nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm probiotic nhằm bổ sung vào thức ăn cho tôm hùm nuôi lồng

Probiotic chủ yếu ức chế sự tăng trưởng và giảm khả năng gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh, tăng cường dinh dưỡng của các loài động vật thủy sản, cải thiện chất lượng nước nuôi trồng thủy s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Tác giả luận văn

Trần Vũ Đình Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Đồ án này

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu - Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ thực phẩm và Lãnh đạo Khoa Sau đại học sự kính trọng, niềm

tự hào được học tập tại Trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Vũ Ngọc Bội và TS Nguyễn Văn Duy - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: ThS Lê Đình Đức - Bộ môn Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm, các cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ chế biến và Công nghệ thực phẩm, các thầy cô giáo - Trung tâm Thí nghiệm thực hành - Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã tạo điều kiện và động viên khích lệ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua

Học viên

Trần Vũ Đình Nguyên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN……… i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về probiotic và vi khuẩn Bacillus 4

1.1.1 Giới thiệu về probiotic 4

1.1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ probiotic 5

1.1.2.1 Hệ vi sinh vật đường ruột và tác dụng của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật chủ 5

1.1.2.2 Cơ chế hoạt động của probiotic 6

1.1.3 Phân loại probiotic 8

1.1.4 Probiotic từ vi khuẩn Bacillus 9

1.2 Ứng dụng chế phẩm probiotic trong nuôi tôm hùm và nuôi trồng thủy sản 10

1.2.1 Tôm hùm 10

1.2.2 Tình hình sản xuất thức ăn và phòng trừ dịch bệnh ở tôm hùm 12

1.2.3 Bệnh Vibriosis đối với tôm hùm và động vật thủy sản 13

1.2.4 Ứng dụng của probiotic 16

1.2.4.1 Trong y học, chăn nuôi và bảo vệ môi trường 16

1.2.4.2 Trong nuôi trồng thủy sản 18

1.3 Tình hình nghiên cứu về sản xuất chế phẩm probiotic trong lĩnh vực nuôi tôm 20 1.3.1 Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic 20

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 22

1.3.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Nguyên vật liệu 29

2.1.1 Chủng vi sinh vật 29

2.1.2 Thức ăn tôm hùm và dầu mực 29

2.1.3 Hóa chất, môi trường 29

2.1.4 Thiết bị chuyên dụng 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Xác định hoạt tính sinh protease 31

2.2.2 Xác định hoạt tính kháng Vibrio spp gây bệnh trên tôm hùm 32

2.2.3 Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn 32

2.2.4 Định danh vi khuẩn Bacillus 32

2.2.5 Xác định khả năng sinh trưởng 32

2.2.6 Nuôi cấy và thu sinh khối probiotic 33

2.2.7 Bố trí thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp 33

2.2.8 Bố trí thí nghiệm xây dựng quy trình lên men ở quy mô pilot 34

2.2.9 Xác định các thông số của quá trình đông khô 35

2.2.10 Bố trí thí nghiệm xác định chất chống đông phù hợp cho quá trình đông khô các vi khuẩn probiotic 37

2.2.11 Xác định tỷ lệ tế bào sống sau đông khô 38

2.2.12 Xác định hàm lượng ẩm tồn dư 39

2.2.13 Khảo sát tỉ lệ trộn dầu mực vào thức ăn 39

2.2.14 Xử lý thống kê 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Nghiên cứu quy trình nuôi cấy vi khuẩn và thu sinh khối từ canh trường nuôi 41 3.1.1 Đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng nghiên cứu 41

3.1.1.1 Xác định hoạt tính sinh protease ngoại bào 41

3.1.1.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 42

3.1.2 Đường cong sinh trưởng và xác định hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian 45

3.1.2.1 Đường cong sinh trưởng của các chủng probiotic nghiên cứu 45

3.1.2.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian 48

3.1.3 Một số đặc điểm sinh học của các chủng probiotic nghiên cứu 49

3.1.4 Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy các chủng vi khuẩn đã lựa chọn 53

3.1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng của các chủng probiotic

nghiên cứu 53

3.1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 54

3.1.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 55 3.1.4.4 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 56 3.1.4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 57

3.1.5 Xây dựng quy trình lên men 58

3.1.5.1 Xác định pH thích hợp cho quá trình lên men 58

3.1.5.2 Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 59

3.1.5.3 Xác định thời gian thích hợp cho quá trình lên men 59

3.1.5.4 Đề xuất quy trình lên men 60

3.2 Xây dựng quy trình đông khô 61

3.2.1 Xác định quy trình đông khô đối với sinh khối vi khuẩn 61

3.2.2 Chất chống đông 63

3.3 Xây dựng quy trình sản xuất và sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic 65

3.3.1 Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic 65

3.3.2 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm 66

3.4 Thử nghiệm sử dụng chế phẩm probiotic phối trộn với thức ăn tôm hùm 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC 77

DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT

Lauria Broth

Generally recognized as safe

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Bệnh gây bởi Vibrio spp trong nuôi trồng thủy sản 15

Bảng 1.2 Chế phẩm probiotic sử dụng trong nuôi tôm, cua, cá, sò và hiệu quả của chúng 19Bảng 3.1 Hoạt tính sinh protease ngoại bào 41Bảng 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu đối với chủng V1.1 43Bảng 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu đối với chủng V3.3 43Bảng 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu đối với chủng DYO5 45Bảng 3.5 Kết quả định danh chủng B3.10.2 bằng bộ kít hóa sinh API 50CHB 51Bảng 3.6 Quy trình đông khô sinh khối các chủng probiotic nghiên cứu 62Bảng PL.1 Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V1.1 của các chủng probiotic nghiên cứu theo thời gian 77Bảng PL.2 Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V3.3 của các chủng nghiên cứu theo thời gian 77Bảng PL.3 Đường cong sinh trưởng của chủng B3.10.1 trên môi trường TSB và LB 77Bảng PL.4 Đường cong sinh trưởng của chủng B3.10.2 trên môi trường TSB và LB 78Bảng PL.5 Đường cong sinh trưởng của chủng B3.7.1 trên môi trường TSB và LB 78Bảng PL.6 Đường cong sinh trưởng của chủng B3.7.4 trên môi trường TSB và LB 78Bảng PL.7 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 79Bảng PL.8 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến các chủng nghiên cứu 79Bảng PL.9 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 79Bảng PL.10 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 79Bảng PL.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 80Bảng PL.12 Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men bằng thiết bị BioFlo 110 80Bảng PL.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men bằng thiết bị BioFlo 11081Bảng PL.14 Tỷ lệ sống của chủng B3.7.4 sau khi đông khô 81Bảng PL.15 Tỷ lệ sống của chủng B3.10.2 sau khi đông khô 81Bảng PL.16 Ảnh hưởng của dầu mực vào thức ăn bổ sung probiotic đối với thời gian tan trong môi trường nước biển 82Bảng PL.17 Áp suất bay hơi theo nhiệt độ 82

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định các thông số đông khô tối ưu cho quá trình

đông khô vi khuẩn probiotic 37

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chất chống đông phù hợp cho quá trình đông khô vi khuẩn probiotic 38

Hình 3.1 Hoạt tính sinh protease ngoại bào của các chủng probiotic nghiên cứu 41

Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng V1.143 Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng V3.344 Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng DY05 44

Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng của chủng B3.10.1 trên môi trường TSB và LB 46

Hình 3.6 Đường cong sinh trưởng của chủng B3.10.2 trên môi trường TSB và LB 46

Hình 3.7 Đường cong sinh trưởng của chủng B3.7.1 trên môi trường TSB và LB 47

Hình 3.8 Đường cong sinh trưởng của chủng B3.7.4 trên môi trường TSB và LB 47

Hình 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V1.1 của các chủng nghiên cứu theo thời gian 48

Hình 3.10 Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V3.3 của các chủng 49

nghiên cứu theo thời gian 49

Hình 3.11 Hình ảnh hình thái khuẩn lạc của các chủng probiotic nghiên cứu 50

Hình 3.12 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào các chủng probiotic nghiên cứu 50

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 53

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến các chủng nghiên cứu 54

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 55

Hình 3.16 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 56

Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 57

Hình 3.18 Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men 58

Hình 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men 59

Hình 3.20 Đường cong sinh trưởng của chủng B3.10.2 khi nuôi trên thiết bị lên men BioFlo 110 60

Hình 3.21 Sơ đồ quy trình lên men 61

Hình 2.22 Chế phẩm probiotic trước (a) và sau khi đông khô (b) 62

Hình 3.23 Tỷ lệ sống của chủng B3.10.2 sau đông khô 63

Hình 3.24 Tỷ lệ sống của chủng B3.7.4 sau đông khô 63

Hình 3.26 Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic dạng đông khô 65

Hình 3.27 Chế phẩm probiotic Bio – Lobster 67

Hình 3.28 Ảnh hưởng của tỉ lệ trộn dầu mực vào thức ăn bổ sung probiotic đối với thời gian tan trong môi trường nước biển 67

Hình 3.29 Thức ăn khi mới cho vào nước biển(A) và sau khi để 8 giờ (B) 68

Hình 3.30 Thức ăn trộn quá nhiều dầu mực 68

LỜI MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Tôm hùm là một loại đặc sản có giá trị kinh tế cao nên nghề nuôi tôm hùm đang rất được quan tâm phát triển ở khu vực miền Trung cũng như trong cả nước Nghề nuôi tôm hùm phát triển mạnh từ năm 2000 mang lại công ăn việc làm và thu nhập cho ngư dân các tỉnh Khánh Hoà, Phú Yên, Ninh Thuận, Bình Định và Bình Thuận

Gần đây, việc nuôi tôm trên khắp thế giới thường xuyên bị ảnh hưởng bởi các bệnh do vi khuẩn, gây ra tổn thất nặng nề Trong đó điển hình là nhóm vi khuẩn

Vibrio, ví dụ như vi khuẩn Vibrio alginolyticus là một trong những tác nhân gây ra

bệnh đỏ thân ở tôm hùm Một yếu tố nữa ảnh hưởng đến quá trình nuôi tôm là do sức

đề kháng của tôm yếu làm quá trình lột xác không thực hiện được khi tôm đến kỳ lột xác và làm cho tôm dễ bị nhiễm bệnh Để kiểm soát vi sinh vật gây hại, phương pháp truyền thống là dùng các hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh, tuy nhiên các hóa chất

diệt khuẩn như chlorin ngoài việc làm tăng mật độ Vibrio sau khi sử dụng, các dẫn

xuất của chlorin còn là những chất gây đột biến và ung thư như: chloroform (CHCl3), bromodichloro-methane (CHBrCl2), dibromodichlo-romethane (CHBrCl2), và bromoform (CHBr3) Các loại kháng sinh tạo ra các chủng kháng kháng sinh, các plasmid mã hóa cho các gen kháng kháng sinh có thể truyền từ vi sinh vật gây bệnh ở thủy sản sang các vi sinh vật gây bệnh cho động vật và người Vì lẽ đó ngày nay nhiều loại kháng sinh đã bị cấm sử dụng trong nuôi thủy sản và làm thế nào để cải thiện môi trường sinh thái của nuôi trồng thủy sản đã trở thành tâm điểm chú ý của nuôi trồng thủy sản quốc tế

Từ lâu đã có những mối quan tâm đến việc tìm ra các chất thay thế kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, các hoạt chất, chế phẩm sinh học giúp tăng sức đề kháng của vật nuôi, cải thiện và nâng cao hiệu quả chăn nuôi Những vi sinh vật sống trong đường tiêu hóa của vật nuôi có ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sinh trưởng, phát triển của vật nuôi Vì vậy, điều quan trọng là phải hiểu cơ chế của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa vật nuôi, tìm ra các hoạt chất thay thế các chất kháng sinh độc hại Cơ sở khoa học của việc sử dụng các chế phẩm vi sinh là tăng sức khỏe cho động vật nuôi, cải thiện môi trường và khống chế số lượng vi sinh gây bệnh (Farzanfar, 2006) Trong trạng thái bình thường thì trong hệ tiêu hóa có sự cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và gây bệnh Nó bị ảnh hưởng bởi các tương tác, quan hệ cộng sinh và cạnh tranh Hệ vi sinh

vật có lợi không chỉ bảo vệ bộ máy tiêu hóa mà còn tăng khả năng hấp thụ thức ăn giúp cho vật chủ tăng khả năng sinh trưởng và phát triển

Nuôi trồng thủy sản, cũng như ngành công nghiệp khác, liên tục đòi hỏi kỹ

thuật mới, sử dụng các tác nhân mới như vi khuẩn lactic và Bacillus spp được đưa vào

để thúc đẩy sự tăng trưởng của vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản Ngày nay, các chế

phẩm sinh học được ứng dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ, Nhật Bản, các nước châu Âu, Indonesia, Ấn Độ và Thái Lan, với kết quả khả quan Nghiên cứu về probiotic có thể tạo ra một lĩnh vực mới của sản phẩm công nghiệp, giống như các lĩnh vực công nghiệp chế biến sản phẩm nuôi trồng và chế biến thực phẩm nuôi trồng thủy sản Trung Quốc là một nước lớn trong nuôi trồng thủy sản Trong những năm gần đây, chính phủ Trung Quốc đã nhận thức được giá trị kinh tế và lợi ích xã hội tiềm năng của các ứng dụng của men vi sinh trong nuôi trồng thuỷ sản, và gần đây, quan tâm nhiều hơn đến việc nghiên cứu và phát triển của men vi sinh trong nuôi trồng thủy sản

Do đó, chính phủ đã tăng kinh phí nghiên cứu cho nó Probiotic chủ yếu ức chế sự tăng trưởng và giảm khả năng gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh, tăng cường dinh dưỡng của các loài động vật thủy sản, cải thiện chất lượng nước nuôi trồng thủy sản và giảm việc sử dụng kháng sinh và hóa chất khác, do đó giảm ô nhiễm môi trường của các kháng sinh còn lại và hóa chất Điều này có nghĩa là lợi ích của men vi sinh sẽ được lâu dài, và các ứng dụng của men vi sinh sẽ trở thành một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển nuôi trồng thủy sản trong tương lai (Maqsood, 2010) Sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi thủy sản nói chung và trong nuôi tôm nói riêng ở nước

ta là một xu hướng tích cực và ngày càng mở rộng

Chính từ những lý do trên, dưới sự hướng dẫn của TS Vũ Ngọc Bội và TS

Nguyễn Văn Duy, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất chế

phẩm probiotic nhằm bổ sung vào thức ăn cho tôm hùm nuôi lồng”

Mục tiêu của đề tài

- Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic

- Thử nghiệm phối trộn chế phẩm probiotic vào thức ăn của tôm hùm

Nội dung nghiên cứu

1) Nghiên cứu quy trình nuôi cấy vi khuẩn và thu sinh khối từ canh trường nuôi 2) Xác định các thông số thích hợp cho quy trình đông khô chế phẩm vi khuẩn:

kỹ thuật đông khô, chất chống đông…

3) Xây dựng quy trình sản xuất và sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic 4) Đánh giá khả năng sử dụng chế phẩm trong lĩnh vực làm thức ăn nuôi tôm hùm lồng

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Việc sử dụng các chế phẩm sinh học, nhất là probiotic, trong nuôi trồng hải sản

là hướng nghiên cứu khá mới, đầy triển vọng nhằm góp phần phòng trừ dịch bệnh, cải thiện chất lượng sản phẩm, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và phát triển bền vững nghề nuôi trồng thủy sản Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic cho đối tượng tôm hùm là một vấn đề mới trên thế giới và Việt Nam

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic được sử dụng bổ sung vào thức ăn cho tôm hùm sẽ góp phần làm tăng sức đề kháng bệnh tật, tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng, nâng cao khả năng sinh trưởng và phát triển của tôm hùm

Việc sử dụng chế phẩm probiotic làm hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh, các chất kích thích tăng trưởng làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, tránh được việc tồn đọng dư lượng các chất độc hại trên tôm hùm gây ảnh hưởng không có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng và giảm thiểu ô nhiễm môi trường xung quanh Từ đó tăng khả năng tiêu thụ, xuất khẩu sản phẩm, mang lại giá trị lợi nhuận và hiệu quả kinh tế cao Đó cũng chính là góp phần vào việc phát triển nền kinh tế đất nước, phát huy thế mạnh tiềm năng, sử dụng các nguồn lợi từ biển, góp phần giải quyết việc làm cho người lao động trong lĩnh vực nuôi trồng và chế biến thủy sản

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về probiotic và vi khuẩn Bacillus

1.1.1 Giới thiệu về probiotic

Thuật ngữ “probiotic” được Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả những chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trưởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác Năm

1989, Parker lại định nghĩa thêm cho rõ: “Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi

khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng

hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ” (Parker, 1989) Do

vậy, probiotic có nghĩa là phòng ngừa hay dự phòng sinh học (có lẽ là do ghép 2 chữ tiếng Anh: Prophylxia – phòng bệnh, dự phòng và biotics – sự sống)

Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhưng tác dụng của nó đã được nhận thấy từ lâu Elie Metnhicoff là người đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic, ông đề nghị sử dụng vi khuẩn lactic để kéo dài tuổi thọ con người vào năm 1908 Ngày nay chế phẩm probiotic được sử dụng khá hiệu quả trong chăn nuôi đặc biệt là trong nuôi tôm, trồng trọt, trong bảo vệ sức khỏe con người

và bảo vệ môi trường Tuy nhiên việc dùng chế phẩm này vào nuôi trồng thủy sản (tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây

Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh vật hữu hiệu)

do giáo sư, tiến sỹ Teruo Higa, Trường đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản đề xuất năm 1980 đã được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo vệ môi trường đều cho kết quả khả quan (Higa, 1980) Đến nay chế phẩm này được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình Dương trong

đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam

Thành phần của các chế phẩm probiotic là các vi sinh vật được sử dụng phổ

biến như: vi khuẩn lactic (Lactobacilli, Streptococci và Bifidobacteria), Bacillus sp., nấm men (Saccharomyces cerevisiae) và nấm sợi (Aspergillus oryzae) Những chủng

probiotic này được tìm thấy trong ruột của động vật khỏe mạnh với số lượng lớn Chúng được xem là an toàn (GRAS) theo lời của FDA, Mỹ Các chế phẩm probiotic được sử dụng dưới nhiều dạng như: dạng bột, dạng viên nén, viên nang hay bột nhão (Fuller, 1992)

Tiêu chuẩn lựa chọn robiotic:

- Kiểm tra in vitro đối với hoạt tính kháng khuẩn

- Kiểm tra khả năng bám dính và tồn tại của chủng probiotic

- Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm sinh học trên vật chủ, hiệu quả kinh tế trước khi sản xuất thương mại

Một probiotic phải có hiệu quả và an toàn (Verschuere et al, 2000) Nó không

có hại và có thể nhận được bởi động vật chủ thông qua hệ tiêu hóa trực tiếp Nó không chứa gen kháng độc lực hoặc kháng kháng sinh

1.1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ probiotic

1.1.2.1 Hệ vi sinh vật đường ruột và tác dụng của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật chủ

Theo Jans (2005), một mặt hệ vi sinh vật đường ruột liên quan đến việc tiêu hóa, mặt khác nó tác động đến hệ thống miễn dịch do đó mục tiêu của việc sử dụng chế phẩm sinh học là để giúp ổn định sức khỏe và dinh dưỡng cho vật chủ Sự hỗ trợ của hệ vi sinh vật đường ruột giúp ức chế sự phát triển của mầm bệnh, tác nhân gây bệnh tiềm năng và các vi sinh vật khác từ đó ngăn chặn các vi sinh vật có hại xâm nhập vào cơ thể

Trong hệ vi sinh vật đường ruột, số lượng loài được xác định có khoảng 400 đến 500 loài khác nhau Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của đường tiêu hóa cũng khác nhau:

- Dạ dày: 101-103 cfu/ml, chủ yếu gồm Lactobacilli, Enterobacteria,

Bacteroides

- Tá tràng: 101-104 cfu/ml

- Ruột non: 105-108 cfu/g, chủ yếu gồm Bacteroides (104-107), Steptococci,

Lactobacilli, Enterobacteria

- Ruột già: 109-1012 cfu/g, chủ yếu gồm Bifidobacteria, Bacteroides,

Enterobacteria (105-107), Enterococci (102-105), Lactobacilli, Clostridia, Fusobacteria, Veillomella, Staphylococci, nấm men, Proteus, Pseudomonas

Tùy thuộc vào điều kiện trong đường tiêu hóa mà trạng thái cân bằng động giữa các loài khác nhau được thành lập Theo Jans (2005), hệ vi sinh vật ở trạng thái cân

bằng khi nhóm vi khuẩn kị khí (Clostridia, Bifidobacteria, Lactobacilli, Bacteroides,

Eubacteria) chiếm trên 90%; nhóm vệ tinh (Satellite flora) gồm chủ yếu là Enterococcus và E coli chiếm khoảng 1% và nhóm còn lại (Residual flora) gồm các

vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas chiếm dưới 0,01%

Nhóm vi khuẩn chính, nhóm vệ tinh và nhóm vi sinh vật còn lại tạo thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là "eubiosis", tiếng Hy Lạp có nghĩa là "chung sống" của các vi sinh vật với nhau cũng như với các sinh vật chủ Mối quan hệ này là quan hệ cộng sinh giữa vật chủ và hệ vi sinh vật Vật chủ sẽ tạo điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ,

pH, chất dinh dưỡng và đào thải các chất chuyển hóa Khi hệ vi sinh vật ở trạng thái cân bằng sẽ chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây hại , tổng hợp vitamin B và K , kích thích hệ miễn dịch và sinh trưởng của vật chủ Nếu mối quan hệ này bị gián đoạn nghiêm trọng, tình trạng này được gọi là dysbiosis (“chung sống có hại”) Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa bị tác động bởi các nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vật chủ (hệ miễn dịch, muối mật, enzyme…), thành phần và chất lượng thức ăn Tác động của dysbiosis làm cho vật chủ có thể trạng yếu, tăng trưởng kém và các triệu chứng về tiêu hóa

1.1.2.2 Cơ chế hoạt động của probiotic

a Cạnh tranh dinh dưỡng

Bên cạnh cạnh tranh nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ và nhiều loại muối khoáng, tất cả các vi sinh vật đều cần sắt để tăng trưởng Siderophore là một chất có khả năng gắn với ion sắt, hòa tan sắt dễ dàng cho vi sinh vật Các vi sinh vật vô hại sinh siderophore có thể sử dụng như probiotic để cạnh tranh sắt với các vi khuẩn gây hại

(Vine et al., 2006)

b Cạnh tranh vị trí bám dính với vi sinh vật gây bệnh

Khả năng bám dính của các vi khuẩn probiotic vào niêm mạc ruột được xem là một trong những tiêu chí lựa chọn chủng probiotic Các tế bào biểu mô đường ruột là

tế bào chủ cho hàng triệu vị trí gắn thụ thể của vi khuẩn khác nhau Khi probiotic liên kết với vị trí gắn thụ thể trên tế bào biểu mô sẽ làm thay đổi niêm mạc của tế bào đó và

tế bào lân cận Do đó vi khuẩn có hại ít có khả năng bám dính lên miên mạc ruột Probiotic có thể tìm thấy điểm gắn trong rất nhiều vị trí, do đó ngăn ngừa vi khuẩn có hại xâm nhập Vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trưng (chất bám dính và các phân tử thụ thể của ruột) và cơ chế không đặc trưng (dựa vào những yếu

tố hóa học) Một vài thành phần cấu tạo của vi khuẩn: protein, thành tế bào, carbonhydrate, và acid lipoteichoic được xem là có liên quan đến tính bám dính của probiotic vào ruột

c Sản xuất các hợp chất kháng khuẩn

Thành phần chất tiết ra khó có thể xác định được nên được gọi chung là chất ức chế Vi khuẩn lactic từ lâu được biết là chủng vi khuẩn tiết ra chất kháng khuẩn (bacteriocin) Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản là nhóm Gram âm Nhiều

vi khuẩn tiết ra chất ức chế chống lại các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas

hydrophila và Vibrio parahaemolyticus (Nair et al., 1985) Cơ chế tiết ra chất chống

lại vi khuẩn gây bệnh trong các thử nghiệm ở mức tế bào in-vitro rất phổ biến trong

môi trường nước Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng có nhiều dòng vi khuẩn

in-vitro kìm hãm được các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản Những nghiên cứu

này cũng chứng minh khả năng kìm hãm vi khuẩn của những dòng vi khuẩn thông thường dễ tìm thấy trong môi trường (Fuller, 1989) Những quần thể sinh vật này có thể tiết vào môi trường những chất có tính sát khuẩn hoặc kìm khuẩn, gây ảnh hưởng đến quần thể vi sinh khác, nhằm gián tiếp cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường Sự hiện diện của những vi khuẩn này sản sinh chất kìm hãm, có thể tiết trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước làm rào cản gây ức

chế các vi sinh vật gây bệnh (Vine et al., 2006)

d Ức chế cơ chế kiểm soát mật độ tới hạn (Quorum Sensing)

Theo Đặng Tố Vân Cầm (2009), mỗi vi khuẩn có thể phóng thích ra một loại phân tử hóa học đặc trưng Các phân tử này sẽ khuếch tán vào trong môi trường nước Khi tích lũy đến một nồng độ tới hạn nào đó, các phân tử hoá học sẽ trở thành một loại tín hiệu giúp vi khuẩn có thể dò tìm và nhận biết đồng loại Nói cách khác, Quorum Sensing là cơ chế vi khuẩn điều khiển gene liên quan đến mật độ quần thể bằng cách tạo ra (producing), phóng thích (releasing) và dò tìm (detecting) các phân tử tín hiệu;

là tiến trình các tế bào vi khuẩn thông tin liên lạc với nhau bằng các phân tử tín hiệu

Nhờ Quorum Sensing, vi khuẩn có thể kích hoạt sự hoạt động của các gen mã hóa các tiến trình như: tạo màng sinh học, tạo bào tử, phát sáng, sản xuất kháng sinh, tiết ra các độc tố,… Hệ thống Quorum Sensing của vi khuẩn đã được phát hiện từ lâu Chúng có chức năng điều khiển độc lực của rất nhiều loài vi khuẩn và là tác nhân gây bệnh cho người, cho vật nuôi và cho cây trồng Các phân tử tín hiệu của vi khuẩn Gram âm là Acyl Homoserine Lactone (AHL)

Việc phá hủy hệ thống Quorum Sensing của tác nhân gây bệnh nhằm làm bất hoạt mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của tác nhân gây bệnh, là hướng nghiên cứu - ứng dụng hoàn toàn mới trong lĩnh vực phòng trị bệnh bằng probiotic

e Cải thiện chất lượng nước

Theo Sihag và Sharma (2012), việc bổ sung chế phẩm sinh học giúp cải thiện

chất lượng nước, đặc biệt là vi khuẩn Bacillus spp Trong ao nuôi chứa nhiều bùn sẽ

tích tụ nhiều nitrogen, một số vi khuẩn gram âm tiết ra chất nhầy làm ngăn cản khuyếch tán oxy vào lớp bùn đáy Dó đó lớp chất thải ở đáy ao không bị phân hủy, probiotic giúp phân hủy làm sạch chất thải ở đáy ao Nhóm vi khuẩn có lợi có khả năng loại bỏ chất thải chứa nitơ (ammonia, nitrite và nitrát) nhờ enzyme ngoại bào do chúng chuyển hóa Cho nên nhóm vi khuẩn này giải phóng enzyme trong ao có tác dụng làm giảm vi khuẩn, virus gây bệnh trong ao (Bùi Quang Tề, 2009) Nhóm vi

khuẩn này lấn át nhóm vi khuẩn gây bệnh như Vibrio spp., Aeromonas spp… Khi vi

khuẩn probiotic được sử dụng trong môi trường nuôi có tảo, một số chủng vi khuẩn ức

chế sự tăng trưởng của các loại tảo đơn bào (Pavlova lutheri) ở các mức độ khác nhau (Munro et al.,1995)

1.1.3 Phân loại probiotic

Các chế phẩm sinh học được sử dụng ở động vật có thể được chia thành ba

nhóm chính: vi khuẩn lactic, Bacillus spp và nấm men (Jans, 2005)

- Vi khuẩn lactic: Vi khuẩn này được sử dụng trong nhiều thiên niên kỷ trong việc sản xuất sản phẩm sữa lên men và thực phẩm muối chua Một số chủng vi khuẩn

được lựa chọn làm chế phẩm probiotic như: Lactobacillic, Pediococci, Bifidobacteria

và Enterococci Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic chuyển đổi một số loại đường

thành acid lactic Tính năng đặc trưng của nhóm chế phẩm sinh học này là sinh các chất kháng khuẩn và sự hình thành màng sinh học để bảo vệ màng nhầy ruột sản xuất các chất ức chế như aicd béo mạch ngắn làm giảm pH Loại trừ các vi sinh vật gây bệnh hoặc ngăn chặn chúng dính vào màng nhầy ruột Sự gia tăng số lượng vi khuẩn lactic tạo thành một hàng rào chống lại các vi sinh vật khác trong ruột Ngăn chặn sản xuất độc tố Kích thích hệ thống miễn dịch trong ruột Ảnh hưởng các điều kiện lý hóa trong ruột, ví dụ pH và thế oxy hóa khử, qua đó hạn chế các điều kiện tăng trưởng Ảnh hưởng trên sự chuyển hóa của các acid mật và do đó thúc đẩy sự hấp thụ chất béo, tác dụng trên biểu mô ruột, cải thiện khả năng hấp thụ

- Vi khuẩn Bacillus: Là vi sinh vật được tìm thấy phổ biến trong đất, vi khuẩn

có dạng hình que, bắt màu gram dương Khả năng tự nhiên của men vi sinh Bacillus chống lại các ảnh hưởng bên ngoài Rengpipat và cs (2000), chỉ ra rằng việc sử dụng các vi khuẩn Bacillus sp cung cấp bảo vệ bệnh bằng cách kích hoạt hệ miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể ở tôm Sú (Penaeus monodon) Vi sinh vật thuộc nhóm

Bacillus nhờ môi trường thích hợp sẽ phát triển số lượng rất lớn, cạnh tranh sử dụng

hết thức ăn của động vật nguyên sinh, Vibrio và các vi sinh vật có hại, ngăn cản sự

phát triển của chúng, từ đó giảm được các tác nhân gây bệnh

- Nấm men: Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được sử dụng trong

nhiều thế kỷ đối với sản xuất thực phẩm Nấm men đã được sử dụng khoảng 370 trước Công nguyên, Hippocrates đã phát hiện ra tác dụng lợi tiểu của nấm men và coi nó

như là một loại thuốc Một số chủng Saccharomyces cerevisiae có thể để cung cấp

chất dinh dưỡng: peptide, vitamin, acid hữu cơ

1.1.4 Probiotic từ vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn, gram dương, tế bào hình que và thẳng, kích thước 0,5 – 2,5 x 1,2 – 10 μm, di động bằng chu mao Chi Bacillus rất đa dạng về

sinh lý và sinh thái Chúng là vi sinh vật hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn Là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ Các chủng này sinh trưởng tốt trong môi trường chứa glucose, amonium sulphate và một vài loại muối khoáng Nhiều loài

Bacillus có khả năng kháng nhiệt, chịu được điều kiện khô hạn, pH cực trị, chất khử và

các phân tử có hại khác Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với

pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như

Bacillus acidocaldrius Về nhiệt độ có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (450 – 750C), hay

ưa lạnh (50

– 250C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 340

– 370C (Gordon, 1973)

Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí,

một số loài còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật (Lương Đức phẩm, 1998)

Các loài thuộc chi Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ

nguyên hình que khi mang bào tử, trong một số trường hợp chỉ hơi phình to lên một chút Mỗi tế bào sinh dưỡng thường chỉ hình thành một nội bào tử Thông thường bào

tử được tạo ra khi tế bào đã trãi qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng (sự suy giảm của cacbon, nitơ, phốt pho), quá trình này cần phải bắt đầu trước khi sự cạn kiệt toàn bộ các chất dinh dưỡng, nếu không sự hình thành bào tử không thể được hoàn thành do các chất dinh dưỡng còn quá thấp cho quá trình hình thành bào tử (Perez, 2000) Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi nảy nở mà để chịu đựng với các điều kiện bất lợi Bào tử có màng nhiều lớp, chứa ít nước tự do và do đó có thể tồn tại trong nhiều năm, chịu đựng tốt với nhiều tác động bất lợi có thể làm chết các tế bào dinh dưỡng, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng (Gordon, 1973; Lương Đức phẩm, 1998)

Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ,

như protein, khá mạnh nhờ sinh ra protease ngoại bào Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh ra amylase làm loãng tinh bột, biến chất này thành dễ hòa tan và thủy phân tiếp theo thành các dextrin và các loại đường hợp thành Một số chủng thuộc loài

Bacillus subtilis, B mesentericus… có thể có khả năng sinh ra enzym cenlulase và

hemicellulase phân hủy cellulose, hemicellulose (Lương Đức Phẩm, 1998)

Ngoài các enzym trên, các vi khuẩn còn có khả năng sinh ra các chất có hoạt

tính kháng sinh như insulin, subtilin từ Bacillus subtilis, bacterioxin từ B

licheniformis… (Lương Đức Phẩm, 1998)

Khả năng gây bệnh của chi Bacillus đối với các sinh vật khác là không phổ biến Có 4 loài B theringiensis, B larvae, B popilliae, B lentimorbus và một số chủng của B sphaericus gây độc với côn trùng, B anthracis và B cereus gây độc cho

người và động vật (Gordon, 1973)

1.2 Ứng dụng chế phẩm probiotic trong nuôi tôm hùm và nuôi trồng thủy sản

1.2.1 Tôm hùm

Tôm hùm là một đối tượng có giá trị kinh tế Từ năm 1992 nghề nuôi tôm hùm

ở Việt Nam đã bắt đầu phát triển Trong những năm gần đây sản lượng tôm hùm nuôi

ổn định khoảng 2000 tấn/năm (Lai Van Hung, 2008) Nuôi tôm hùm là nghề có giá trị kinh tế cao, góp phần nâng cao giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam Nuôi tôm hùm lồng đã tạo ra công ăn việc làm, tăng thu nhập cho người dân địa phương, và đóng góp đáng kể vào sự phát triển kinh tế của các tỉnh ven biển (Dean D, 2011)

Một số loài tôm hùm có giá trị kinh tế thuộc giống Panulirus gặp ở biển Việt Nam

(Nguyễn Thị Bích Thúy, 1998)

Ngành chân đốt (Arthropoda)

Lớp giáp xác (Crustacea)

Bộ mười chân (Decapoda)

Họ tôm hùm gai (Palinuridae)

Giống Panulirus

Loài tôm hùm Bông – Panulirus ornatus (Fabricius, 1798) Loài tôm hùm Đá – Panulirus homarus (Linnaeus, 1758) Loài tôm hùm Đỏ - Panulirus longipes (A Milne Edwards, 1868) Loài tôm hùm Sỏi – Panulirus stimpsoni (Holthuis, 1963)

Loài tôm hùm Tre – Panulirus polyphagus (Herbst, 1793) Loài tôm hùm Sen – Panulirus versicolor (Latreille, 1804) Loài tôm hùm Ma – Panulirus penicillatus (Olivier, 1791)

Tuỳ theo giai đoạn phát triển mà tôm hùm phân bố ở những độ sâu khác nhau Giai đoạn trưởng thành, chúng sống ở độ sâu 20 m trở lên, giai đoạn ấu trùng và con non chủ yếu tập trung ở các bãi đá, san hô độ sâu từ 2 – 10 m Tôm hùm thường sống

ở các rạn san hô ngầm xa bờ, xen kẽ đá san hô, nơi có nhiều hang hốc, khe rãnh ven biển, độ sâu từ 5 – 35 m, độ mặn khoảng 30 - 340

/00, nhiệt độ từ 220 - 320C và độ trong suốt cao Chúng có tập tính sống quần tụ chủ yếu ở tầng đáy với chất đáy sạch, không bùn

Tôm hùm lớn lên nhờ quá trình lột xác Tôm càng nhỏ, quá trình lột xác càng ngắn và tôm lớn càng nhanh Tôm hùm có chu kỳ lột xác dài hơn so với các loài giáp xác khác, do đó tốc độ tăng trưởng của chúng cũng chậm hơn

Tôm hùm là loài ăn tạp, trong tự nhiên thức ăn chủ yếu là cá, tôm, cua, ghẹ nhỏ, cầu gai,…ngoài ra, chúng còn ăn các loại rong rêu Tôm hùm bắt mồi tích cực về đêm

và gần sáng Tuy nhiên, hệ số thức ăn (FCR) tính theo trọng lượng tươi khá cao và khác nhau tùy theo loài Đối với tôm hùm bông cỡ 10-90g/ con, FCR là 17-20; cỡ 100-

500 g/con, FCR là 11-26; cỡ 600-1000 g/con, FCR là 27-32 (Nguyễn Thị Bích Thúy , 1998)

Tôm hùm sinh sản ở tất cả các thời điểm trong năm nhưng mùa sinh sản chính tôm là từ tháng 8 đến tháng 9 Giai đoạn ấu trùng phát triển từ thời gian tháng 10 đến

12 Phải mất 10 đến 12 tháng để phát triển thành tôm trưởng thành Cho đến nay, các trại sản xuất giống tôm hùm giống vẫn chưa thành công nên chủ yếu vẫn phải dựa từ nguồn tôm giống tự nhiên (Dean, 2011)

Tôm hùm phân bố rộng khắp ở v ùng biển nhiệt đới từ Ấn Độ Dương đến Thái Bình Dương Ở nước ta , Tôm hùm được phân bố chủ yếu ở vùng biển miền Trung từ Quảng Bình đến Bình Thuận Nhờ có giá trị kinh tế cao nên nghề nuôi tôm hùm lồng

có tiềm năng lớn để phát triển tại Việt Nam (Lai Van Hung, 2008)

Các nước sản xuất nhiều tôm hùm như : Australia, New Zealand, Nam Phi, Cuba, Brazil, Mexico và Mỹ, với hơn 70% đánh bắt từ vùng biển Caribbean và Đông Nam khu vực Đại Tây Dương và phía đông Ấn Độ Dương (Philips và Kittaka, 2000)

1.2.2 Tình hình sản xuất thức ăn và phòng trừ dịch bệnh ở tôm hùm

Mặc dù nhiều nghiên cứu đưa ra các công thức thức ăn, nhu cầu dinh dưỡng cho tôm hùm Bông, tuy nhiên qui trình kỹ thuật sản xuất thức ăn để có thể đảm bảo các yêu cầu như: tính ổn định trong môi trường nước, mùi vị hấp dẫn của viên thức ăn đối với tôm hùm ở các giai đoạn phát triển khác nhau thì vẫn còn rất ít Mới đây đã có nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất thức ăn cho tôm hùm (Lại Văn Hùng, 2007)

Nuôi tôm hùm là nghề có giá trị kinh tế cao, góp phần nâng cao giá trị xuất khẩu thuỷ sản của Việt Nam Tuy nhiên dịch bệnh trên tôm thời gian qua gây thiệt hại lớn Các loại bệnh gây chết tôm hùm vẫn là các bệnh như bệnh sữa, mang đen, đỏ thân, hở mang Theo Vụ Nuôi trồng thủy sản (Bộ Nông nghiệp – Phát triển nông thôn),

cả nước hiện có trên 49.500 lồng nuôi tôm hùm, trong đó Phú Yên có 29.000 lồng, Khánh Hòa 19.000 lồng Sản lượng tôm hùm nuôi hàng năm cả nước đạt trên 2.000 tấn Với giá thị trường 2 tỷ đồng/tấn, tôm hùm nuôi mang lại giá trị kinh tế rất lớn

Từ năm 2008 đến nay, tình trạng tôm hùm bị chết do bệnh sữa xảy ra ở hầu hết các địa phương có nghề nuôi tôm hùm Trong đó, Khánh Hòa là tỉnh thiệt hại nặng nề nhất, tỷ lệ tôm chết bình quân hàng năm khoảng 30% tổng lượng nuôi, năm 2008 tỷ lệ chết trên 50%, gây tổn thất hàng trăm tỷ đồng

Từ đầu năm 2012, người nuôi tôm hùm gặp khó khăn vì bệnh sữa bùng phát trên tôm Lợi dụng dịch bệnh, thương lái ép giá tôm thương phẩm làm người nuôi tôm thua lỗ nặng Theo Báo cáo của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, nghề nuôi tôm Hùm tại Phú Yên, từ đầu vụ thả nuôi (tháng 11/2011) đến nay, cả tỉnh đã có gần 75.600 con tôm hùm nuôi bị chết, chiếm hơn 20,5% số lượng tôm nuôi do tác động

xấu do thời tiết và môi trường nước bị ô nhiễm đã làm tôm hùm nuôi bị mắc các bệnh như đục thân, đen mang, lỏng cổ, đường ruột và bệnh sữa Tính đến giữa tháng 4, tại 2 tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên có trên 600.000 con tôm gần đến tuổi thu hoạch chết vì bệnh sữa, thiệt hại lên tới hàng trăm tỷ đồng Phú Yên, thủ phủ nuôi tôm hùm cả nước cũng đang vật lộn với việc dập dịch

Chi cục Thú y tỉnh Phú Yên cho biết đến nay lượng tôm chết đã giảm nhiều nhưng dịch bệnh vẫn còn lây lan Chưa có thống kê chính xác, nhưng 100% hộ nuôi tôm hùm tại Phú Yên đều có tôm nhiễm bệnh, tùy mức độ nặng nhẹ, ít hay nhiều Tại Khánh Hòa, từ đầu năm đến nay, bệnh sữa trên tôm hùm tiếp tục bùng phát ở hầu hết các địa phương trong tỉnh Trong đó, xã Vạn Thạnh, huyện Vạn Ninh là địa phương bị thiệt hại nặng nề nhất, mỗi ngày có khoảng 400 – 500 kg tôm bị chết, trong đó có trên 80% chết vì bệnh sữa, gây thiệt hại cho người nuôi hàng trăm tỷ đồng

Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Phú Yên, chính vì lợi nhuận cao

mà người dân đổ xô vào nuôi tôm hùm, số lồng tôm hùm thả nuôi tăng gây nên hệ lụy phá vỡ quy hoạch, ô nhiễm môi trường ở nhiều vùng nuôi Dịch bệnh cũng bùng phát khiến tôm nuôi chết hàng loạt gây thiệt hại nặng về kinh tế Hoạt động nuôi lồng trên biển cũng được Tổng cục thủy sản dự báo sẽ làm tăng thêm lớp trầm tích chất thải dày khoảng 3-5 cm, làm xấu đi môi trường tại những khu vực này Chất lượng nước tại các vùng nuôi tôm hùm cũng bị suy giảm nghiêm trọng do hàm lượng NH3 và H2S cao trong tầng nước sát đáy và tầng đáy, chúng được coi là những nguyên nhân chủ yếu làm cho tôm hùm chết hàng loạt Việc phát triển mô hình nuôi trồng thủy sản trên biển

sẽ làm cho môi trường nước của những khu vực này bị ô nhiễm ngày càng nghiêm trọng

1.2.3 Bệnh Vibriosis đối với tôm hùm và động vật thủy sản

Tôm và môi trường sống là một thể thống nhất Khi chúng mắc bệnh là kết quả tác động qua lại giữa cơ thể và môi trường sống Do đó tôm bị bệnh phải có 3 nhân tố (Bùi Quang Tề, 2009):

- Môi trường sống: t0, pH, O2, CO2, NH3, NO2, kim loại nặng, Những yếu tố này thay đổi bất lợi cho tôm và tạo điều kiện thuận lợi cho tác nhân gây bệnh (mầm bệnh) dẫn đến dễ mắc bệnh

- Tác nhân gây bệnh: virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và những sinh vật hại khác

- Vật nuôi: có sức đề kháng hoặc mẫn cảm với các tác nhân gây bệnh

Trong đó bệnh do tác nhóm vi khuẩn gây ra thiệt hại lớn cho việc nuôi thủy sản

Những vi khuẩn Vibrio thường xuyên có mặt trong môi trường và gây bệnh Vibriosis

thường thấy phổ biến trong ngành nuôi thủy sản hiện nay

Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là các vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào 0,3 - 0,5 × 1,4 - 2,6 µm Vibrio không hình

thành bào tử và có khả năng chuyển động nhờ tiên mao, đa phần có phản ứng Oxydase (+), có khả năng oxy hóa và lên men trong môi trường O/F Glucose, không sinh H2S

và mẫn cảm với Vibriostat (0/129) Hầu hết các loài giống Vibrio đều phân bố trong

môi trường nước mặn, thích hợp ở 20-40‰, có loài còn có thể phát triển ở độ mặn

70‰, Vibrio là vi khuẩn đặc trưng cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ

25 - 300C, nên Vibrio luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi động vật thủy sản biển, đặc

biệt giáp xác nuôi thâm canh ven biển và trên biển Môi trường TCBS (Thiosulphate

citrate bile salt agar) là môi trường chọn lọc của Vibrio spp Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc này, Vibrio spp được chia thành 2 nhóm: Nhóm có khả

năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu vàng; Nhóm không có khả năng lên men đường sucrosse và có khuẩn lạc màu xanh lá cây trên môi trường TCBS (Đỗ Thị

Hòa và cs, 2004)

Trong bệnh Vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân

thứ cấp (tác nhân cơ hội), ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trường như cơ học, hóa học Hóa học có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh Vibriosis

ở động vật thủy sản Vi khuẩn Vibrio spp có thể cảm nhiễm và gây nhiều bệnh khác

nhau ở động vật thủy sản, đặc biệt là cá và giáp xác sống ở vùng nước có độ mặn cao

Các loài Vibrio ở động vật thủy sản thường gặp bao gồm: Vibrio anguillarum, V

harveyi, V vulnificus, V salmonicida… (Thompson et al., 2004)

Ở động vật thủy sản, Vibrio có thể gây một số bệnh khác nhau với những dấu

người ta phân lập được Vibrio harveyi, V vunlnificus và V parahaemolyticus (Đỗ Thị

Viêm dạ dày

Bệnh vỏ

Bệnh đỏ đuôi, tử vong 80%

Vibriosis

Vibriosis

(Chatterjee and Haldar, 2012)

- Bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác, còn có tên gọi khác: Bệnh vỏ (shell disease), bệnh đốm nâu, đốm đen (Brown or black spot disease), bệnh hoại tử phụ bộ (Necrosis

of Apendgages disease), ở cua biển khi bị bệnh này có tên gói là bệnh rỉ sắt, bệnh hoa mai Giáp xác khi bị bệnh này thường có một số dấu hiệu sau: xuất hiện các vùng mềm trên vỏ, sau đó tạo nên các điểm nâu, đen hay trắng, tại đó vỏ kitin bị ăn mòn, các phần phụ (chân bơi, râu…) và đuôi tôm có thể phồng lên rồi cụt dần , có sắc tố đen nâu trên

mô gan tụy Bệnh này có thể xảy ra ở các giai đoạn phát triển khác nhau: tôm mẹ, tôm

thịt, ấu trùng và hậu ấu trùng trong các trại giống Cũng có trường hợp bệnh xảy ra kèm theo một số dấu hiệu khác trong các ao nuôi tôm như: tôm bị bệnh thường bẩn mình, bẩn mang, có màu hồng đỏ trên cơ thể, yếu, bỏ ăn rồi chết Hiện tượng chết có thể xảy ra khi bệnh ở mức độ cấp tính Nếu mãn tính có thể gây chậm lớn, phân đàn,

mềm vỏ,… Có nhiều loại vi khuẩn được phân lập từ bệnh này: Vibrio alginolyticus, V

parahaemolyticus, V ordali,…

- Các loài Vibrio alginolyticus, V harveyi, V parahaemolyticus, V anguillarum và

V owensii DY05 là những các tác nhân gây bệnh ở tôm hùm, đặc biệt là tỷ lệ gây chết

cao ở ấu trùng tôm hùm (Shields, 2011; Goulden et al., 2012)

Tác dụng cuối liên quan đến dịch chiết từ chế phẩm probiotic có hoạt chất sinh học, như acid amin, các enzyme, các nucleotit, các acid nucleic, các vitamin, đặc biệt

là biotin Các hoạt chất này có liên quan đến khả năng đổi mới tế bào cơ thể, làm tăng kháng thể và khả năng miễn dịch… cũng có thể làm chậm quá trình lão hóa, làm tăng sức đề kháng chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh

b Trong chăn nuôi

Probiotic giúp hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi phát triển bình thường, tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn Đối với gia súc chế phẩm này giúp cho hệ vi sinh vật trong dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn Hơn nữa, probiotic có tác dụng làm tăng sức khỏe vật nuôi, tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi cho vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh

thường gặp, nhất là bệnh ỉa phân trắng (Huang và cs, 2004) Một số nghiên cứu khác

cho thấy, probiotic làm cho gia súc gia cầm cái mắn đẻ hơn, tăng chất lượng thịt, tăng năng suất chăn nuôi (Fuller, 1998) Cuối cùng, chế phẩm này làm ức chế và có thể tiêu diệt được các vi sinh vật có hại, làm giảm hoặc làm mất mùi hôi thối ô nhiễm chuồng

trại chăn nuôi (Võ Thị Hạnh và cs, 2005)

Vì vậy, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nước uống cho vật nuôi đều có tác dụng dương tính Dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơ thể con vật như chó, lợn… sẽ mất mùi thối, phun trực tiếp vào bầu vú con cái thì khi cho con

bú sẽ tránh bị nhiễm khuẩn có hại (Lương Đức Phẩm, 1998)

c Trong bảo vệ môi trường

Các vi sinh vật của chế phẩm probiotic, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic và

nhóm vi khuẩn Bacillus có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh đường ruột, như

Samonella, Vibrio, Shigella Ngoài ra, axit lactic tạo thành có tác dụng làm sạch ruột,

làm cơ chất dinh dưỡng rất tốt cho động vật tiêu hóa Các hoạt chất kháng sinh do các

vi khuẩn này sinh ra đều có khả năng ức chế sinh trưởng của các vi sinh vật gây hại

Nhóm vi khuẩn Bacillus là các vi khuẩn sống hiếu khí tùy tiện và có khả năng

sinh ra các enzyme thủy phân ngoại bào Vì vậy, khi vào môi trường nuôi thủy sản chúng có thể sinh sản rất mạnh, ngoài khả năng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh phát triển, chúng còn phân hủy các chất hữu cơ do thức ăn thừa và phân của vật nuôi bài tiết… để làm giảm thiểu ô nhiễm (Lương Đức Phẩm, 1998)

Trong quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ ta thấy xuất hiện khí H2S và các khí thối khác là dẫn xuất của khí này Trong probiotic có vi khuẩn tía có khả năng sử dụng khí H2S làm thức ăn, mùi hôi thối giảm đi rõ rệt Đồng thời các nấm men trong chế phẩm có khả năng lên men rượu từ đường có trong môi trường, tạo mùi thơm, cải thiện mùi cho môi trường và nâng cao hệ số tiêu hóa của thức ăn cho vật nuôi

Tác dụng của chế phẩm trong bảo vệ môi trường được thể hiện rất đa dạng:

- Khi phun chế phẩm vào những chỗ có mùi hôi thối như cống, rãnh, hố xí, đống rác thải, chuồng trại chăn nuôi, cũng như vật nuôi đều có tác dụng làm mất mùi hoặc giảm mùi rõ rệt, giảm số lượng ruồi nhặng và các loại côn trùng so với trước khi

sử dụng chế phẩm

- Đối với các đống rác ngoài tác dụng làm giảm hoặc mất mùi hôi thối còn có hiện tượng thể tích giảm nhanh là do các vi sinh vật trong chế phẩm tiết ra hệ enzyme

thủy phân các chất hữu cơ Đó là các nhóm enzyme amylase, protease, cellulase và đặc biệt là cellulase, hemicellulase làm tạo mùn nhanh chóng hơn

- Phun chế phẩm vào kho bảo quản nông sản có tác dụng ngăn chặn được quá trình thối rữa

- Cho vật nuôi uống chế phẩm đều tốt, giảm mùi hôi thối của phân

- Với môi trường nước nuôi tôm, cá khi dùng chế phẩm nước ao đầm có pH thay đổi từ từ hoặc thay đổi không quá đột ngột Các chỉ số BOD, COD cũng vậy, hàm lượng NH3 và H2S thường không quá giới hạn cho phép thì thời gian thay nước sẽ kéo dài hơn Điều quan trọng hơn cả là vật nuôi khỏe hơn, tăng trọng nhanh hơn và chi phí thức ăn cho một đơn vị tăng trọng giảm (Lương Đức Phẩm, 1998)

1.2.4.2 Trong nuôi trồng thủy sản

Ngoài ra, sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản giúp phân hủy các chất hữu cơ trong nước (chất hữu cơ là một trong nhiều nguyên nhân làm môi trường nước

bị ô nhiễm), hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy, giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH3, H2S… phát sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước, giúp tôm cá phát triển tốt, nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (do kích thích tôm, cá sản sinh ra kháng thể) Hơn nữa chế phẩm probiotic sẽ

ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật có lợi

sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại) Trong môi trường nước, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế được mầm bệnh phát triển để gây bệnh cho tôm cá Đồng thời chế phẩm probiotic giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, do đó sẽ giảm chi phí thay nước Cuối cùng, chế phẩm probiotic còn có tác dụng gián tiếp làm tăng oxy hòa tan trong nước, giúp tôm cá đủ oxy để thở, do đó tôm

cá sẽ khỏe mạnh, ít bệnh, ăn nhiều, mau lớn (Phạm Văn Ty và cs, 2007)

Bảng 1.2 Chế phẩm probiotic sử dụng trong nuôi tôm, cua, cá, sò và hiệu quả của chúng

Loài vi khuẩn Vật chủ Ảnh hưởng Tài liệu tham khảo

purpuratus

Crassostrea gigas

(Hàu)

Litopenaeus vannamei (Tôm thẻ

chân trắng)

Macrobrachium rosenbergii (Tôm

Scophthalmus maximus

Scophthalmus

Tăng tỷ lệ sống

Thúc đẩy phát triển

Tăng tỷ lệ sống

Tăng tốc độ sinh trưởng

Giảm tỷ lệ chết bởi tác nhân virut gây bệnh

Tăng tỷ lệ sống của ấu trùng cua

Tăng khả năng phát triển của ấu trùng cá bơn Giảm tỷ lệ chết

Ruiz-Ponte et al

(1999) Avendano &

Riquelme (1999)

Riquelme et al

(2001) Douillet &

Scophthalmus maximus

Scophthalmus maximus Gadus morhua (cá

tuyết)

Hippoglossus hippoglossus Centropomus undecimalis Pollachius

pollachius

Sparus auratu (Cá

vền)

Amphiprion Percula (Cá hề)

Tăng tỷ lệ sống

Tăng tỷ lệ sống

Tăng tỷ lệ sống Tăng tỷ lệ sống Tăng tỷ lệ sống

Giảm Vibro spp

Tăng khả năng phát triển của ấu trùng

Maeda et al (1997)

Vine (2004)

1.3 Tình hình nghiên cứu về sản xuất chế phẩm probiotic trong lĩnh vực nuôi tôm

1.3.1 Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic

Gần đây, một số quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đã được công bố

(Nguyễn Liêu Ba, 2003; Jans, 2005; Yadav và cs, 2009; Lương Hùng Tiến và cs,

2010 Tuy nhiên việc sản xuất chế phẩm probiotic dạng nước hoặc dạng khô bằng

phương pháp sấy phun cho tỷ lệ sống của vi khuẩn sau khi bảo quản là rất thấp Hơn nữa, việc sử dụng phương pháp sấy phun chỉ phù hợp với những chủng vi sinh vật có khả năng sinh bào tử Để khắc phục những nhược điểm này ta có thể tiến hành sản xuất chế phẩm probiotic bằng phương pháp đông khô

Dựa trên cơ sở của sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm probiotic (Jans, 2005), ta cần phải thực hiện các bước như sau: Lựa chọn các chủng vi sinh vật → xác định môi trường lên men → lên men → ly tâm → sấy khô → bổ sung chất bảo quản → phối trộn → kiểm soát chất lượng → đóng gói

- Lựa chọn các chủng vi sinh vật

Vi sinh vật được lựa chọn cho việc sản xuất các chế phẩm sinh học là kết quả của một quá trình lựa chọn cẩn thận Chúng được phân lập từ môi trường tự nhiên Sau đó, được kiểm tra và lựa chọn để phù hợp với việc bổ sung vào hệ tiêu hóa của động vật

- Xác định môi trường lên men

Khả năng lên men của chủng vi sinh vật cũng được ki ểm tra , bao gồm thành phần các cơ chất cho quá trình lên men và các chất chuyển hóa Ngoài ra, tỷ lệ sống và hiệu quả, ảnh hưởng đến hệ tiêu hóa cũng được kiểm tra làm cơ sở cho việc lựa chọn chủng probiotic

- Lên men

Sản xuất si nh khối bằng cách lên men , tất cả các nguyên liệu sử dụng được kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt Việc bổ sung chất dinh dưỡng , các thông số cho quá trình lên men luôn được theo dõi, giám sát chặt chẽ

- Bổ sung chất bảo quản

Công đoạn này giúp tăng thời gian bảo quản vi sinh vật trong một số sản phẩm Chất này sẽ giúp tăng khả sống sót của vi sinh vật , giúp nâng cao tính ổn định của sản phẩm

- Kiểm soát chất lượng

Kiểm soát chất lượng được thực hiện trong quá trình sản xuất và sản phẩm cuối cùng Nó bao gồm quá trình kiểm tra độ thuần khiết của chủng vi sinh vật , phân tích các chất không mong muốn (ví dụ độc tố nấm mốc và kim loại nặng) Vi sinh vật được kiểm tra tính an toàn không gây bất kỳ nguy hiểm cho sức khỏe động vật ngay cả trong trường hợp sử dụng quá liều Ngoài ra, chế phẩm còn được kiểm tra tính an toàn với con người và môi trường, đảm bảo không gây ảnh hưởng tiêu cực nào

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Ngày nay probiotic được sử dụng khá hiệu quả để phòng bệnh Nhiều vi sinh được sử dụng để sản xuất ra các chế phẩm nhằm kiểm soát côn trùng gây hại cho cây

trồng như vi khuẩn Bacillus thuringiensis, nấm Beauveria bassiana, Metarrhizium

anisopliae, Ngoài ra các chế phẩm vi sinh còn được sử dụng để làm phân bón vi sinh

nhằm phân giải các chất hữu cơ làm giàu cho đất Các chế phẩm vi sinh sử dụng trong các hệ thống xử lý rác thải và nước thải Nhưng việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi thủy sản vẫn còn là vấn đề khá mới Các chế phẩm sử dụng trong nuôi thủy sản hiện nay có thể chia làm 3 loại Các chế phẩm có tính chất probiotic gồm những vi

sinh vật sống như các vi khuẩn thuộc giống Bacillus, Lactobacillus, Saccharomyces…

người ta thường trộn vào thức ăn Nhóm thứ hai gồm các vi sinh vật có tính đối kháng

hoặc cạnh tranh thức ăn với vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn Bacillus licheniformis,

Bacillus sp., Vibrio alginolyticus… Nhóm thứ 3 gồm các vi sinh vật cải thiện chất

lượng môi trường như vi khuẩn Nitrosomonas, Nitrobacter, Actinomyces, các loài

Bacillus khác nhau, các loại tảo, các vi khuẩn tía không lưu huỳnh như Rhodobacter

sp., Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas palutris,

Rhodomicrobium vanniell, các loại nấm Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Rhizopus sp.,… Tuy nhiên có nhiều chủng vi sinh vật thực hiện được nhiều chức năng

khác nhau nên ranh giới giữa 3 nhóm này đôi khi không được phân chia rõ ràng, vì vậy ngày nay nhiều người gọi chung các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nuôi thủy sản là probiotic (Maqsood, 2010)

Đã có nhiều dẫn liệu trên thế giới cho thấy đã ứng dụng chế phẩm probiotic vào trong việc nuôi tôm như: Griffith (1995) thông báo nhờ việc đưa probiotic vào nuôi tôm giống ở Ecuador trong năm 1992, mà các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ

để làm vệ sinh ở các bể nuôi từ 7 ngày trong một tháng đến 21 ngày trong một năm, sản lượng tôm giống tăng 35%, và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn đến 94%

Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm sinh học trong nuôi

tôm, đặc biệt ở Thái Lan Jiravanichpaisal và cộng sự (1997), đã sử dụng Lactobacillus

sp trong nuôi tôm sú Ở Trung Quốc, nghiên cứu probiotic trong nuôi thủy sản được tập trung vào vi khuẩn quang hợp Zhenguo và cộng sự (1992) nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng cho tôm bằng cách cho vào thức ăn hoặc cho vào nước nuôi tôm cho thấy có sự gia tăng khả năng phát triển của tôm, loại trừ nhanh chóng NH3-N,

H2S, acid hữu cơ và những chất có hại, cải thiện chất lượng nước, cân bằng độ pH Zhermant và cộng sự (1997), cho biết khi nuôi chủng vi khuẩn probiotic trong bể với

ấu trùng tôm Litopenaeus vannamei với mật độ 103

CFU/ml thì đã ngăn cản được sự xâm nhiễm các vi khuẩn gây bệnh ngay ở nồng độ 107

sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh khác, đặc biệt là Vibrio spp Từ đó, tỷ lệ sống của

ấu trùng cua đã tăng lên rất nhiều bởi việc bổ sung các vi khuẩn probiotic vào môi trường nước nuôi Họ cũng cho rằng các vi khuẩn có thể cải thiện tình trạng sinh lý của ấu trùng cua bằng cách như là một nguồn dinh dưỡng cung cấp trong quá trình tăng trưởng của nó (Maqsood, 2010)

Garriques và Arevalo (1995), báo cáo rằng việc sử dụng của V alginolyticus

làm probiotic có thể làm tăng tỷ lệ sống và tăng trưởng tôm Thẻ chân trắng do vi khuẩn gây bệnh không có khả năng cạnh tranh, và có thể làm giảm hoặc loại bỏ sự cần thiết phải dự phòng điều trị kháng sinh trong hệ thống nuôi thâm canh ấu trùng Họ tin

rằng trong tự nhiên một tỷ lệ rất nhỏ của vi khuẩn Vibrio sp là thật sự gây bệnh Trong nghiên cứu, việc bổ sung các vi khuẩn V alginolyticus dẫn đến tăng tỷ lệ sống và mức

độ tăng trưởng

Jiravanichpaisal và cộng sự (1997), báo cáo việc sử dụng Lactobacillus sp

như là các vi khuẩn probiotic ở tôm sú giúp điều trị chống các bệnh đốm trắng và điều tra sự tăng trưởng của một số vi khuẩn probiotic, và sự sống của chúng trong nước

biển trong vòng 7 ngày Khả năng ức chế hoạt động của Lactobacillus sp đối với hoạt động của vi khuẩn Vibrio sp., E coli, Staphylococcus sp., đã được xác định

Moriarty (1999), đã báo cáo thử nghiệm thành công vi khuẩn probiotic thay vì dùng kháng sinh để kiểm soát phẩy khuẩn trong các trang trại tôm ở Negros,

Philippine Các tác dụng của ozon và probiotic vào sự sống còn của tôm sú (Penaeus

monodon) đã được ghi lại bởi Meunpol và cộng sự (2003)

Rengpipat và cộng sự (2000), đã nghiên cứu về việc sử dụng Bacillus spp để

tăng sức đề kháng của tôm sú Trong một thử nghiệm khác cũng đã được thực hiện bởi

Rengpipat và cộng sự (2003), về sự tăng trưởng và khả năng chống vi khuẩn Vibrio trên tôm sú (P monodon) được cho ăn Bacillus sp S11 Có thể thấy rằng tốc độ tăng

trưởng và tỷ lệ sống của tôm nuôi được bổ sung probiotic cao hơn đáng kể hơn so với khi không bổ sung probiotic vào thức ăn nuôi tôm (Farzanfar, 2006)

Tuy nhiên, do kết quả của sự tích tụ các chất thải từ quá trình trao đổi chất của sinh vật nuôi cấy, phân hủy thức ăn chưa sử dụng và phân hủy của vật liệu sinh học

(Prabhu et al., 1999) Lúc này, các ứng dụng của một nhóm vi sinh vật có lợi như

Lactobacillus, Bacillus, Nitrosomonas, Cellulomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Rhodoseudomonas, Nitrosomonas và Acinetobacter sẽ rất hữu ích cho việc kiểm soát

các vi sinh vật gây bệnh và chất lượng nước (Prabhu et al., 1999; Shariff et al., 2001;

Irianto và Austin, 2002)

Có nhiều báo cáo khác về những lợi thế của việc sử dụng vi khuẩn Gram dương trong nuôi trồng thủy sản Theo Irianto và Austin (2002), probiotic kích thích miễn

dịch của vật chủ bằng cách tăng số lượng hồng cầu, đại thực bào và tế bào lympho, họ

báo cáo rằng cho ăn với chế phẩm sinh học Gram dương và Gram âm ở 107 CFU/g thức ăn dẫn đến việc kích thích sự gia tăng số lượng hồng cầu, đại thực bào và tế bào lympho, và hoạt động của lysozyme tăng cường trong vòng 2 tuần cho ăn với chế phẩm sinh học

Việc lạm dụng kháng sinh trong cả hai ngành y học và nông nghiệp dẫn đến sự xuất hiện và lây lan của vi khuẩn kháng thuốc Vi khuẩn kháng kháng sinh đang gia tăng (Khachatourions, 1998) Sự gia tăng các mối lo âu về vi sinh vật kháng thuốc đã

dẫn đến đề xuất của thay thế các phương pháp phòng bệnh, chẳng hạn như vi khuẩn probiotic (Vaseeharan, Ramasamy, 2003)

Vibrio spp., đặc biệt là V harveyi là những vi khuẩn chính liên quan đến các

mầm bệnh ở tôm Thuốc kháng sinh như chloramphenicol, oxytetracycline, furazolidone và streptomycine đã được sử dụng để kiểm soát các vi khuẩn, nhưng cho hiệu quả rất thấp Clo được dùng rộng rãi trong các trại sản xuất giống để giết các động vật phù du trước khi thả tôm giống, nhưng sử dụng nó lại kích thích sự phát triển

của nhiều gen kháng kháng sinh của vi khuẩn Làm gia tăng nhanh chóng số lượng V

harveyi, bởi vì clo làm giảm số lượng các đối thủ cạnh tranh, tiêu diệt tảo, do đó tăng

nguồn thức ăn cho V harveyi Nếu kháng sinh hoặc thuốc khử trùng được sử dụng để

diệt vi khuẩn, một số vi khuẩn sẽ tồn tại, bởi vì chúng mang gen kháng Và sau đó sẽ phát triển nhanh chóng bởi vì đối thủ cạnh tranh của chúng được loại bỏ (Moriarty, 1999) Do một số vấn đề và hạn chế trong việc sử dụng nội tiết tố và thuốc kháng sinh cho động vật và người tiêu dùng, vi khuẩn probiotic là một ứng cử viên tốt để cải thiện việc tiêu hóa các chất dinh dưỡng và tăng trưởng của động vật thủy sản (Irianto,

Austin, 2002; Lara-Flores et al., 2003)

Rengpipat và cộng sự (2000) cho rằng việc sử dụng vi khuẩn Bacillus sp S11

giúp bảo vệ bệnh bằng cách kích hoạt cả hai hệ thống miễn dịch (miễn dịch tế bào và

miễn dịch dịch thể) ở tôm sú (P monodon) Balca'zar (2003), đã chứng minh rằng một hỗn hợp của các chủng vi khuẩn (Bacillus và Vibrios sp.) ảnh hưởng tích cực đến tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm, bảo vệ chống lại các mầm bệnh do vi khuẩn Vibrio

harveyi và hội chứng virus đốm trắng Tác dụng bảo vệ này là do kích thích hệ thống

miễn dịch, bằng cách tăng thực bào và hoạt tính kháng khuẩn

Sự sinh trưởng của V harveyi gây bệnh đã được kiểm soát bởi các tác dụng probiotic của Bacillus subtilis BT23 trong điều kiện in vitro và in vivo Khi tôm sú được bổ sung với B subtilis BT23, được phân lập từ các ao nuôi tôm, với mật độ của

83, 60 và 58% Phân tích mô học sau khi các thử nghiệm đã xác nhận rằng các chủng

probiotic không có tác dụng gây bệnh trên vật chủ (Gullian et al., 2004)

Vibrio owensii là loài vi khuẩn mới được công bố gần đây (Cano-Gómez et al.,

2010) và chủng V owensii DY05 đã được chỉ ra là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên

ấu trùng tôm hùm bông ở Australia (Goulden et al., 2012a) Trong một nghiên cứu mới

đây, Goulden và cộng sự (2012b) đã tuyển chọn được các chủng probiotic (Vibrio sp PP05 và Pseudoalteromonas sp PP107) có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với chủng

DY05 và cho thấy chúng có khả năng bảo vệ ấu trùng tôm hùm bông sau khi lây nhiễm với DY05

Từ thực tế cho thấy vấn đề nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic rất được quan tâm nghiên cứu Để sản xuất được chế phẩm probiotic cần phải dựa trên các tiêu chuẩn vi sinh vật, khả năng tồn tại của vi sinh vật trong quá trình chế biến và việc bảo quản sản phẩm Các yếu tố công nghệ trong sản xuất probiotic đóng một vai trò rất lớn, như: Công nghệ lên men đóng vai trò quan trọng vì sự phát triển của vi sinh vật phụ thuộc vào thành phần chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy, khuấy đảo… Ngoài ra còn có tác động của nhiệt độ trong công nghệ sấy khô hoặc đông khô làm ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi khuẩn Do đó nghiên cứu công nghệ sản xuất phù hợp đóng vai trò quan trọng trong sản xuất chế phẩm probiotic

Để sản xuất được chế phẩm probiotic, đầu tiên người ta cần phải chọn được chủng vi sinh vật phù hợp Các vi sinh vật này phải được công nhận là GRAS (vi sinh vật an toàn), các vi sinh vật cần phải có khả năng tồn tại trong vật chủ như chịu được

pH, điều kiện muối mật… Ngoài ra các vi sinh vật này còn phải có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch, có thể sản sinh các chất kháng khuẩn như bacteriocin và khả năng sống sót của vi khuẩn này trong quá trình chế biến (Kosin, Rakshit, 2006)

Quá trình lên men ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả sản xuất probiotic do đó người ta đặc biệt quan tâm đến các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Ngoài các yếu tố như nhiệt độ, pH, thời gian lên men thích hợp người ta còn quan tâm đến môi trường nuôi cấy vì môi trường nuôi cấy không chỉ ảnh hưởng đến khả năng lên men

mà còn ảnh hưởng đến sự tồn tại của vi khuẩn probiotic sau này Ví dụ có các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến các chủng vi khuẩn probiotic ảnh

hưởng của môi trường đến vi khuẩn Lactobacillus của Siaterlis và cộng sự (2009) Kỹ

thuật lên men đối với sản xuất probiotic của Lacroix và Yildirim (2007), để làm tăng khả năng sản xuất thương mại và ứng dụng của chế phẩm probiotic

Để thuận lợi cho quá trình bảo quản cũng như sử dụng người ta sử dụng phương pháp đông khô để sản xuất chế phẩm probiotic Với phương pháp này cho thấy khả năng sống sót là cao nhất Để tăng khả năng sống sót của những vi khuẩn probiotic người ta thường bổ sung các chất chống đông để làm tăng hiệu quả của quá trình đông khô như là nghiên cứu của Siaterlis và cộng sự (2009), về ảnh hưởng của chất chống

đông đến sự sống sót của Lactobacillus sau khi đông khô Ngoài ra người ta có thể

dùng phương pháp sấy phun để sản xuất probiotic Nghiên cứu của Yadav và cộng sự

(2009) đã nâng cao tỷ lệ sống của Bacillus coagulans sau khi sấy phun với lactate

canxi

Mặc dù đã có các công trình nghiên cứu sản xuất probiotic cho động vật thủy sản nhưng hiện nay vấn đề nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic vẫn tiếp tục đang được đầu tư nghiên cứu để xây dựng quy trình sản xuất thương mại Những nghiên cứu về chế phẩm probiotic cho tôm hùm còn rất hạn chế

1.3.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về sản xuất các chế phẩm sinh học để cải thiện môi trường nuôi tôm hoặc tác dụng của probiotic trong việc nuôi tôm nhưng còn tương đối ít Trong những năm gần đây Bộ Thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh, nhiều nơi đã làm quen với với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và cho kết quả khá tốt

Các nghiên cứu sản xuất thành công chế phẩm probiotic như: Nghiên cứu tạo chế phẩm Bioche và đánh giá tác dụng của chế phẩm đến môi trường nước nuôi tôm

cá, cũng như nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus spp và

Lactobacillus spp có khả năng ứng dụng để xử lý môi trường nuôi tôm cá của Nguyễn

Liêu Ba (2003)

Nghiên cứu sản xuất thành công chế phẩm BIOII dùng trong nuôi trồng thủy sản của Võ Thị Hạnh và cộng sự (2003) Chế phẩm BIO II có tác dụng: phân hủy những thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao, ổn định pH và màu nước ao, kìm hãm sự

tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh cho tôm, cá như các vi khuẩn Vibrio spp.,

tăng năng suất nuôi trồng

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic từ Lactobacillus fermentumha 6 bằng

phương pháp sấy phun của Lương Hùng Tiến và cộng sự (2010)

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thủy (2009), ở Viện nuôi trồng thủy sản 3, Nha Trang, đã chỉ ra hiệu quả của probiotic trong nuôi tôm hùm gai tại Cam Ranh, Khánh Hòa Lợi ích của probiotic được thêm vào thức ăn chăn nuôi được được đánh giá Các phương pháp điều trị bao gồm bổ sung Sanolife probiotic ở 4g/kg thức ăn hoặc 8 g/kg thức ăn Thức ăn, đã được pha trộn với các chế phẩm sinh học một giờ trước khi ăn để đảm bảo được bao bọc probiotic trên thức ăn Con vật được cho ăn một lần mỗi ngày vào buổi sáng Mỗi lần điều trị bao gồm 2 lồng (1,8 × 1,9 × 1,2 m), mỗi

lồng thả 4 con tôm hùm (Panulirus ornatus - trọng lượng trung bình 867 g), đã được

ngập nước ở độ sâu 5 m Lồng được đặt tại Cam Ranh (Khánh Hòa, Việt Nam) Mẫu máu được lấy trước khi thả giống và sau đó tại một khoảng 30 ngày để xác định các tác nhân gây bệnh khác nhau Tốc độ tăng trưởng và lượng thức ăn của tôm được theo dõi trong thời gian thử nghiệm kéo dài 6 tháng

Nói tóm lại, tuy đã có những nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản nhưng còn rất hạn chế và nhất là vấn đề nghiên cứu sản xuất probiotic trong nuôi tôm hùm lồng vẫn chưa được nghiên cứu ở Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Chủng chuẩn sinh protease Bacillus sp L5’ được lấy từ bộ sưu tập chủng của

Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

- Các chủng Bacillus spp (B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1, B3.7.4, L5’) được nuôi cấy trên môi trường TSB, pH 7,3 ± 0,2, lắc 180 vòng/phút

- Các chủng Vibrio spp (V1.1, V3.3) được lấy từ bộ sưu tập chủng của Viện

Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

- Chủng Vibrio owensii DY05 là chủng vi khuẩn đã được chứng minh gây bệnh trên ấu trùng tôm hùm bông (Goulden et al., 2012a), được cung cấp từ Viện Hải dương

học Australia (AIMS)

- Các chủng Vibrio (V1.1; V3.3; DYO5) được nuôi cấy trên môi trường TCBS

hoặc TSB, bổ sung 1,5% NaCl, lắc 180 vòng/ phút

2.1.2 Thức ăn tôm hùm và dầu mực

Thức ăn tôm hùm được sản xuất theo công thức của Lại Văn Hùng (2007) – Trường Đại học Nha Trang

Dầu mực được cung cấp bởi công ty quốc tế Hải Mã

2.1.3 Hóa chất, môi trường

a) Môi trường tăng sinh APW (Alkaline Peptone Water)

Pepton : 10 g Natri clorua (NaCl) : 30 g

Nước cất : 1 l pH = 8,5 ± 0,2

b) Môi trường nuôi cấy TSB (Trypton Soy Broth)

Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton: 3 g NaCl: 5 g K2HPO4: 2,5 g Glucose: 2,5 g Nước cất: 1 l