NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CỐM “TIỀN LIỆT HC” TRONG ĐIỀU TRỊ PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT TRÊN THỰC NGHIỆM VÀ LÂM SÀNG

SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -& - Chuyên đề 06: Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm Phục vụ đề tài: “NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CỐM “TIỀN LIỆT HC” TRONG ĐIỀU TRỊ PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT TRÊN THỰC NGHIỆM VÀ LÂM SÀNG” Mã số: 01C-80/08-2013-2 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Thu Hà PGS.TS Nguyễn Nhược Kim Nhóm nghiên cứu chuyên đề: PGS TS Hoàng Minh Chung PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển Hà Nội, 2013 MỞ ĐẦU Để có qui trình bào chế ổn định, sản phẩm làm đạt tiêu chuẩn khơng ngun liệu ban đầu phải đảm bảo chất lượng mà sản phẩm trung gian phải tiêu chuẩn hoá Nếu giúp cho việc kiểm tra, kiểm sốt chất lượng suốt q trình sản xuất Hiện việc tiêu chuẩn hố thuốc cổ truyền gặp nhiều khó khăn vì: dược liệu có nhiều tên gọi khác tuỳ theo địa phương thu hái nhân dân không phân biệt loài, thứ khác nhau, thuốc chi Thời vụ thu hái chưa ý chặt chẽ nên hàm lượng chất dược liệu nhiều khác qua lần thu hái [2] Đối với thuốc phải qua chế biến, chưa có qui trình chế biến chuẩn, q trình chế biến nhiều vị thuốc với phương pháp có nét khác nhau; thành phần hố học dược liệu phức tạp; sau chế biến, có thay đổi định tính định lượng nên việc chiết, tách, phân lập chất để làm chất chuẩn tốn Điều làm cho tiêu chuẩn hoá thuốc sau chế biến bị nhiều hạn chế Việc tiêu chuẩn hoá sản phẩm trung gian cần thiết góp phần cho sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng Tiêu chuẩn hoá sản phẩm trung gian thường đề nghị dây chuyền sản xuất đạt GMP chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu Bởi vì, đưa lượng dược liệu lớn vào dây chuyền sản xuất đạt GMP gặp khó khăn nhiều đưa vào sản phẩm trung gian có lượng Tuy nhiên, xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm trung gian dễ Vì vậy, để tiêu chuẩn hố vị thuốc có nguồn gốc từ dược liệu, WHO Bộ y tế có hướng dẫn nên cần tìm chất đặc trưng hay dấu vân tay (finger print) để làm tiêu chí kiểm định dược liệu, nên tìm đặc điểm khác thuốc sống thuốc chế để xây dựng phương pháp kiểm định phù hợp, khả thi, dễ áp dụng cho tuyến sở Đối với thuốc mà dược liệu có chất chuẩn để đối chiếu khuyến khích Tuy nhiên việc sử dụng chất chuẩn làm đối chiếu dược liệu cần phải có điều kiện khắt khe thuốc có nhiều vị thuốc gần nhưu chưa thực sỏ sản xuất với nhiều yếu tố khách quan chủ quan Vì việc sử dụng tiêu chí cho có kỹ thuật đơn giản, dễ thực tuyến sở phổ biến Chúng tiến hành nghiên cứu số tiêu cần thiết cho cao thu từ dịch chiết toàn phần thuốc, từ đề xuất tiêu chuẩn cho sản phẩm trung gian của thuốc Tiền liệt HC áp dụng vào thực tế Mục tiêu chuyên đề: Nghiên cứu số tiêu cao « Tiền liệt HC » Đề xuất TCCS cho cao bán thành phẩm « Tiền liệt HC » I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CAO THUỐC (Extracta) 1.1.1 Định nghĩa Cao thuốc chế phẩm chế cách cô sấy đến thể chất quy định dịch chiết thu từ dược liệu thực vật hay động vật với dung mơi thích hợp Các dược liệu trước chiết xuất xử lý sơ (sấy khơ chia nhỏ đến kích thước thích hợp) Đối với số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy hoạt chất cần phải diệt men trước đưa vào sử dụng cách dùng cồn sôi, nước sôi phương pháp thích hợp khác Cao thuốc chia làm loại: Cao lỏng: Là chất lỏng sánh, có mùi vị đặc trưng dược liệu sử dụng cồn nước đóng vai trò dung mơi (hay chất bảo quản hay hai) Nếu khơng có dẫn khác, quy ước ml cao lỏng tương ứng với g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung mơi sử dụng lại cao khơng q 20% Cao khô: Là khối bột khô, đồng dễ hút ẩm Cao khơ khơng có độ ẩm lớn 5% 1.1.2 Phương pháp điều chế Quá trình điều chế cao thường có giai đoạn: Giai đoạn I Chiết xuất dược liệu dung môi thích hợp Tùy theo chất dược liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng thành phẩm điều kiện, quy mô sản xuất trang thiết bị, sử dụng phương pháp chiết xuất: ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm kiệt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất thiết bị siêu âm, chiết xuất phương pháp sử dụng điện trường phương pháp khác Phương pháp ngâm nhỏ giọt thường sử dụng Khi đó, dược liệu thơ chia nhỏ đến kích thước phù hợp, làm ẩm với lượng dung mơi vừa đủ đậy kín để n khoảng - Sau đó, chuyển khối dược liệu vào bình ngấm kiệt, thêm lượng dung mơi vừa đủ đến ngập hoàn toàn khối dược liệu Thời gian ngâm lạnh tốc độ chảy trình chiết thay đổi theo khối lượng chất dược liệu thô đem chiết Giai đoạn II Cao lỏng: Sau thu dịch chiết, tiến hành lọc cô dịch chiết phương pháp khác để thu cao lỏng có tỷ lệ theo quy ước (1 ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu) Trong trường hợp điều chế cao lỏng phương pháp ngâm nhỏ giọt, tốc độ chảy cuả dịch chiết chậm, vừa hay nhanh Nếu chiết xuất 1000 g dược liệu thì: Ở tốc độ chậm: Không ml dịch chiết/ phút, Ở tốc độ vừa: - ml dịch chiết/ phút Ở tốc độ nhanh: - 5ml dịch chiết/ phút Để riêng phần dịch chiết đầu đậm đặc 4/5 lượng dược liệu đem chiết Sau phần dịch chiết bếp cách thuỷ cô áp suất giảm nhiệt độ không 60 ºC loại hết dung mơi Hồ tan cắn thu vào dịch chiết đầu đậm đặc cần, thêm dung môi vào để thu cao lỏng đạt tỷ lệ quy định Cao lỏng có khuynh hướng bị lắng cặn để cao lỏng chỗ mát thời gian ngày, lọc Cao đặc cao khô: Dịch chiết cô đặc đến độ ẩm lại khơng q 20% Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy khơ để độ ẩm lại khơng q 5% Để đạt đến thể chất quy định, q trình đặc sấy khô dịch chiết thường tiến hành thiết bị cô áp suất giảm nhiệt độ khơng q 60oC Nếu khơng có thiết bị đặc sấy áp suất giảm phép cô cách thủy (không cô trực tiếp lửa) sấy nhiệt độ không 80oC Trường hợp muốn thu cao thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp chất phương pháp thích hợp tuỳ thuộc vào chất cuả dược liệu, dung môi phương pháp chiết xuất Có thể cho thêm chất bảo quản chất trơ để làm chất mang hay để cải thiện tính chất vật lý Đối với cao khơ sử dụng bột trơ thích hợp hay cao khơ dược liệu sử dụng để điều chỉnh nồng độ hoạt chất đến tỷ lệ quy định 1.1.3 Yêu cầu chất lượng cao Mỗi loại cao cần phải đạt yêu cầu theo quy định chuyên luận riêng với tất loại cao cần đạt yêu cầu chung sau đây: Độ tan: Cao lỏng phải tan hồn tồn dung mơi sử dụng để điều chế cao Độ trong, mùi vị, độ đồng màu sắc: Cao thuốc phải màu sắc mơ tả chun ln riêng, có mùi vị đặc trưng dược liệu sử dụng Ngoài ra, cao lỏng phải đồng nhất, khơng có váng thuốc, khơng có cặn bã dược liệu vật lạ Cách tiến hành: Lấy riêng phần phía chai thuốc để lại khoảng 10 - 15 ml Chuyển phần lại chai vào bát sứ men trắng, nghiêng bát cho chúng chảy thành bát tạo thành lớp dễ quan sát Quan sát ánh sáng tự nhiên, thuốc phải đạt yêu cầu quy định Nếu không đạt phải thử lại lần hai với chai khác, không đạt coi lô thuốc không đạt tiêu Mất khối lượng làm khô (nếu khơng có dẫn khác): Cao đặc khơng q 20% Cao khô không 5% Hàm lượng cồn: Đạt 90 - 110% lượng ethanol ghi nhãn (áp dụng cho cao lỏng cao đặc) Kim loại nặng: Đáp ứng yêu cầu qui định chuyên luận riêng Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi cồn, nuớc hay hỗn hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định Phụ lục 10.14 Xác định dung môi tồn dư Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu qui định Phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn 1.1.4 Bảo quản Cao thuốc đựng bao bì kín, để nơi khơ, mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ thay đổi Nhãn: Ghi tên phận dùng thuốc, tên dung môi (nếu dung môi cồn, nước hay hỗn hợp cồn - nuớc), hàm lượng (%) hoạt chất hợp chất nhận dạng quy định theo chuyên luận riêng, tên nồng độ chất bảo quản thêm vào Khi hoạt chất chưa biết, tỷ lệ dược liệu sản phẩm cuối phải nêu rõ Đối với cao đặc cao khô, loại số lượng tá dược thêm vào nêu Trong trường hợp này, % cao tự nhiên phải ghi rõ 1.2 Một số quy định xây dựng tiêu chuẩn 1.2.1 Các chất đối chiếu (ĐC) Chất đối chiếu chất đồng xác định để dùng phép thử quy định hoá học, vật lý sinh học Trong phép thử tính chất chất đối chiếu so sánh với tính chất chất cần thử Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng Chất đối chiếu dùng phép thử sau: Định tính phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại Định lượng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến, quang phổ huỳnh quang Các phép thử định tính tạp chất định lượng phương pháp sắc ký Định lượng phương pháp vi sinh vật Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích trọng lượng Các phép thử sinh học Một số phép thử khác có hướng dẫn chuyên luận riêng Cách sử dụng chất đối chiếu Để đáp ứng mục đích sử dụng, chất đối chiếu phải bảo quản, theo dõi sử dụng Theo qui định thông thường, chất đối chiếu phải đựng bao bì gốc, kín, có nhãn rõ ràng, thường xuyên bảo quản nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng ẩm; cần có điều kiện bảo quản đặc biệt khác có hướng dẫn nhãn Trước mở bao gói để dùng, chất đối chiếu cần để thời gian để đạt tới nhiệt độ phòng thí nghiệm Các phép thử tiến hành đồng thời mẫu thử mẫu đối chiếu chuẩn bị điều kiện ghi chuyên luận Nếu nhãn chất đối chiếu khơng có dẫn phải làm khô phép thử riêng chun luận khơng định phải làm khơ sử dụng chất đối chiếu mà làm khô Trong trường hợp cần hiệu chỉnh lại lượng cân chất đối chiếu khối lượng bị giảm làm khô hàm lượng nước Mất khối lượng làm khô hàm lượng nước xác định theo hướng dẫn chuyên luận chất thuốc tương ứng Khi chất đối chiếu có nước kết tinh, có hướng dẫn đặc biệt phép thử riêng Nếu thực việc xác định hàm lượng nước chất đối chiếu phương pháp chuẩn độ (phương pháp Karl Fischer) chun luận thuốc tương ứng khơng có phép thử khối lượng làm khơ, nên làm khơ chất đối chiếu chất hút ẩm thích hợp để chuyển lượng cân chất đối chiếu thành chất khan, trừ có hướng dẫn khác Khi đọc thấy chữ “chuẩn” xuất sau tên chất ghi phép thử hay phép định lượng, có nghĩa phải sử dụng chất đối chiếu 1.2.2 Quy định tạp chất dung môi tồn dư (CPMP/ICH/283/95) Mục tiêu Quy định đề lượng dung môi cho phép tồn dư dược phẩm, nhằm bảo đảm an toàn người bệnh Quy định khuyến cáo dùng dung mơi độc đề giới hạn độc tính chấp nhận số dung môi Dung môi tồn dư dược phẩm chất hữu bay hơi, sử dụng sinh trình sản xuất dược chất, tá dược trình bào chế dược phẩm Các dung môi không loại bỏ hồn tồn q trình sản xuất Sự chọn lọc dung mơi thích hợp nâng cao sản lượng định đặc tính dạng tinh thể, độ tinh khiết, tính hồ tan sản phẩm Vì vậy, đơi dung mơi yếu tố định quy trình tổng hợp Quy định khơng đề cập đến dung mơi dùng có cân nhắc kỹ lưỡng chất phụ gia, đến solvat Tuy nhiên hàm lượng dung môi sản phẩm loại phải xác định chứng minh hợp lý Vì dung mơi tồn dư khơng có tác dụng điều trị, dung mơi phải loại bỏ đến mức tối đa để đạt yêu cầu kỹ thuật sản phẩm, việc thực hành tốt sản xuất (GMP) yêu cầu chất lượng khác Dược phẩm phải chứa mức dung môi tồn dư không cao liệu an tồn Phải tránh dùng số dung mơi có độc tính khơng thể chấp nhận (dung mơi nhóm 1, Bảng 10.14.1-1), trừ lợi ích việc sử dụng chúng xác định chắn Một số dung mơi có độc tính nguy hiểm (dung mơi nhóm 2, Bảng 10.14.1-2) cần phải dùng hạn chế, để bảo vệ người bệnh khỏi tác dụng độc hại Tốt phải dùng dung mơi độc (dung mơi nhóm 3, Bảng 10.14.1-3) a Phạm vi áp dụng Các dung môi tồn dư dược chất, tá dược dược phẩm thuộc phạm vi áp dụng quy định Vì phải thực phép thử tìm dung mơi 10 tồn dư q trình sản xuất hay tinh chế để kiểm soát diện chúng Chỉ cần kiểm tra dung môi sử dụng hay sản sinh trình sản xuất tinh chế dược chất, tá dược dược phẩm Mặc dù nhà sản xuất chọn phương pháp xác định hàm lượng dung môi tồn dư sản phẩm, ta tính hàm lượng đó, từ hàm lượng dung môi tồn dư thành phần dùng để sản xuất sản phẩm Nếu kết tính tốn thấp giới hạn cho phép khuyến cáo quy định này, khơng cần tiến hành thí nghiệm sản phẩm Trái lại, kết tính vượt mức giới hạn cho phép, dược phẩm phải thử nghiệm để biết chắn lượng tồn dư dung mơi có nằm phạm vi cho phép không Sản phẩm phải thử nghiệm có dùng dung mơi q trình sản xuất Quy trình khơng áp dụng cho dược chất, tá dược sản phẩm trình nghiên cứu áp dụng lâm sàng không áp dụng cho dược phẩm lưu hành thị trường Quy định áp dụng cho dạng bào chế cách dùng thuốc Trong vài trường hợp, cho phép giới hạn dung môi tồn dư cao dùng thời gian ngắn (30 ngày hay hơn), dùng dạng thuốc đắp Việc chứng minh đắn giới hạn cao phải dựa sở trường hợp b Các nguyên tắc Phân loại dung môi tồn dư theo mức độ nguy hiểm Thuật ngữ “liều dung nạp cho ngày” (tolerable daily intake, TDI) Chương trình quốc tế an tồn hố chất (IPS) sử dụng thuật ngữ “liều dùng ngày” (acceptable daily intake ADI) Tổ chức y tế giới, Viện quan quản lý sức khoẻ quốc gia quốc tế khác sử dụng để giới hạn hàm lượng hố chất độc dùng ngày 16 III KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 3.1 Nghiên cứu tính chất cao Cơng thức pha chế cao Vị thuốc Đào nhân Hoài sơn Lệ chi hạch Số lượng (kg) 5,0 6,0 6,0 Ngưu tất 6,0 Quế chi Sơn thù Tạo giác thích 3,0 5,0 6,0 Thỏ ty tử 6,0 Trạch tả Vương bất lưu hành 5,0 6,0 Xa tiền tử 6,0 Ý dĩ Ethanol 96 % 10,0 70,0lit Dược liệu chế biến, chiết, loại tạp áp suất giảm theo quy trình cao đưa vào nghiên cứu * Tính chất: Cao có màu nâu, mùi thơm dược liệu, vị đắng * Độ tan: Cao tan hoàn toàn nước hòa tan 10 g cao vào 20 ml nước ấm Khi hòa tan dịch đồng nhất, khơng có váng thuốc, khơng có cặn bã dược liệu vật lạ * Mất khối lượng làm khô: Lấy 1g cao, sấy khô nhiệt độ 105 0C khoảng giờ, cân Sau sấy thêm tủ sấy cân lại Làm lần liên tiếp So sánh khối lượng cân lần sau với lần sấy trước khơng q 0,5 mg Kết cao có hàm ẩm 25, % 3.2 Nghiên cứu số tiêu định tính 17 Các cao đưa vào nghiên cứu bao gồm: Cao trước loại tạp chiết phương pháp thủ công (cao 1); Cao sau loại tạp chiết phương pháp thủ công (cao 2) cao sau loại tạp chiết, cô áp suất giảm (cao 3) 3.2.1 Nghiên cứu thành phần Flavonoid cao Mẫu thử: Cân xác khoảng 0,3 g cao loại, thêm 10ml nước cất nóng; để nguội Lắc dịch chiết nước với ether dầu hỏa (3x15ml) để loại số tạp chất Loại bỏ lớp Ether Lắc tiếp với EtOAc (3x15ml) Lọc lấy dịch chiết EtOAc, cô cách thuỷ đến 1ml dung dịch chấm sắc ký Tiến hành: Chấm riêng biệt 20 µl dung dịch cao lên mỏng từ trái qua phải cao 1, cao cao Triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phòng Triển khai hệ dung môi sau: CHCl3 : MeOH tỷ lệ (9 : 1) Toluen: ethyl acetat : aceton : acid formic (5:2 :2 :1) Toluen – Ethyl acetat – Acid formic (5 : : 1) Hiện màu bằng: a) Hơi Amoniac b) Hơi Amoniac soi đèn UV bước sóng 254 nm c) Hơi Amoniac soi đèn UV bước sóng 366 nm 18 Kết cho thấy hệ dung môi tách vết tốt hình 3.1 a b c Hình 3.1 Sắc ký đồ flavonoid loại cao “Tiền liệt HC” Kết bước đầu cho thấy: cao trước sau loại tạp không khác số vết Sắc ký đồ cao đậm cao lại (ình a) màu thuốc thử tách nhiều vết (hình c) màu đền UV bước sóng 366 nm 3.2.2 Định tính có mặt số dược liệu cao Ngưu tất Vết chấm từ trái qua phải: Ngưu tất, cao 1, cao 2, cao DMKT: Ether dầu hỏa – n-hexan – ethylacetat – acid acetic: (10:20:7:0,4) 19 Thuốc thử: Dung dịch vanilin - acid sulfuric (TT): Trộn đồng lượng dung dịch vanilin 1% ethanol 96% dung dịch acid sulfuric 5% ethanol 96% Pha trước dùng Tiến hành: Dung dịch đối chiếu: 2g Ngưu tất cắt nhỏ +30ml Ethanol 96%, cách thủy 60 phút (bổ sung dung môi để đủ khoảng 30 ml), lọc, cô dịch đến 5ml, thêm 5ml HCl 10%, hồi lưu cách thủy 60 phút, cô dịch 5ml thêm 5ml nước, chiết cloroform (2 lần x 10ml), gộp dịch, rửa nước lần x 10ml, cách thủy đến cắn, hòa cắn với ml methanol dung dịch chấm sắc ký Dung dịch thử: Lấy khoảng 2g cao loại, thêm ml nước cho tan hoàn toàn, thêm ml acid hydrocloric 10%, hồi lưu cách thủy 60 phút, dịch 5ml thêm 5ml nước, chiết cloroform (2 lần x 10ml), gộp dịch, rửa nước lần x 10ml, cô cách thủy đến cắn, hòa cắn với ml methanol dung dịch chấm sắc ký Tiến hành: Chấm riêng biệt 20 µl dung dịch thử đối chiếu lên mỏng Triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phòng Phát hiện: Soi đền tử ngoại phun thuốc thử màu, sấy 100 105 oC đến rõ vết Kết quả: Thuốc thử màu ánh sáng thường, có vết, vết rõ, vết nhạt (a) Ở bước sóng 254, có vết tương đương dược liệu cao (b) Ở bước sóng 366,1 vết tương đương rõ, lại vết dược liệu nhạt (c) 20 a b c Hình 3.2 Sắc ký đồ ngưu tất cao Hoài sơn Vết chấm từ trái qua phải: Hoài sơn, cao 1, cao 2, cao Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (9: 1) Dung dịch đối chiếu : Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm ml hỗn hợp cloroform - methanol (4 : 1), đun sôi ống sinh hàn hồi lưu khoảng 10 phút Lọc, khoảng ml dung dịch chấm sắc ký Dung dịch thử: Lấy khoảng g cao loại, tiến hành chiết dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm lên mỏng 15 - 20 µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, phun dung dịch vanilin 1% hỗn hợp acid phosphoric - methanol (1 : 1) Sấy mỏng 120 oC 15 phút Kết quả: Sau phun 366, cao có vết tương đương vết dược liệu nhạt so với dược liệu Cao có vết đậm cao dược liệu Hình 3.3 Sắc ký đồ Hồi sơn cao 21 3.3 Định lượng chất chiết n-BuOH Cân xác khoảng 2g cao, hòa 10ml nước cất ấm, lắc dịch chiết nước với ether dầu hỏa, EtOAc để loại số tạp chất (tinh dầu, dầu béo, chất sterol, flavonoid…) Sau lắc tiếp với n-Butanol bão hòa nước đến lớp n-Butanol không cho tượng tạo bọt Cất thu hồi n-Butanol Cắn thu hòa tan thể tích nhỏ methanol Nhỏ từ từ dung dịch vào thể tích aceton gấp 10 – 15 lần, xuất tủa Để lắng, lọc, rửa tủa Sấy tủa đến khối lượng khơng đổi Cân tủa tính hàm lượng cắn toàn phần chế phẩm theo theo công thức : C (%) = m x100 M Trong : C : Hàm lượng % cắn tồn phần m : Khối lượng cắn phân đoạn n-BuOH (g) M : Khối lượng cao đem định lượng (g) Kết quả: Hàm lượng cắn trung bình cao 22 Cao 1: 3,25 % Cao 2: 3,18 % Cao 3: 3,75 % 3.4 Giới hạn nhiễm khuẩn Thử theo Phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn cao Salmonella, Escherichia coli, Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Giới hạn nhiễm khuẩn: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được: Không 2.103 CFU/ g - Tổng số nấm mốc, nấm men sống lại được: Không 30 CFU/ g - Tổng số Enterobacteria: Không 50 CFU/ g 3.5 Đề xuất tiêu chuẩn cho cao TIÊU CHUẨN CƠ SỞ 23 CÔNG TY CP DƯỢC PHẨM KHANG MINH Cao TIỀN LIỆT HC Hỗn hợp cao Tiền liệt HC chiết xuất từ dược liệu: Đào nhân, Hoài sơn, lệ chi hạch, Ngưu tất, Quế chi, Sơn thù, Tạo giác thích, thỏ ty tử, Trạch tả, Vương bất lưu hành, xa tiền tử Ý dĩ với số lượng theo công thức pha chế cô đặc YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Tính chất: Cao màu nâu, mùi thơm dược liệu 1.2 Hàm ẩm: Không lớn 25 % 1.3 Độ hòa tan: Tan hồn tồn nước 1.4 Độ trong: Khi hòa tan g cao vào ml nước phải không lắng cặn, có bã dược liệu 1.5 Định tính: Thể phép thử định tính Hồi sơn, Ngưu tất, Hoài sơn 1.6 Định lượng: Hàm lượng chất chiết n – BuOH không nhỏ 1.7 Giới hạn nhiễm khuẩn - Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được: Không 2.103 CFU/ g - Tổng số nấm mốc, nấm men sống lại được: Không 30 CFU/ g - Tổng số Enterobacteria: Không 50 CFU/ g - Khơng có Salmonella, Escherichia coli, Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1.Tính chất: Bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt yêu cầu nêu 2.2.Hàm ẩm: Thực theo DĐVN IV, phụ lục 9.6 “Mất khối lượng làm khơ 2.3.Độ hòa tan: Lấy khoảng g cao hòa vào ml nước phải tan hồn tồn 24 2.4.Độ trong: Khi hòa tan g cao vào ml nước chuyển vào bát sứ men trắng, nghiêng bát cho chúng chảy thành bát tạo thành lớp dễ quan sát Quan sát ánh sáng tự nhiên, thuốc phải đạt yêu cầu quy định 2.5.Định tính: Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN IV, phụ lục 5.4) 2.5.1 Ngưu tất a Hóa chất, thuốc thử dụng cụ Bản mỏng: Silica gel GF254 tráng sẵn, hoạt hóa 100 oC 10 phút - Ethanol, methanol, cloroform, ether dầu hỏa, n-hexan, ethyl acetat, acid acetic - Hệ dung môi khai triển: Ether dầu hỏa - n-hexan– ethyl acetat – acid acetic - (10 : 20 : : 0,4 - triển khai lần) Thuốc thử phát hiện: Dung dịch vanilin - acid sulfuric (TT): Trộn đồng lượng dung dịch vanilin 1% ethanol 96% dung dịch acid sulfuric 5% ethanol 96% Pha trước dùng b Cách thử Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng g Ngưu tất cắt nhỏ, thêm 30 ml ethanol 96%, đun sôi cách thủy 60 phút (chú ý bổ sung ethanol q trình đun) (hoặc đun sơi hồi lưu cách thủy 40 phút) Lọc, cô cách thủy dịch lọc đến khoảng ml thêm ml acid hydrocloric 10%, chuyển vào bình nón nút mài, đun sơi hồi lưu cách thủy 60 phút, dịch chiết khoảng ml (nếu cần), chuyển sang phễu chiết với nước ml, chiết với cloroform (2 lần x 10 ml) Gộp dịch chiết cloroform, rửa với nước lần x 10 ml, cô dịch cloroform cách thủy đến cạn Hoà cắn với ml methanol làm dung dịch đối chiếu Dung dịch thử: Lấy khoảng 2g cao loại, thêm ml nước cho tan hoàn toàn, thêm ml acid hydrocloric 10%, hồi lưu cách thủy 60 phút, dịch 5ml thêm 5ml nước, chiết cloroform (2 lần x 10ml), gộp dịch, 25 rửa nước lần x 10ml, cách thủy đến cắn, hòa cắn với ml methanol dung dịch chấm sắc ký Tiến hành: Chấm riêng biệt 20 µl dung dịch thử đối chiếu lên mỏng Triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phòng, triển khai thêm lần Phát hiện: Phun thuốc thử màu, sấy 100 - 105 oC đến rõ vết Kết quả: Trên sắc ký đồ dung dịch thử có vết màu sắc vị trí với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 2.5.2 Hồi sơn a Hóa chất, thuốc thử dụng cụ - Bản mỏng: Silica gel GF254 tráng sẵn, hoạt hóa 100 oC 10 phút - Ethanol, methanol, cloroform, ether dầu hỏa, n-hexan, ethyl acetat Hệ dung môi khai triển: - Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (9: 1) b Cách thử - Dung dịch đối chiếu : Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm ml hỗn hợp cloroform - methanol (4 : 1), đun sôi ống sinh hàn hồi lưu khoảng 10 phút Lọc, khoảng ml dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch thử: Lấy khoảng g cao, tiến hành chiết dung dịch thử - Cách tiến hành: Chấm lên mỏng 15 - 20 µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, phun dung dịch vanilin 1% hỗn hợp acid phosphoric methanol (1 : 1) Sấy mỏng 120 oC 15 phút - Kết quả: Sau phun 366, cao có vết tương đương vết dược liệu 2.6.Định lượng chất chiết n – BuOH Cân xác khoảng 2g cao, hòa 10ml nước cất ấm, lắc dịch chiết nước với ether dầu hỏa, EtOAc Sau lắc tiếp với n-Butanol bão hòa nước đến lớp n-Butanol không cho tượng tạo bọt Cất thu hồi nButanol Cắn thu hòa tan 2ml methanol Nhỏ từ từ dung dịch 26 vào thể tích aceton gấp 10 – 15 lần, xuất tủa Để lắng, lọc, rửa tủa Sấy tủa đến khối lượng khơng đổi Cân tủa tính hàm lượng cắn tồn phần chế phẩm theo theo cơng thức : C (%) = m x100 M Trong : C : Hàm lượng % cắn toàn phần m : Khối lượng cắn phân đoạn n-BuOH (g) M : Khối lượng cao đem định lượng (g) Hàm lượng cắn thu không nhỏ 3,5% 2.7.Giới hạn nhiễm khuẩn: Thử theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 13.6 – Thử giới hạn nhiễm khuẩn, trang PL-258, phương pháp đĩa thạch LẤY MẪU - ĐÓNG GÓI – GHI NHÃN – BẢO QUẢN  Lấy mẫu theo qui trình “Lấy mẫu nguyên liệu chế biến, bán thành phẩm thành phẩm” hành Lượng mẫu lấy: khoảng 20 g (dùng để kiểm vi sinh) 80 g (dùng để kiểm hóa lý)  Chế phẩm cho chứa thùng kín, bên ngồi có dán nhãn ghi tên thông tin chế phẩm  Bảo quản nhiệt độ không 30 oC 27 KẾT LUẬN Đã xác định đầy đủ tiêu cao về: Tính chất, Hàm ẩm, độ tan, độ trong, định tính siuwj có mặt dược liệu cao, định lượng chất chiết n BuOH độ nhiễm khuẩn cao trước sau loại tạp khơng có khác biệt Một số kết định tính định lượng cho thấy cao chiết, áp suất giảm tốt chiết, cô áp suất thường Đề xuất tiêu chuẩn cho cao: với đầy đủ tiêu chí khảo sát với tiêu chuẩn phương pháp thử phù hợp 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2010), Dược học cổ truyền, tr Nhà xuất Y học Bộ Y tế - Dược điển Việt Nam IV (2010), Nhà xuất Y học Trường Đại học Dược Hà Nội - Bộ môn Bào chế (2002), Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc, tập I, Nhà xuất Y học, tr 204 - 237 Trường Đại học Dược Hà Nội - Bộ môn Công nghiệp dược (2001), “Kỹ thuật chiết xuất dược liệu”, Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập 1, tr 70 103 Pharmacopoeia of the people's Republic of China (English edition 2010), Chemical Industry press Beijing China Chủ nhiệm đề tài/dự án (ký ghi rõ họ tên) Đại diện CQ chủ trì (ký tên đóng dấu) 29 MỤC LỤC MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CAO THUỐC (Extracta) 1.1.1 Định nghĩa .4 1.1.2 Phương pháp điều chế 1.1.3 Yêu cầu chất lượng cao 1.1.4 Bảo quản 1.2 Một số quy định xây dựng tiêu chuẩn 1.2.1 Các chất đối chiếu (ĐC) 1.2.2 Quy định tạp chất dung môi tồn dư (CPMP/ICH/283/95) 3.4 Q trình phân tích dung mơi tồn dư 13 14 II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 Nguyên liệu 14 Phương pháp (theo phụ lục DĐVN IV) 15 III KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 16 3.1 Nghiên cứu tính chất cao .16 3.2 Nghiên cứu số tiêu định tính 16 3.3 Định lượng chất chiết n-BuOH 21 3.4 Giới hạn nhiễm khuẩn 22 3.5 Đề xuất tiêu chuẩn cho cao 22 KẾT LUẬN 27 30 TÀi liệu tham khảo 28 ... khơng áp dụng cho dược chất, tá dược sản phẩm trình nghiên cứu áp dụng lâm sàng không áp dụng cho dược phẩm lưu hành thị trường Quy định áp dụng cho dạng bào chế cách dùng thuốc Trong vài trường... hành nghiên cứu số tiêu cần thiết cho cao thu từ dịch chiết tồn phần thuốc, từ đề xuất tiêu chuẩn cho sản phẩm trung gian của thuốc Tiền liệt HC áp dụng vào thực tế Mục tiêu chuyên đề: Nghiên cứu. .. chưa có nghiên cứu độc tính trường diễn khả gây ung thư nhiều dung môi thuộc nhóm Các liệu có cho thấy dung mơi tỏ độc nghiên cứu cấp diễn ngắn hạn cho kết âm tính với thử nghiệm độc tính di