Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THÙY NGÂN TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA PHỨ P LIPID AMPHOTERICIN B KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1.TS. Trần Thị Hải Yến 2.DS. Dương Thị Thuấn Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI 2015
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THÙY NGÂN TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA PHỨC HỢP LIPID AMPHOTERICIN B KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THÙY NGÂN TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA PHỨC HỢP LIPID AMPHOTERICIN B KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1.TS. Trần Thị Hải Yến 2.DS. Dương Thị Thuấn Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: TS. Trần Thị Hải Yến DS. Dương Thị Thuấn Là những người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy Đào Văn Nam đã cho em nhiều lời khuyên bổ ích và nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình làm khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô, các kỹ thuật viên bộ môn Bào chế và bộ môn Vật lý - Hóa lý - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận này. Nhân đây, em cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo em suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh cổ vũ, cho em chỗ dựa tinh thần vững chắc và là nguồn động lực lớn lao cho em trong suốt quá trình 5 năm học. Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Lê Thị Thùy Ngân MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Amphotericin B. 2 1.1.1.Nguồn gốc. 2 1.1.2. Công thức hóa học. 2 1.1.3. Đặc tính lý hóa 2 1.1.4. Phổ tác dụng và cơ chế tác dụng. 3 1.1.5. Dược động học. 4 1.1.6. Chỉ định 4 1.1.7. Tác dụng không mong muốn. 5 1.1.8. Liều dùng. 5 1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của Amphotericin B trên thị trường. 6 1.2. Phức hợp lipid Amphotericin B. 7 1.2.1. Khái quát về phức hợp lipid Amphotericin B. 7 1.2.2. Cơ chế hình thành. 9 1.2.3. Thành phần phospholipid trong phức hợp. 10 1.2.4. Độ ổn định của phức hợp lipid AMB. 12 1.2.5. Ưu nhược điểm 12 1.3. Một số nghiên cứu về phức hợp lipid Amphotericin B. 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu. 16 2.2. Nội dung nghiên cứu. 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu. 17 2.3.1. Phương pháp bào chế phức hợp lipid Amphotericin B. 17 2.3.2. Phương pháp đánh giá đặc tính về hình thức, phân bố KTTP của phức hợp lipid Amphotericin B. 20 2.3.3. Phương pháp làm nhỏ kích thước tiểu phân của phức hợp lipid Amphotericin B. 20 2.3.4. Phương pháp đánh giá hiệu suất tạo phức hợp lipid Amphotericin B. 21 2.3.5. Tính ổn định về KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất bắt giữ của phức hợp lipid Amphotericin B. 22 2.3.6. Phương pháp chứng minh mẫu bào chế là phức hợp lipid. 22 2.4. Điều kiện thí nghiệm. 23 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. Khảo sát một số yếu tố công thức ảnh hưởng đến các đặc tính của phức hợp lipid. 24 3.1.1. Ảnh hưởng tỉ lệ dược chất/tổng số mol phospholipid (M/M). 24 3.1.2. Ảnh hưởng của pha nước. 26 3.1.3. Theo dõi độ ổn định về KTTP, phân bố KTTP mẫu A1 và B1. 28 3.1.4. Chứng minh mẫu A1 và B1 là phức hợp lipid bằng phương pháp quét nhiệt vi sai. 29 3.2. Bào chế phức hợp lipid Amphotericin B có tỉ lệ mol AMB bằng 100%/ tổng số mol lipid. 31 3.2.1. Ảnh hưởng của pha nước. 32 3.2.2. Phương pháp hydrat hóa màng film. 33 3.2.3. Phương pháp làm nhỏ kích thước tiểu phân. 35 3.2.4. Độ ổn định về KTTP, phân bố KTTP của mẫu N2 sau siêu âm 3’. 36 3.2.5. Chứng minh công thức N2 là phức hợp lipid bằng phương pháp quét nhiệt vi sai. 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ 1 AMB Amphotericin B 2 Dd Dung dịch 3 DĐVN Dược điển Việt Nam 4 DMPC α – Dimyristoylphosphatidylcholin 5 DMPG 1- α-Dimyristoylphosphatidylglycerol 6 DMSO Dimethyl sufoxide 7 DSPG Distearoylphosphatidylglycerol 8 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy phosphatidylcholine) 9 KTTP Kích thước tiểu phân 10 LTT Lọc tiếp tuyến 11 NSX Nhà sản xuất 12 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 13 TKHH Tinh khiết hóa học 14 USP United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) 15 Z average Kích thước tiểu phân trung bình DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 6 Bảng 2.1. Nguyên liệu 16 Bảng 3.1. Thành phần các công thức nhóm thay đổi tỉ lệ dược chất 23 Bảng 3.2. KTTP, phân bố KTTP các công thức nhóm thay đổi tỷ lệ AMB 24 Bảng 3.3. Thành phần các công thức trong nhóm thay đổi pha nước 26 Bảng 3.4. KTTP, phân bố KTTP của nhóm thay đổi pha nước 26 Bảng 3.5. KTTP, phân bố KTTP mẫu A1 sau bào chế và trong quá trình bảo quản 27 Bảng 3.6. Thành phần các công thức trong nhóm thay đổi pha nước 31 Bảng 3.7. KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất nạp mẫu M2 33 Bảng 3.8. KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất nạp mẫu N2 33 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của siêu âm 30s nghỉ 30s đến việc giảm KTTP 34 Bảng 3.10. KTTP, phân bố KTTP mẫu N2 siêu âm 3 phút sau siêu âm và sau bảo quản 1 tuần 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của AMB 3 Hình 1.2. Hình dạng cấu trúc ba chế phẩm với lipid của AMB hiện có trên thị trường 8 Hình 1.3. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB 10 Hình 1.4. Phân tử HSPC 11 Hình 1.5. Phân tử DSPG 11 Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn quy trình bào chế phức hợp lipid AMB bằng phương pháp thay đổi dung môi 18 Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn quy trình bào chế phức hợp lipid AMB bằng phương pháp hydrat hóa màng film 19 Hình 3.1. Mẫu CT3 và CT4 sau 1 tuần bào chế .24 Hình 3.2. Đồ thị KTTP, phân bố KTTP nhóm thay đổi tỉ lệ AMB 25 Hình 3.3. Đồ thị quét nhiệt vi sai mẫu A1 28 Hình 3.4. Đồ thị quét nhiệt vi sai mẫu B1 29 Hình 3.5. Đồ thị quét nhiệt vi sai hỗn hợp HSPC: DSPG (7:3) 30 Hình 3.6. Mẫu N2 sau bào chế 33 Hình 3.7. Đồ thị quét nhiệt vi sai của mẫu N2 36 Hình 3.8. Đồ thị quét nhiệt vi sai mẫu B1 37 Hình 3.9. Đồ thị quét nhiệt vi sai hỗn hợp HSPC: DSPG (7:3) 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm nấm xâm lấn là nguyên nhân quan trọng gây bệnh tật và tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch (ghép, hóa trị liệu, AIDS). Amphotericin B (AMB) là một trong các kháng sinh polyen macrolide hiệu quả nhất cho việc điều trị nhiễm nấm hệ thống và nội tạng trong cơ thể người. Tuy nhiên, do sinh khả dụng đường uống thấp nên thuốc thường được sử dụng dưới dạng tiêm. Do dạng chế phẩm Amphotericin B quy ước (chế phẩm Fungfizone) không bền trong hệ tuần hoàn và nhanh chóng chuyển từ dạng micelle sang dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật chủ, đặc biệt là độc tính trên thận, mà trong suốt những thập kỉ gần đây các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu nhằm phát triển dạng mang thuốc mới có thể cải thiện các nhược điểm kể trên. Từ đó đã cho ra đời các dạng thuốc có tính ứng dụng cao như vi nang, vi cầu, liposome, phức hợp lipid… Trong đó phức hợp lipid là kết quả sự phá vỡ của cấu trúc liposome và tiếp đến là sự tái sắp xếp lại của các phân tử lipid và dược chất khi được sử dụng ở hàm lượng cao hơn là hệ mang thuốc có nhiều triển vọng trong giảm độc tính và tăng khả năng mang dược chất. Trong đề tài nghiên cứu của Dược sĩ Nguyễn Thị Mỹ đã bào chế được phức hợp lipid chứa AMB có tỷ lệ SPC: DSPG là 7:3 với tổng số mol lipid là 200 µmol; môi trường phân tán đệm pH 7,4; và 25 mol % AMB/tổng lượng lipid cho hiệu suất nạp dược chất cao (87,06 %), KTTP là 648,3 nm; phân bố KTTP tương đối đồng đều (PDI = 0,363). Tuy nhiên nghiên cứu chưa đưa ra phương pháp chứng minh mẫu sau bào chế là phức hợp lipid. Do đó, để góp phần ứng dụng phức hợp lipid làm chất mang thuốc và giảm độc tính của thuốc, chúng tôi nghiên cứu đề tài “ Tiếp tục nghiên cứu bào chế và đánh giá đặc tính của phức hợp lipid Amphotericin B” nhằm mục tiêu: + Xây dựng được công thức và phương pháp bào chế phức hợp lipid Amphotericin B. + Đánh giá được một số đặc tính: kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân và hiệu suất tạo phức hợp lipid của hệ phức hợp lipid Amphotericin B. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Amphotericin B. 1.1.1. Nguồn gốc. Amphotericin B là một hỗn hợp các polyen chống nấm được sản xuất bằng cách nuôi cấy một số giống Streptomyces nodosus hoặc bằng các phương pháp khác, chứa chủ yếu là amphotericin B [2]. Đặc tính kháng khuẩn được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1950 và được đưa vào thị trường vào năm 1958 [10]. 1.1.2. Công thức hóa học. - Công thức hóa học: acid ( 1R, 3S, 5R, 6R, 9R, 11R, 15S, 16R, 17R, 18S, 19E, 21E, 23E, 25E, 27E, 31E, 33R, 35S, 36R, 37S) -33-[(3-amino-3,6-dideoxy-β- D-mannopyranosyl)oxy]-1, 3, 5, 6, 9, 11, 17, 37-octa-hydroxy-15, 16, 18 trimethyl- 13 –oxo-14, 39-dioxa-bicyclo-[33.3.1] nonatriaconta-19, 21, 23, 25, 27, 29, 31- heptaen-36 carboxylic [2]. - Công thức phân tử: C 47 H 73 NO 17. - Khối lượng phân tử: 924,08. - pK a1 = 5,5; pK a2 = 10 [1]. 1.1.3. Đặc tính lý hóa Lý tính: - Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng da cam. [...]... thủy tinh… 2.2 Nội dung nghiên < /b> cứu < /b> - Tiếp < /b> tục < /b> khảo sát quy trình và < /b> các yếu tố ảnh hưởng đến đặc < /b> tính < /b> của < /b> phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> AMB - Chứng minh mẫu b o < /b> chế < /b> là phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> b ng một số phương pháp vật lý 2.3 Phương pháp nghiên < /b> cứu < /b> 2.3.1 Phương pháp b o < /b> chế < /b> phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> Amphotericin < /b> B - Theo nghiên < /b> cứu < /b> trước [5], công thức có tỉ lệ AMB b ng 25% mol trên tổng số mol phospholipid (AMB: 50µmol, HSPC: 140µmol,... nấm của < /b> AMB Điều này được giải thích là do sự giải phóng chọn lọc và < /b> từ từ AMB ra khỏi phức < /b> hợp < /b> [17, 21] Phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> AMB cho phép cải thiện khả năng dung nạp AMB, có thể giải thích do đặc < /b> điểm dược động học của < /b> phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> này: phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> AMB nhanh chóng thanh thải khỏi máu và < /b> có thể tích phân b lớn Sau khi tiêm, phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> AMB nhanh chóng b thực b o < /b> và < /b> tập trung tại các mô, đặc < /b> biệt... Một số nghiên < /b> cứu < /b> về phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> Amphotericin < /b> B Các nghiên < /b> cứu < /b> đã chỉ ra rằng phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> AMB có thể được b o < /b> chế < /b> b ng các phương pháp tương tự như các phương pháp b o < /b> chế < /b> liposom đã được nghiên < /b> cứu < /b> [14] Malika Larabi và < /b> các cộng sự đã tiến hành b o < /b> chế < /b> hệ hỗn dịch của < /b> AMB b ng phương pháp thay đổi dung môi Trong nghiên < /b> cứu,< /b> AMB (3,5 mg hòa tan trong 10 ml methanol) được phối hợp < /b> với một dung môi... công của < /b> một số chế < /b> phẩm dựa trên lipid < /b> của < /b> AMB như Ambisome, Abelcet [14] Giảm độc tính < /b> của < /b> thuốc: trong phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> của < /b> AMB, phân tử AMB sẽ liên kết chặt chẽ với các phân tử lipid < /b> trong phức < /b> hợp,< /b> do đó không còn AMB tương tác với cholesterol trên màng tế b o < /b> – tương tác gây nên độc tính < /b> của < /b> AMB trên người, đặc < /b> biệt trên thận Dù có sự liên kết chặt chẽ với lipid < /b> trong phức < /b> hợp < /b> xong phức < /b> hợp < /b> với lipid.< /b> .. phospholipid dùng b o < /b> chế < /b> liposom cũng như b o < /b> chế < /b> phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> được b n sẵn trên thị trường Tuy nhiên sản phẩm của < /b> các nhà sản xuất khác nhau có mức độ tinh khiết khác nhau Tùy theo mục đích của < /b> nghiên < /b> cứu < /b> và < /b> sử dụng có thể lựa chọn loại phospholipid thích hợp < /b> [6] 1.2.4 Độ ổn định của < /b> phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> AMB Với thành phần cấu tạo chính là phospholipid, phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> AMB được coi là dạng b o < /b> chế < /b> kém... phân tử lipid < /b> được xen kẽ vào giữa các phân tử AMB để hình thành cấu trúc phức < /b> hợp < /b> Một mô hình được đưa ra để mô tả tương tác giữa AMB và < /b> lipid < /b> trong phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> chứa AMB như sau: 10 Hình 1.3 Cấu trúc giả định của < /b> phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> AMB [21] Sự sắp xếp giữa lipid < /b> và < /b> AMB này phù hợp < /b> với nhiều nghiên < /b> cứu < /b> đã quan sát được Trong phức < /b> hợp,< /b> đuôi hydrocacrbon thân dầu của < /b> lipid < /b> gắn với chuỗi polyen của < /b> AMB, gốc... ALTT - Hiệu suất b t giữ AMB trong phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> AMB được xác định b ng công thức: HLTT % = 𝐴𝐿𝑇𝑇 𝐴1 × 100% Trong đó: - 𝐴𝐿𝑇𝑇: độ hấp thụ quang của < /b> mẫu thử sau lọc tiếp < /b> tuyến - 𝐴1: độ hấp thụ quang của < /b> mẫu thử 2.3.5 Tính < /b> ổn định về KTTP, phân b KTTP, hiệu suất b t giữ của < /b> phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> Amphotericin < /b> B Đánh giá < /b> KTTP, phân b KTTP, hiệu suất b t giữ dược chất trong phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> sau khi b o quản ở 2 –... cục b phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> Mẫu thu được đánh < /b> giá < /b> các đặc < /b> tính < /b> KTTP, phân b KTTP để chọn ra thời gian siêu âm phù hợp < /b> nhất 21 2.3.4 Phương pháp đánh < /b> giá < /b> hiệu suất tạo phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> Amphotericin < /b> B 2.3.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng Amphotericin < /b> B trong hỗn dịch lipid < /b> Amphotericin < /b> B - Phương pháp: quang phổ hấp thụ UV- VIS đã được xây dựng và < /b> thẩm định ở khóa luận trước [5] Đồng thời, theo nghiên < /b> cứu.< /b> .. ngày Phức < /b> hợp < /b> b ng 50 3 Dạng cấu Phức < /b> hợp < /b> mg, AMB với 100 cholesteryl mg sulfat Phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> dạng đĩa 0,12 Hỗn 5 mg/kg/ dịch ngày B t 1-10 3 -4 đông mg/kg/ khô ngày 7 (tỷ lệ mol 1:1) HSPC:DSPG: 4 Ambisome Chol:AMB 50 mg (tỷ lệ mol B t Liposome 2:0,8:1:0,4) 0,08 3–5 đông mg/kg/ khô ngày 1.2 Phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> Amphotericin < /b> B 1.2.1 Khái quát về phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> Amphotericin < /b> B Ngày nay, có nhiều nghiên < /b> cứu.< /b> .. hỗn dịch phức < /b> hợp < /b> lipid < /b> chứa AMB, lấy 1 lượng nhỏ mẫu đem pha loãng 100 lần b ng nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2µm và < /b> đo KTTP theo phương pháp đã trình b y ở mục 2.3.2 - KTTP, phân b KTTP mẫu A1 sau b o < /b> chế < /b> và < /b> b o quản được trình b y trong b ng 3.5 B ng 3.5 KTTP, phân b KTTP mẫu A1 sau b o < /b> chế < /b> và < /b> trong quá trình b o quản Công thức Đặc tính < /b> Zaverage A1 (d.nm) PDI Zaverage B1 (d.nm) . b o chế là phức hợp lipid. Do đó, để góp phần ứng dụng phức hợp lipid làm chất mang thuốc và giảm độc tính của thuốc, chúng tôi nghiên cứu đề tài “ Tiếp tục nghiên cứu b o chế và đánh giá đặc. 1.2. Phức hợp lipid Amphotericin B. 1.2.1. Khái quát về phức hợp lipid Amphotericin B. Ngày nay, có nhiều nghiên cứu tạo phức AMB trong các dạng b o chế kết hợp với lipid (lipid- based formulations). đánh giá đặc tính của phức hợp lipid Amphotericin B nhằm mục tiêu: + Xây dựng được công thức và phương pháp b o chế phức hợp lipid Amphotericin B. + Đánh giá được một số đặc tính: kích thước