng nhạt Vàng 6,7 2,3 Phẳng Bột, mịn Mỏng + Vàng nhạt 18 SUHG4 Trắng
hồng Hồng 8,1 5 Mô Len xốp Mỏng, sợi +++ -
Chú thích: - : không có Tốc độ mọc: +++: Nhanh
++ : Vừa
Về đặc điểm khuẩn ty và bào tử:
Sau khi quan sát nấm trong tiêu bản giọt ép dưới độ phóng đại 400 lần và 1000 lần của kính hiển vi quang học Olympus thì tất cả 18 dòng nấm khuẩn ty đều có vách ngăn ngang. Tuy nhiên các dòng nấm có sự khác biệt về hình dạng bào tử như sau: có 7 dòng nấm có bào tử dạng hình trụ dài, nhọn hai đầu và có nhiều giọt dầu trong tế bào chất (chiếm 38,9%); 9 dòng nấm có bào tử dạng hình trụ ngắn (chiếm 50%); các dòng còn lại có dạng bào tử hình trụ, thuôn nhọn một đầu (chiếm 11,1%). Kết quả này cũng tương tự như những nghiên cứu của một số tác giả khác (Damm et al., 2009), (Meizhu Du et al., 2005) nghiên cứu về nấm Colletotrichum sp. trên các đối tượng khác nhau.
Chú thích: A: CCT1; B: XHG3; C: ĐĐCT3.
Bảng 7: Đặc điểm khuẩn ty và bào tử của 18 dòng nấm Colletotrichum sp. được phân lập. STT Tên dòng nấm Hình dạng bào tử Kích thước bào tử
(µm) Khuẩn ty Nguồn gốc thu mẫu
1 CCT1 Trụ dài, thuôn
nhọn hai đầu
15,4 - 20,5 x 2,6- 2,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Lê Bình, Cái Răng
2 XCT1 Trụ ngắn 5,7-7.8 x 1,4-2,4
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Lê bình,Cái Răng
3 XHG3 Trụ ngắn 4,2-5,5 x 1,3-1,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Châu Thành A, Hậu Giang
4 SRHG1 Trụ ngắn 3,4-5,9 x 1,71-2,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Bình, Phụng Hiệp
5 SRHG2 Trụ ngắn 5,3-5,9 x 2-2,5
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Bình, Phụng Hiệp
6 MCHG1 Trụ dài, thuôn
nhọn hai đầu 13-15,2 x 2,6-3,4
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Bình, Phụng Hiệp
7 DHHG2 Trụ dài, thuôn
nhọn hai đầu 14,2-15,1 x 1,4-2,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Châu Thành A, Phụng Hiệp
8 OHG3.4 Trụ ngắn 6,1-7,5 x 2,6-2,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Bình, Phụng Hiệp
9 MAHG4 Trụ dài, thuôn
nhọn hai đầu 15,4-18,8 x 2,6-2,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Bình, Phụng Hiệp
10 ĐĐCT3 Trụ ngắn, thuôn nhọn một đầu 4,4-5,7 x 1,8-2,7
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Lê Bình, Cái Răng
11 ĐĐHG1 Trụ ngắn 5,9-8,5 x 2,1-3,3
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Hiệp, Phụng Hiệp
STT Tên dòng
nấm Hình dạng bào tử
Kích thước bào tử
(µm) Khuẩn ty Nguồn gốc thu mẫu
12 MHG1 Trụ dài, thuôn
nhọn hai đầu 15,4-17,1 x 2,2-2,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Long, Phụng Hiệp
13 MHG4 Trụ dài, thuôn
nhọn hai đầu 14,3-15,3 x 1,4-2,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Long, Phụng Hiệp
14 BHG2 Trụ ngắn 5,3-6,6 x 1,7-2,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Long, Phụng Hiệp
15 KHHG2 Trụ ngắn 5,9-8,5 x 2,6-3,4
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Long, Phụng Hiệp
16 ĐQHG3 Trụ ngắn, thuôn nhọn một đầu 4,7-5,8 x 2-2,6
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Long, Phụng Hiệp
17 DLHG5 Trụ dài, thuôn
nhọn hai đầu 15,4-18,8 x 2,6-2,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Long, Phụng Hiệp
18 SUHG4 Trụ ngắn 4,3-5,3 x 1,8-2,9
Mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm
Tân Long, Phụng Hiệp
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Đã phân lập được 18 dòng nấm thuần từ 75 mẫu bệnh được thu thập tại các địa điểm khác nhau ở huyện Phụng Hiệp, huyện Châu Thành A thuộc tỉnh Hậu Giang, và quận Cái Răng thuộc Thành phố Cần Thơ.
5.2. Đề nghị
Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để định danh chính xác các dòng nấm phân lập được.
Cần thu thập thêm nhiều mẫu bệnh trên các loại cây khác nằm trong cũng như ngoài hai tỉnh đã phân lập để phục vụ cho việc thống kê tình hình dịch bệnh và có biện pháp phòng trừ hiệu quả.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2008). Giáo trình thực tập vi sinh đại cương. Nxb. Đại học cần thơ, Tr.32.
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành (2010). Giáo trình Nấm Học. Nxb. Đại học cần thơ. Tr.105-111.
Lê Hoàng Lệ Thủy và Phạm Văn Kim. 2008. Phân loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên xoài và sầu riêng tại Đồng Bằng Sông Cửu Long và thử hiệu lực của sáu loại thuốc đối với các loài nấm nầy. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ (10), tr. 31-42.
Phạm Văn Kim (1999). Giáo trình Các nguyên lý về bệnh hại cây trồng. Nxb. Đại học Cần Thơ, tr.66-75.
Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề, Nguyễn Kim Vân, Đỗ Tấn Dũng, Nguyễn Ngọc Châu, Ngô Thị Xuyên, Nguyễn Văn Viên, Vũ Hữu Yêm, Ngô Bích Hảo. 2007. Giáo trình Bệnh cây đại cương. Trường đại học nông nghiệp I - Hà Nội, tr. 48-53.
Tiếng Anh
Damm U, Woudenberg JHC, Cannon PF, Crous PW. 2009. Colletotrichum species with curved conidia from herbaceous hosts. Fungal Diversity 39, pp.45–87. Freeman S, Minq D, Maymon M, Zverbil A. 2001. Genetic diversity within
Colletotrichum acutatum sensu Simmonds. Phytopathology 91, pp.586–592. Freeman S, Shabi E, Katan T. 2000. Characterization of Colletotrichum acutatum
causing anthracnose of anemone (Anmone coronaria L.) Applied and Environmental Microbiology 66, pp.5267–5272.
Freeman S, Katan T, Shabi E. 1996. Differentiation between Colletotrichum gloeosporioides from avocado and almond using molecular and pathogenicity tests. Applied and Environmental Microbiology 62, pp.1014–1020.
Hyde KD, Cai L, Cannon PF, Crouch JA, Crous PW, Damm U, Goodwin PH, Chen H, Johnston PR, Jones EBG, Liu ZY, McKenzie EHC, Moriwaki J, Noireung P, Pennycook SR, Pfenning LH, Prihastuti H, Sato T, Shivas RG, Tan YP, Taylor
PWJ, Weir BS, YangYL, Zhang JZ. 2009. Colletotrichum: names in current use.
Fungal Diversity 39, pp.147–182.
Hyde KD, Cai L, McKenzie EHC, Yang YL, Zhang JZ, Prihastuti H. 2009 –
Colletotrichum: a catalogue. Fungal Diversity 39, pp.1–17.
Hyde KD, McKenzie EHC, KoKo TW. 2011. Towards incorporating anamorphic fungi in a natural classification: checklist notes for 2010. Mycosphere 2, pp.1–88. Hyde KD, Bahkali AH, Moslem MA. 2010 – Fungi an unusual source. Fungal
Diversity 43, pp.1–9.
Kim H, Lim TH, Kim J, Kim YH, Kim HT. 2009. Potential of cross-infection of
Colletotrichum species causing anthracnose in persimmon and pep. Pathology Journal 25, pp.13–20
Liu Xie, Jing-ze Zhang, Yao Wan, and Dong-wei Hu. 2010. Identification of
olletotrichum spp. isolated from strawberry in Zhejingang Province and Shanghai, China. Journal of Zhejiang University SCIENCE B 11, pp.61-70.
Nguyen THP, Sall T, Bryngelsson T, Liljeroth E. 2009. Variation among
Colletotrichum gloeosporioides isolates from infected coffee berries at different locations in Vietnam. Plantpathology 58, pp.898–909
Ralph Dean, Jan A. L. Van Kan, Zacharias A. Pretorius, Kim E. Hammond-Kosack, Antonio Di Pietro, Pietro D. Spanu, Jason J. Rudd, Marty Dickman, Regine Kahmann, Jeff Ellis and Gary D. Foster. 2012. The Top 10 fungal pathogens inmolecular plant pathology. Molecular Plant Pathology, pp.1-17
Simmonds JH. 1965. A study of the species of Colletotrichum causing ripe fruit rots in Queensland. Queensland Journal Agriculture and Animal Science 22,pp.437–