2.3.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng Amphotericin B trong hỗn dịch lipid Amphotericin B.
- Phương pháp: quang phổ hấp thụ UV- VIS đã được xây dựng và thẩm định ở khóa luận trước [5]. Đồng thời, theo nghiên cứu trước, tá dược phospholipid không ảnh hưởng tới độ hấp thụ quang của AMB. [5]
- Điều kiện tiến hành đo quang: Bước sóng đo quang: 405 nm
Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,0100 g AMB hòa tan bằng methanol trong bình định mức 50 ml, bổ sung thể tích bằng methanol đến vạch. Tiến hành pha loãng dung dịch trên với methanol tới hệ số pha loãng cuối cùng k1
= 2500.
Mẫu thử: hút chính xác 0,50 ml hỗn dịch phức hợp lipid AMB, hòa tan bằng methanol trong bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích bằng methanol đến vạch. Tiến hành pha loãng với methanol tới hệ số pha loãng cuối cùng bằng hệ số pha loãng của mẫu thử k2 = 2500.
- Hàm lượng AMB trong hỗn dịch phức hợp lipid AMB được xác định theo công thức:
Ct = 𝐴𝑡
𝐴𝑜× 𝐶𝑐
Trong đó:
- Ct: nồng độ AMB trong phức hợp lipid (mg/ml) - Ao: độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn.
- At: độ hấp thụ quang của mẫu thử.
- Cc: nồng độ AMB trong mẫu chuẩn (mg/ml).
2.3.4.2. Phương pháp xác định hiệu suất tạo phức hợp lipid Amphotericin B.
Định lượng AMB toàn phần: nồng độ AMB trong hỗn dịch phức hợp lipid AMB thô.
- Hút chính xác 0,5 ml hỗn dịch phức hợp lipid AMB thô, pha loãng mẫu như mô tả ở mục 2.3.3.1. Tiến hành đo quang, thu được độ hấp thụ quang A1.
- Định lượng AMB có trong phức hợp lipid AMB: để đánh giá được lượng AMB có trong hệ thống phức hợp lipid AMB cần phải loại bỏ phần AMB tự do bằng phương pháp lọc tiếp tuyến: AMB tự do được tiến hành loại bỏ qua hệ thống lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfon, kích thước lỗ 50kD, diện tích lọc 28cm2 (Spectrumlab, Mỹ).
- Hút chính xác 0,50 ml hỗn dịch sau khi lọc tiếp tuyến hòa tan, pha loãng bằng methanol và tiến hành đo quang như mô tả ở mục 2.3.4.1. Thu được độ hấp thụ quang ALTT.
- Hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp lipid AMB được xác định bằng công thức:
HLTT % = 𝐴𝐿𝑇𝑇
𝐴1 × 100%
Trong đó:
- 𝐴𝐿𝑇𝑇: độ hấp thụ quang của mẫu thử sau lọc tiếp tuyến.
- 𝐴1: độ hấp thụ quang của mẫu thử.