Tiếp tục nghiên cứu bào chế và đánh giá đặc tính của phức hợp lipid amphotericin b

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THÙY NGÂN TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA PHỨ P LIPID AMPHOTERICIN B KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1.TS. Trần Thị Hải Yến 2.DS. Dương Thị Thuấn Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THÙY NGÂN

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA PHỨC

HỢP LIPID AMPHOTERICIN B

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THÙY NGÂN

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

Nơi thực hiện:

Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2015

Nhân đây, em cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo em suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh cổ vũ, cho em chỗ dựa tinh thần vững chắc và là nguồn động lực lớn lao cho em trong suốt quá trình 5 năm học

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Lê Thị Thùy Ngân

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Amphotericin B 2

1.1.1.Nguồn gốc 2

1.1.2 Công thức hóa học 2

1.1.3 Đặc tính lý hóa 2

1.1.4 Phổ tác dụng và cơ chế tác dụng 3

1.1.5 Dược động học 4

1.1.6 Chỉ định 4

1.1.7 Tác dụng không mong muốn 5

1.1.8 Liều dùng 5

1.1.9 Một số chế phẩm tiêm của Amphotericin B trên thị trường 6

1.2 Phức hợp lipid Amphotericin B 7

1.2.1 Khái quát về phức hợp lipid Amphotericin B 7

1.2.2 Cơ chế hình thành 9

1.2.3 Thành phần phospholipid trong phức hợp 10

1.2.4 Độ ổn định của phức hợp lipid AMB 12

1.2.5 Ưu nhược điểm 12

1.3 Một số nghiên cứu về phức hợp lipid Amphotericin B 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp bào chế phức hợp lipid Amphotericin B 17

2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc tính về hình thức, phân bố KTTP của phức hợp lipid Amphotericin B 20

2.3.3 Phương pháp làm nhỏ kích thước tiểu phân của phức hợp lipid Amphotericin B 20

2.3.4 Phương pháp đánh giá hiệu suất tạo phức hợp lipid Amphotericin B 21

2.3.5 Tính ổn định về KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất bắt giữ của phức hợp lipid Amphotericin B 22

2.3.6 Phương pháp chứng minh mẫu bào chế là phức hợp lipid 22

2.4 Điều kiện thí nghiệm 23

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Khảo sát một số yếu tố công thức ảnh hưởng đến các đặc tính của phức hợp lipid 24

3.1.1 Ảnh hưởng tỉ lệ dược chất/tổng số mol phospholipid (M/M) 24

3.1.2 Ảnh hưởng của pha nước 26

3.1.3 Theo dõi độ ổn định về KTTP, phân bố KTTP mẫu A1 và B1 28

3.1.4 Chứng minh mẫu A1 và B1 là phức hợp lipid bằng phương pháp quét nhiệt vi sai 29

3.2 Bào chế phức hợp lipid Amphotericin B có tỉ lệ mol AMB bằng 100%/ tổng số mol lipid 31

3.2.1 Ảnh hưởng của pha nước 32

3.2.2 Phương pháp hydrat hóa màng film 33

3.2.3 Phương pháp làm nhỏ kích thước tiểu phân 35

3.2.4 Độ ổn định về KTTP, phân bố KTTP của mẫu N2 sau siêu âm 3’ 36

3.2.5 Chứng minh công thức N2 là phức hợp lipid bằng phương pháp quét nhiệt vi sai 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC

12 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

13 TKHH Tinh khiết hóa học

14 USP United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

15 Zaverage Kích thước tiểu phân trung bình

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 6

Bảng 2.1 Nguyên liệu 16

Bảng 3.1 Thành phần các công thức nhóm thay đổi tỉ lệ dược chất 23

Bảng 3.2 KTTP, phân bố KTTP các công thức nhóm thay đổi tỷ lệ AMB 24

Bảng 3.3 Thành phần các công thức trong nhóm thay đổi pha nước 26

Bảng 3.4 KTTP, phân bố KTTP của nhóm thay đổi pha nước 26

Bảng 3.5 KTTP, phân bố KTTP mẫu A1 sau bào chế và trong quá trình bảo quản

27

Bảng 3.6 Thành phần các công thức trong nhóm thay đổi pha nước 31

Bảng 3.7 KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất nạp mẫu M2 33

Bảng 3.8 KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất nạp mẫu N2 33

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của siêu âm 30s nghỉ 30s đến việc giảm KTTP 34

Bảng 3.10 KTTP, phân bố KTTP mẫu N2 siêu âm 3 phút sau siêu âm và sau bảo quản 1 tuần 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cơ chế tác dụng của AMB 3

Hình 1.2 Hình dạng cấu trúc ba chế phẩm với lipid của AMB hiện có trên thị trường 8

Hình 1.3 Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB 10

Hình 1.4 Phân tử HSPC 11

Hình 1.5 Phân tử DSPG 11

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn quy trình bào chế phức hợp lipid AMB bằng phương pháp thay đổi dung môi 18

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn quy trình bào chế phức hợp lipid AMB bằng phương pháp hydrat hóa màng film 19

Hình 3.1 Mẫu CT3 và CT4 sau 1 tuần bào chế 24

Hình 3.2 Đồ thị KTTP, phân bố KTTP nhóm thay đổi tỉ lệ AMB 25

Hình 3.3 Đồ thị quét nhiệt vi sai mẫu A1 28

Hình 3.4 Đồ thị quét nhiệt vi sai mẫu B1 29

Hình 3.5 Đồ thị quét nhiệt vi sai hỗn hợp HSPC: DSPG (7:3) 30

Hình 3.6 Mẫu N2 sau bào chế 33

Hình 3.7 Đồ thị quét nhiệt vi sai của mẫu N2 36

Hình 3.8 Đồ thị quét nhiệt vi sai mẫu B1 37

Hình 3.9 Đồ thị quét nhiệt vi sai hỗn hợp HSPC: DSPG (7:3) 37

là kết quả sự phá vỡ của cấu trúc liposome và tiếp đến là sự tái sắp xếp lại của các phân tử lipid và dược chất khi được sử dụng ở hàm lượng cao hơn là hệ mang thuốc

có nhiều triển vọng trong giảm độc tính và tăng khả năng mang dược chất

Trong đề tài nghiên cứu của Dược sĩ Nguyễn Thị Mỹ đã bào chế được phức hợp lipid chứa AMB có tỷ lệ SPC: DSPG là 7:3 với tổng số mol lipid là 200 µmol; môi trường phân tán đệm pH 7,4; và 25 mol % AMB/tổng lượng lipid cho hiệu suất nạp dược chất cao (87,06 %), KTTP là 648,3 nm; phân bố KTTP tương đối đồng đều (PDI = 0,363) Tuy nhiên nghiên cứu chưa đưa ra phương pháp chứng minh mẫu sau bào chế là phức hợp lipid Do đó, để góp phần ứng dụng phức hợp lipid

làm chất mang thuốc và giảm độc tính của thuốc, chúng tôi nghiên cứu đề tài “ Tiếp

tục nghiên cứu bào chế và đánh giá đặc tính của phức hợp lipid Amphotericin B” nhằm mục tiêu:

+ Xây dựng được công thức và phương pháp bào chế phức hợp lipid Amphotericin B

+ Đánh giá được một số đặc tính: kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân và hiệu suất tạo phức hợp lipid của hệ phức hợp lipid Amphotericin B

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Nguồn gốc

Amphotericin B là một hỗn hợp các polyen chống nấm được sản xuất bằng

cách nuôi cấy một số giống Streptomyces nodosus hoặc bằng các phương pháp

khác, chứa chủ yếu là amphotericin B [2] Đặc tính kháng khuẩn được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1950 và được đưa vào thị trường vào năm 1958 [10]

1.1.2 Công thức hóa học

- Công thức hóa học: acid ( 1R, 3S, 5R, 6R, 9R, 11R, 15S, 16R, 17R, 18S, 19E, 21E, 23E, 25E, 27E, 31E, 33R, 35S, 36R, 37S) -33-[(3-amino-3,6-dideoxy-β-D-mannopyranosyl)oxy]-1, 3, 5, 6, 9, 11, 17, 37-octa-hydroxy-15, 16, 18 trimethyl-

13 –oxo-14, 39-dioxa-bicyclo-[33.3.1] nonatriaconta-19, 21, 23, 25, 27, 29, heptaen-36 carboxylic [2]

- Độ tan: không tan trong nước ở pH từ 6 đến 7, tan trong dimethylsulphoxid (DMSO) 30- 40 mg/ml và propylene glycol, khó tan trong dimethylformamid (2- 4 mg/ml), rất khó tan trong methanol [1]

+ Dung dịch 0,0005% trong methanol ở vùng sóng từ 300- 450 nm có cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với ở 405 nm là 0,87- 0,93 [1]

Hình 1.1 Cơ chế tác dụng của AMB

Amphotericin B gắn vào ergosterol trên màng tế bào nấm, làm thay đổi tính thấm của màng tế bào với các ion, nhất là K+, Mg2+, nên tế bào nấm bị tiêu diệt Các vi khuẩn và virus không có ergosterol nên không nhạy cảm với amphotericin B và các polyen khác Trên người và động vật, amphotericin B gắn được vào cholesterol, gây các tác dụng không mong muốn [3]

Ái lực của AMB với ergosterol màng tế bào nấm lớn hơn với cholesterol màng

tế bào người nên AMB thể hiện tác dụng chống nấm chủ yếu nhưng vẫn tiềm tàng tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tổn thương thận với các biểu hiện: suy thận, tăng creatinin và ure huyết, rối loạn chuyển hoá, tăng kali máu… [3]

1.1.5 Dược động học

- Hấp thu: AMB hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa, do vậy thuốc chủ yếu được tiêm truyền tĩnh mạch để điều trị nhiễm nấm nặng toàn thân và chỉ dùng

đường uống để điều trị tại chỗ (nhiễm nấm đường tiêu hóa và niêm mạc miệng)

- Phân bố: Amphotericin B liên kết với protein ở mức cao Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể nhưng chỉ một lượng nhỏ vào dịch não tủy Nửa đời của thuốc trong huyết tương khoảng 24h, khi dùng thời gian dài, nửa đời cuối cùng có thể tới

15 ngày Chi tiết về sự phân bố trong các mô vẫn chưa được biết

- Chuyển hóa: Chưa được làm rõ

- Thải trừ: Amphotericin B bài tiết rất chậm qua thận, với 2 - 5% liều đã dùng bài tiết dưới dạng hoạt tính sinh học Sau khi ngừng điều trị, vẫn có thể tìm thấy thuốc trong nước tiểu ít nhất sau 7 tuần Lượng thuốc tích lũy trong nước tiểu sau 7 ngày xấp xỉ 40% lượng thuốc đã truyền Có thể do vậy mà amphotericin có nguy cơ gây độc cao với thận Không loại được amphotericin ra khỏi cơ thể bằng thẩm tách

máu [4]

1.1.6 Chỉ định

- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida

albicans ở miệng và ở đường tiêu hóa

- Tiêm tĩnh mạch AMB dùng để điều trị nhiễm nấm toàn thân nặng do nhiễm

Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidiodesimmitis, Cryptococus,

Hitstoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum

- Phòng nhiễm nấm cho bệnh nhân sốt kéo dài và giảm bạch cầu trung tính đã điều trị lâu bằng kháng sinh phổ rộng hoặc điều trị ung thư bằng hóa chất

- Dạng liposome hoặc phức hợp lipid: chỉ định cho trường hợp điều trị thất bại bằng AMB thông thường hoặc trong trường hợp AMB có thể gây độc cho thân hoặc gây suy thận [4]

1.1.7 Tác dụng không mong muốn

- Phản ứng chung: sốt, rét run, nôn, đau đầu, đau cơ khi mới tiêm truyền

- Độc với thận: giảm sức lọc cầu thận, hoại tử thận

- Tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, độc với gan tim, giảm K+ và

Mg2+ huyết, đau và viêm tắc tĩnh mạch nơi tiêm [3]

1.1.8 Liều dùng

Đường tiêm, truyền tĩnh mạch: Thông thường amphotericin được truyền tĩnh

mạch Trước khi bắt đầu điều trị với bất cứ dạng tiêm tĩnh mạch nào của amphotericin, phải cho 1 liều test và phải theo dõi người bệnh cẩn thận trong khoảng 30 phút

AMB quy ước (Fungizone): Sau khi cho liều test ban đầu (1 mg tiêm truyền trong vòng 20 - 30 phút), điều trị thường bắt đầu với liều hàng ngày 250 microgam/kg, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày; nếu người bệnh rất nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1 ngày Nếu điều trị phải ngừng lâu trên

7 ngày, khi bắt đầu tiêm lại, liều phải là 250 microgam/kg/ngày và tăng dần Liều hàng ngày được tiêm truyền trong vòng 2 - 4 giờ với nồng độ 100 microgam/ml với dung dịch glucose 5% Có thể tiêm truyền chậm hơn, tới 6 giờ, để giảm tỷ lệ tác dụng độc cấp

Amphotericin dạng liposom: Sau 1 liều test ban đầu (1 mg tiêm truyền trong

10 phút), liều thông thường là 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3 mg/kg nếu cần Liều

hàng ngày được tiêm truyền trong vòng 30 - 60 phút với nồng độ 200 đến 2000 microgam/ml trong dung dịch glucose 5%

Phức hợp lipid amphotericin: Sau 1 liều test ban đầu (1 mg tiêm truyền trong

15 phút), liều thông thường là 5 mg/kg/ngày Liều hàng ngày được truyền với tốc

độ 2,5 mg/kg/giờ như 1 dịch treo pha loãng chứa 1 mg/ml trong dung dịch glucose 5%

Amphotericin cũng còn được dùng tại chỗ hoặc dung dịch phun sương [3, 4]

1.1.9 Một số chế phẩm tiêm của Amphotericin B trên thị trường

Bảng 1.1: Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường [6,11]

TT Tên chế

phẩm

Hàm lượng Thành phần

Dạng cấu trúc

Kttp (µm)

Dạng bào chế

Liều dùng

1 Fungizone 50 mg AMB và natri

deoxycholat Micell < 0,4

Bột đông khô

1 mg/kg/ ngày

2 Abelcet

100 mg/20

ml

DMPC:DMPG:AMB (tỷ lệ mol 7:3:10)

Phức hợp lipid dạng dải ruy băng

1-10 Hỗn

dịch

5 mg/kg/ ngày

Phức hợp lipid dạng đĩa

0,12

Bột đông khô

3 -4 mg/kg/ ngày

(tỷ lệ mol 1:1)

4 Ambisome 50 mg

HSPC:DSPG:

Chol:AMB (tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4)

Liposome 0,08

Bột đông khô

3 – 5 mg/kg/ ngày

1.2 Phức hợp lipid Amphotericin B

1.2.1 Khái quát về phức hợp lipid Amphotericin B

Ngày nay, có nhiều nghiên cứu tạo phức AMB trong các dạng bào chế kết hợp với lipid (lipid-based formulations) nhằm giảm lượng AMB tự do, từ đó nâng cao chỉ số điều trị của AMB [14]

Hiện có 3 chế phẩm thương mại khác nhau kết hợp với lipid của AMB trên thị trường Chúng khác nhau về hình thái, thành phần, hoạt tính sinh học: AmBisome (nghiên cứu sản xuất bởi công ty dược phẩm Nexstar) có cấu trúc dạng liposome một lớp, kích thước nhỏ Các dạng cấu trúc khác có chứa hàm lượng AMB cao hơn: Amphotec (nghiên cứu và sản xuất bởi Liposome Technology Inc.) phức hợp là các phân tử dạng đĩa có chứa AMB, cholesterol sunlfat Abelcet (nghiên cứu và sản xuất bởi The Liposome Company Ltd) bao gồm AMB liên kết với hai phospholipid tổng hợp (DMPC, DMPG) trong đó tỉ số mol AMB/phospholipid là 1:1 tạo một phức hợp có cấu trúc dạng chuỗi có KTTP từ 1600nm đến 11µm [21, 12]

Hình 1.2 Hình dạng cấu trúc ba chế phẩm với lipid của AMB hiện có trên

Sự giảm độc tính tối đa trên chuột đã đạt được khi tỉ lệ mol AMB với lipid là 1:1 [13]

Tuy nhiên, hiện nay đang sử dụng các phospholipid tổng hợp đắt tiền Có thể thay thế DMPC và DMPG bởi các phospholipid tự nhiên như từ lòng đỏ trứng hoặc đậu nành hoặc phospholipid tự nhiên đã được hydro hóa một phần [21]

1.2.2 Cơ chế hình thành

Bản chất chính xác của quá trình tương tác giữa AMB với HSPC và DSPG tạo liposom vẫn chưa được biết rõ ràng nhưng theo bằng chứng từ một báo cáo thí nghiệm của Fujii và các cộng sự thì khi nồng độ AMB trong lớp kép lipid của liposom tăng quá một nồng độ tới hạn, thuốc sẽ tồn tại ở trạng thái tập hợp [14] Phân tử AMB có tính lưỡng thân: một đầu thân nước, một đầu thân dầu Trong môi trường nước, khi nồng độ AMB dưới nồng độ tạo micell tới hạn, sự phối hợp giữa AMB với phospholipid tạo liposom, sự xâm nhập của các monomer AMB vào lớp lipid của liposom dường như là khó khăn do phần chuỗi polyhydroxy thân nước trong cấu tạo của phân tử Do đó các phân tử AMB bị giới hạn ở mặt trung gian giữa hai màng lipid

Khi AMB ở nồng độ lớn hơn, AMB có thể chèn vào, gây phá vỡ cấu trúc màng kép lipid của liposom AMB sẽ tự kết tụ với nhau, các phân tử lipid được xen

kẽ vào

giữa các phân tử AMB để hình thành cấu trúc phức hợp

Một mô hình được đưa ra để mô tả tương tác giữa AMB và lipid trong phức hợp lipid chứa AMB như sau:

Hình 1.3 Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB [21]

Sự sắp xếp giữa lipid và AMB này phù hợp với nhiều nghiên cứu đã quan sát được Trong phức hợp, đuôi hydrocacrbon thân dầu của lipid gắn với chuỗi polyen của AMB, gốc phosphat của phân tử lipid hướng về phía gốc amin của phân tử AMB, hình thành một hình trụ tròn Các hình trụ nhỏ này xếp cạnh nhau kéo dài cấu trúc chuỗi Khó có thể nói chính xác khoảng kích thước độ dài chuỗi này Độ dày của phức hợp này bằng một nửa độ dày của màng kép lipid thông thường [13]

1.2.3 Thành phần phospholipid trong phức hợp

Là thành phần cơ bản cấu tạo nên tiểu phân phức hợp lipid, là những phân tử lưỡng thân, vừa thân dầu, vừa thân nước, cấu tạo từ khung phân tử glycerol gắn với các nhóm phân cực và các acid béo Nhóm phân cực có thể tích điện âm, dương, có thể không tích điện, các acid béo có thể no hoặc không no [6]

Các phospholipid được sử dụng trong phức hợp lipid Amphotericin B bao gồm: Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG), phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC), distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), [13, 18, 19]

Các phospholipid tổng hợp như DMPC, DMPG có giá thành cao, có thể thay thế bằng các phospholipid tự nhiên hoặc phospholipid tự nhiên hydrogen hóa (HSPC) [20]

Các phospholipid được dùng trong công thức bào chế:

Khi lựa chọn phospholipid cần lưu ý đến:

+ Mức độ bão hòa: có phospholipid không no (như phosphatidylcholin lòng đỏ trứng, phosphatidylglycerin…); phospholipid no (như dipalmytol phosphatidylcholin, dipalmitidyl phosphatidic…) Các phospholipid không no dễ bị oxy hóa dẫn đến hỏng phức hợp ảnh hưởng đến độ ổn định của phức hợp lipid + Khả năng tích điện: một số phospholipid tích điện dương (stearylamin), còn một số tích điện âm (như acid phosphatidic, phosphatidylserin…) Phospholipid tích điện tạo ra lực đẩy tĩnh điện tạo ra liên kết tĩnh điện với dược chất tích điện Một số

hợp lipid có thể làm thay đổi đặc tính dược động học và sự phân bố của liposom, phức hợp lipid trong cơ thể

+ Mức độ tinh khiết: hiện các phospholipid dùng bào chế liposom cũng như bào chế phức hợp lipid được bán sẵn trên thị trường Tuy nhiên sản phẩm của các nhà sản xuất khác nhau có mức độ tinh khiết khác nhau Tùy theo mục đích của nghiên cứu và sử dụng có thể lựa chọn loại phospholipid thích hợp [6]

1.2.4 Độ ổn định của phức hợp lipid AMB

Với thành phần cấu tạo chính là phospholipid, phức hợp lipid AMB được coi

là dạng bào chế kém ổn định cả về mặt vật lý, hóa học và sinh học Sự thay đổi đặc tính lý hóa của phức hợp lipid AMB có thể xảy ra ngay trong quá trình bào chế cũng như trong quá trình bảo quản [6]

Về mặt hóa học: sự kém ổn định về mặt hóa học của phức hợp lipid là do quá trình oxy hóa chuỗi acid béo không no của phân tử phospholipid và quá trình thủy phân của phospholipid tạo ra các lysophospholipid Quá trình oxy hóa tăng nhanh

do tác động của các yếu tố: nhiệt độ, ánh sáng, chiếu xạ…[6]

Về mặt vật lý: sự kém ổn định về mặt vật lý của phức hợp lipid AMB có thể là

do sự có mặt của các thành phần tích điện trên bề mặt gây ra hiện tượng kết tụ tiểu phân trong quá trình bảo quản Khi sử dụng các phospholipid có nhiệt độ chuyển pha thấp có thể gây ra hiện tượng chuyển pha (từ gel có cấu trúc bền chặt sang dạng lỏng liên kết lỏng lẻo) cũng có thể là một yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính vật lý của phức hợp Trạng thái vật lý của phức hợp lipid AMB có thể được đánh giá thông qua các chỉ số: kích thước tiểu phân và thế Zeta [6]

1.2.5 Ưu nhược điểm

1.2.5.1 Ưu điểm

Phospholipid là tá dược phân giải sinh học cao, không độc với cơ thể, không gây đáp ứng miễn dịch khi đưa vào cơ thể [6]

Các dạng bào chế kết hợp với lipid (lipid-based formulations) cải thiện được

độ tan của dược chất ít tan trong nước, đặc biệt là các thuốc thuộc nhóm II và nhóm

IV trong hệ thống phân loại sinh dược học BCS Các dạng bào chế phối hợp với

lipid cũng có thể bảo vệ dược chất bởi sự phân hủy sinh học hoặc sự chuyển dạng,

do đó có thể tăng hiệu lực của thuốc Thêm nữa, hệ phức hợp lipid có thể giảm độc tính của nhiều loại thuốc bằng cách thay đổi sự phân bố sinh học của thuốc, tránh các tổ chức nhạy cảm Việc giảm được độc tính cho phép nhiều dược chất có thể sử dụng được hơn và là nền tảng cho sự thành công của một số chế phẩm dựa trên lipid của AMB như Ambisome, Abelcet [14]

Giảm độc tính của thuốc: trong phức hợp lipid của AMB, phân tử AMB sẽ liên kết chặt chẽ với các phân tử lipid trong phức hợp, do đó không còn AMB tương tác với cholesterol trên màng tế bào – tương tác gây nên độc tính của AMB trên người, đặc biệt trên thận Dù có sự liên kết chặt chẽ với lipid trong phức hợp xong phức hợp với lipid này vẫn giữ được tác dụng chống nấm của AMB Điều này được giải thích là do sự giải phóng chọn lọc và từ từ AMB ra khỏi phức hợp [17, 21] Phức hợp lipid AMB cho phép cải thiện khả năng dung nạp AMB, có thể giải thích do đặc điểm dược động học của phức hợp lipid này: phức hợp lipid AMB nhanh chóng thanh thải khỏi máu và có thể tích phân bố lớn Sau khi tiêm, phức hợp lipid AMB nhanh chóng bị thực bào và tập trung tại các mô, đặc biệt gan, lách

và phổi là những nơi thường bị nhiễm nấm Candida và Aspergilus nghiêm trọng [21]

Trong ba công thức thương mại phối hợp với lipid của AMB hiện có trên thị trường, chỉ phức hợp lipid AMB mới đạt được nồng độ AMB trong phổi cao hơn so với dạng AMB quy ước Trong khi đó, phổi được biết đến là đường vào của nhiều loại nấm gây bệnh, nồng độ AMB cao hơn trong phổi ít nhất về mặt lý thuyết là sẽ giảm được sự phân bố, xâm nhập của các tác nhân này vào đường máu [16]

Phức hợp lipid của AMB liều đơn giúp cho việc sử dụng thuốc đơn giản hơn, tránh phải sử dụng nhiều lần Trong điều trị nấm Candida, việc sử dụng phức hợp lipid chứa AMB dùng liều đơn cho phép đạt hiệu quả tương đương hoặc tốt hơn so với sử dụng AMB đa liều thông thường, giảm được nguy cơ xảy ra các tác dụng không mong muốn do giảm được lượng AMB cần phải sử dụng và giảm được chi

phí điều trị so với chi phí khi sử dụng AMB đa liều thông thường với thời gian điều trị kéo dài [8]

Chi phí điều trị nhiễm nấm với phức hợp lipid chứa AMB thấp hơn so với điều trị với dạng liposom của AMB [15, 21]

1.2.5.2 Nhược điểm

Đa số phương pháp bào chế phức hợp lipid giống với các phương pháp bào chế liposom là có sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid, do đó có thể gây tác

động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi trường [9]

Phospholipid không bền về mặt hóa học nên tuổi thọ của dạng bào chế phức hợp lipid ngắn Các phospholipid sử dụng đa số được chiết từ nguồn nguyên liệu tự nhiên, do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên liệu Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm của quá trình oxy hóa phospholipid [22]

1.3 Một số nghiên cứu về phức hợp lipid Amphotericin B

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phức hợp lipid AMB có thể được bào chế bằng các phương pháp tương tự như các phương pháp bào chế liposom đã được nghiên cứu [14]

Malika Larabi và các cộng sự đã tiến hành bào chế hệ hỗn dịch của AMB bằng phương pháp thay đổi dung môi Trong nghiên cứu, AMB (3,5 mg hòa tan trong 10

ml methanol) được phối hợp với một dung môi hữu cơ có chứa các tỉ lệ khác nhau của DMPC: DMPG (5 ml methanol) tại 40oC Pha hữu cơ này (15ml) sau đó được phối hợp với pha nước (MilliQRwater, 15ml, waters Millipore, France) kết hợp khuấy từ ở nhiệt độ phòng để đồng nhất Thể tích được giảm đi bằng cách bay hơi ở

áp suất thấp đến 5 ml Tỉ lệ AMB/phospholipid thay đổi từ 5% đến 50% và DMPC/DMPG thay đổi từ 10:0 đến 0:10 mol/mol Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, KTTP và PDI của phức hợp lipid với AMB phụ thuộc vào tỉ lệ AMB/phospholipid khi thành phần phospholipid là DMPC: DMPG bằng 7:3 (mol/mol) Kích thước tối

ưu và chỉ số đa phân tán nhỏ nhất khi AMB đạt 35% khối lượng so với phospholipid trong công thức Công thức phức hợp lipid tốt nhất

(DMPC/DMPG/AMB là 7:3:5) đã ổn định trong 6 tháng sau bào chế và được bảo quản ở nhiệt độ 4oC mà không thay đổi kích thước tiểu phân trong khi KTTP của các công thức khác tăng lên chỉ sau vài ngày bào chế có hoặc không có hiện tượng kết tủa [20]

Andrew S.Janoff cùng các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về sự liên kết giữa AMB với lipid Họ đã chỉ ra rằng liên kết giữa AMB và lipid tạo ra nhiều dạng cấu trúc khác nhau: cấu trúc liposom và các cấu trúc không phải liposom được gọi là các chuỗi Họ đã nghiên cứu bào chế các chế phẩm phức hợp lipid chứa AMB có sử dụng hai lipid DMPC: DMPG (tỉ lệ mol 7:3), cho hàm lượng AMB thay đổi Tiến hành phân tích hình ảnh kính hiển vi điện tử đông khô các mẫu chứa 0, 5, 25, 50 mol % AMB cho thấy: ở nồng độ 5 mol % AMB, cấu trúc liposom kích thước nhỏ được hình thành Khi hàm lượng AMB tăng lên 25 mol%, cấu trúc liposom cơ bản

là biến mất, được thay thế bằng các cấu trúc dạng chuỗi liên kết chặt chẽ Ở nồng

độ AMB lớn hơn 50 mol%, các cấu trúc chuỗi tiếp tục xuất hiện, tuy nhiên không còn liên kết chặt chẽ [14]

Malika Larabi và cộng sự đã sử dụng phương pháp quét nhiệt vi sai (DSC) để theo dõi những thay đổi trong cấu trúc lớp lipid kép và sự tương tác của AMB với phospholipid trong công thức phức hợp lipid AMB mà có thành phần giống của Abelcet [21]

Theo quan sát của Andrew S.Janoff và cộng sự, khi một lượng lớn AMB liên kết với DMPC: DMPG (7:3) (Abelcet), peak chuyển pha chính của lipid đã bị dãn rộng ra và enthalpy của quá trình chuyển pha giảm đi [21]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: phức hợp lipid chứa AMB

- Nguyên liệu:

Bảng 2.1 Nguyên liệu

2 Hydrogenated soy

3 Distearoyl phosphatidylglycerol Lipoid – Đức NSX

- Phương tiện nghiên cứu:

 Máy khuấy từ IKA-WERKE (Đức)

 Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh)

 Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone 50

kD, diện tích lọc 28 cm2 (Spectrumlab, Mỹ)

 Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức)

 Bình cầu NS 29/32, dung tích 1000ml (Buchi – Đức)

 Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H (Hàn Quốc)

 Cân phân tích Satorius BP121S

 Máy quét nhiệt vi sai

 Máy đo pH InoLap

 Máy đo quang UV-VIS U1800 HITACHI (Nhật)

 Cân kỹ thuật Sartorius TE412 (Đức)

 Tủ sấy, tủ lạnh, tủ hút chân không, các dụng cụ thủy tinh…

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tiếp tục khảo sát quy trình và các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính của phức hợp lipid AMB

- Chứng minh mẫu bào chế là phức hợp lipid bằng một số phương pháp vật lý

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế phức hợp lipid Amphotericin B

- Theo nghiên cứu trước [5], công thức có tỉ lệ AMB bằng 25% mol trên tổng

số mol phospholipid (AMB: 50µmol, HSPC: 140µmol, DSPG: 60µmol), được bào chế bằng phương pháp thay đổi dung môi với dung môi hòa tan dược chất và phospholipid lần lượt là DMSO và CHCl3, dung môi pha nước là đệm phosphate pH 7,4 cho kết quả KTTP nhỏ, phân bố KTTP hẹp, hiệu suất nạp AMB cao và giữ được

ổn định KTTP, PDI sau 3 tuần Do đó, chúng tôi quyết định lựa chọn mẫu này để nghiên cứu tiếp

- Công thức cho mẫu 20ml:

+ AMB: 0,0462 (g)

+ HSPC: 0,1106 (g)

+ DSPG: 0,0467 (g)

Phương pháp bào chế phức hợp lipid AMB như sau:

2.3.1.1 Phương pháp thay đổi dung môi

- Cân và hòa tan AMB trong dung môi thích hợp

- Cân và hòa tan HSPC, DSPG trong 10 ml chloroform

- Phối hợp 2 dung dịch trên, khuấy trộn trên máy khuấy từ để thu được dung dịch đồng nhất (dung dịch 1)

- Tiêm 20 ml dung dịch pha nước vào dung dịch 1 kết hợp khuấy từ

- Khuấy từ 24h ở điều kiện nhiệt độ phòng để bốc hơi hết dung môi chloroform

- Phức hợp lipid AMB được đóng trong lọ thủy tinh, đậy kín, bọc giấy bạc, tránh ánh sáng và bảo quản ở 2 – 8oC

- Quy trình bào chế được trình bày trong sơ đồ:

Hình 2.1: Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn quy trình bào chế phức hợp lipid AMB bằng

phương pháp thay đổi dung môi

2.3.1.2 Phương pháp hydrat hóa film

- Cân và hòa tan AMB trong dung môi thích hợp (dung dịch 1)

HSPC, DSPG/ CHCl3

Phối hợp được pha hữu cơ

Khuấy từ bốc hơi dung môi

Đóng gói, bảo quản

Khuấy từ

24h

Nhiệt độ: 2-8oC Tránh ánh sáng AMB/ dung môi

thích hợp

- Cân và hòa tan HSPC, DSPG trong 10ml chloroform (dung dịch 2)

- Phối hợp dung dung dịch 1 và dung dịch 2 được dung dịch 3

- Cân 3g bi thủy tinh cho vào bình cầu dung tích 1000ml của hệ thống cất quay Chuyển dung dịch 3 vào bình cầu

- Tiến hành cất quay ở điều kiện nhiệt độ 41oC, tốc độ quay 150 vòng/phút Hệ thống cất quay được hút chân không, điều chỉnh áp suất để dung môi bay hơi từ từ Sau 30 phút hút chân không, dung môi bay hết và màng film được hình thành thì giảm tốc độ quay xuống 100 vòng/phút Tiếp tục cất quay đến khi đã loại hết hoàn toàn dung môi hữu cơ

- Hydrat hóa màng với pha nước (đệm phosphat 7,4 hoặc dd NaCl 0,9%) ở điều kiện nhiệt độ 50oC, tốc độc quay 250 vòng/phút đến khi sạch hết lớp màng màu vàng trên thành đáy bình cầu

- Phức hợp lipid AMB được đóng trong lọ thủy tinh, đậy kín, bọc giấy bạc, tránh ánh sáng và bảo quản ở 2 – 8oC

- Quy trình bào chế được trình bày trong sơ đồ:

Phối hợp được pha hữu cơ AMB/ dung môi

thích hợp