1. Rửa mẫu bệnh dưới nước máy để loại bỏ bụi bẩn. 2. Rửa mẫu bằng cồn 70%.
3. Cẩn thận dùng kéo hoặc dao vô trùng cắt mẫu lá thành từng mẩu nhỏ (5x5mm) tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh.
4. Nhúng mô bệnh vào dung dịch cồn 700 trong 3 phút (có thể thay đổi nồng độ phụ thuộc vào tính chất mô cây, ví dụ một số lá cây có bề mặt rất xốp, có thể hấp thụ dung dịch khử trùng đủ làm chết vi sinh vật hại).
5. Lấy mẫu ra khỏi dung dịch khử trùng bề mặt và rửa lại bằng nước cất, sau đó làm khô mẫu bằng cách đặt mẫu lên giấy lọc đã tiệt trùng (nếu có thể nên để trong tủ cấy có hệ thống thổi lọc không khí). Cắt mẫu bệnh thành từng miếng cấy nhỏ khoảng 2 x 2 mm sau đó đặt lên môi trường agar - nước cất hoặc môi trường khoai tây - đường - agar. Việc để mẫu khô trước khi cấy có tác dụng hạn chế sự phát triển của vi khuẩn lẫn tạp. Khi đặt mẫu cấy lên môi trường agar cần
mở và đóng nắp hộp Petri nhanh để tránh vi sinh vật lẫn tạp từ không khí xung quanh.
6. Sau khi cấy xong, đặt ngược đĩa Petri để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Hầu hết các nấm bệnh thực vật đều phát triển tốt ở 25°C. 7. Để đạt được mẫu nấm thuần, không lẫn tạp có thể dùng phương pháp cấy đơn
bào tử.
Phương pháp cấy đơn bào tử
Cấy đơn bào tử là quá trình cấy truyền một bào tử đã nảy mầm để tạo một mẫu nấm thuần. Phương pháp này thích hợp cho việc làm thuần những chi nấm tạo bào tử trên môi trường nhân tạo, như Fusarium, Colletotrichum, Alternaria, Stemphylium, Bipolaris, Verticillium và Phoma.
Quy trình cấy đơn bào tử:
1. Khử trùng que cấy.
2. Tạo dung dịch bào tử bằng cách dùng que cấy lấy một lượng nhỏ sợi nấm trên mặt thạch có lẫn bào tử hoặc lấy một chút bào tử từ khối bào tử lớn của nấm rồi cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng.
3. Lắc ống nghiệm để phân tán các bào tử và kiểm tra mật độ bào tử bằng cách quan sát ống nghiệm trước ánh sáng hoặc kiểm tra một giọt dịch bào tử dưới kính lúp soi nổi. Tránh tạo dịch bào tử với mật độ bào tử quá cao
4. Làm loãng với nước vô trùng nếu cần.
5. Đổ dịch bào tử vào một đĩa Petri có chứa một lớp mỏng môi trường thạch nước cất.
6. Đổ dịch bào tử thừa từ đĩa Petri đi. Một số bào tử sẽ nằm lại trên mặt thạch. 7. Để đĩa Petri trong khoảng 18 giờ cho đến khi bào tử nảy mầm.
8. Kiểm tra đĩa Petri dưới kính lúp soi nổi với nguồn sáng phía dưới. (Điều chỉnh nguồn sáng cẩn thận để có sự tương phản tốt giữa thạch, bào tử, và các ống mầm.)
9. Dùng kim mũi mác cắt lấy một khối agar có chứa bào tử nảy mầm và chuyển sang một đĩa môi trường mới