2.1.1. Chủng vi sinh vật
- Chủng Bacillus spp. (B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1, B3.7.4) đƣợc phân lập từ tôm hùm bông lấy từ bộ sƣu tập chủng của Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang.
- Chủng chuẩn sinh protease Bacillus sp. L5’ đƣợc lấy từ bộ sƣu tập chủng của Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang.
- Các chủng Bacillus spp. (B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1, B3.7.4, L5’) đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng TSB, pH 7,3 ± 0,2, lắc 180 vòng/phút.
- Các chủng Vibrio spp. (V1.1, V3.3) đƣợc lấy từ bộ sƣu tập chủng của Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang.
- Chủng Vibrio owensii DY05 là chủng vi khuẩn đã đƣợc chứng minh gây bệnh trên ấu trùng tôm hùm bông (Goulden et al., 2012a), đƣợc cung cấp từ Viện Hải dƣơng học Australia (AIMS).
- Các chủng Vibrio (V1.1; V3.3; DYO5) đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng TCBS hoặc TSB, bổ sung 1,5% NaCl, lắc 180 vòng/ phút.
2.1.2. Thức ăn tôm hùm và dầu mực
Thức ăn tôm hùm đƣợc sản xuất theo công thức của Lại Văn Hùng (2007) – Trƣờng Đại học Nha Trang.
Dầu mực đƣợc cung cấp bởi công ty quốc tế Hải Mã
2.1.3. Hóa chất, môi trƣờng
a) Môi trƣờng tăng sinh APW (Alkaline Peptone Water) Pepton : 10 g Natri clorua (NaCl) : 30 g Nƣớc cất : 1 l pH = 8,5 ± 0,2
b) Môi trƣờng nuôi cấy TSB (Trypton Soy Broth)
Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton: 3 g NaCl: 5 g K2HPO4: 2,5 g Glucose: 2,5 g Nƣớc cất: 1 l
pH (ở 250
C) 7,3 ± 0,2
c) Môi trƣờng rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số TSA (Trypton soy agar) TSB: 30 g
Agar: 15÷20 g Nƣớc: 1l
d) Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật LB (Lauria Broth)
Trypton: 10 g; Cao nấm men: 5 g; Natri clorua (NaCl): 30 g; Nƣớc cất: 1 l pH = 7 ± 0,2
e) Dung dịch nƣớc muối sinh lý NaCl: 8,5 g
Nƣớc cất: 1 l
f) Thuốc nhuộm Crytal Violet Tím violet: 1 g
Rƣợu ethylic: 1 g Phenol tinh thể : 2 g Nƣớc cất: 100 ml g) Thuốc nhuộm Lugol
Iod tinh thể : 1 g
KI : 2 g
Nƣớc cất : 200 ml h) Thuốc nhuộm Fuchsin
Fuschin kiềm : 1 g Rƣợu ethylic 95% : 10 ml Phenol tinh thể : 5 g Nƣớc cất : 100 ml i) Chất chống đông
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng
- Cân phân tích (Shimadzu, Nhật). - Máy ly tâm (Ependof Mikro120, Đức).
- Máy ly tâm lạnh ống nhỏ (Mega 17R Labkorea, Hàn Quốc). - Máy ly tâm thể tích lớn (Labkorea, Hàn Quốc).
- Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam).
- Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ).
- Máy định lƣợng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV/VIS) (Carry 100 Bio, Úc).
- Máy lắc vòng (GFL 3005, Đức). - Máy lắc ngang (Labkorea, Hàn Quốc).
- Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha). - Tủ sấy (Binder, Đức).
- Nồi hấp thanh trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan). - Lò vi sóng (Panasonic, Hàn Quốc).
- Thiết bị lên men BioFlo 110. - Máy đông khô Telstar LyoBeta 35. - Tủ ấm.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định hoạt tính sinh protease
Xác định theo phƣơng pháp đo đƣờng kính phân giải casein . Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy lắc 180 vòng/phút ở 300C trong môi trƣờng dịch thể, sau 24h tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch enzyme nhỏ vào lỗ thạch đã khoan trên đĩa petri chứa môi trƣờng cơ chất. Để vào tủ ấm 300
C sau 24 h xác định vòng phân giải.
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo công thức:H D d, trong đó D: đƣờng kính vòng phân giải + đƣờng kính lỗ khoan, d: đƣờng kính lỗ khoan.
2.2.2. Xác định hoạt tính kháng Vibrio spp. gây bệnh trên tôm hùm
Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán thạch đĩa (Chythanya et al., 2002) để đánh giá khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn mới phân lập đƣợc. Từ môi trƣờng giữ giống, các chủng vi khuẩn đã phân lập đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng TSB, bổ sung 1,5% NaCl, trong 14 - 16 h. Sau đó dịch nuôi cấy ở mật độ tế bào khoảng 105
CFU/ml thì đem ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C, thu dịch nổi. Lấy 80 μl dung dịch này nhỏ vào mỗi giếng của đĩa thạch đã trang đều vi khuẩn chỉ thị (Vibrio sp. V1.1 hoặc Vibrio sp. V3.3 hoặc Vibrio owensii DY05) sau khi nuôi tới mật độ 104
CFU/ml. Sau đó, đĩa đƣợc ủ ở 370C trong 24 - 48 h và xác định đƣờng kính vòng kháng khuẩn (Ravi et al, 2007).
2.2.3. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ đĩa thạch hòa vào một giọt nƣớc cất trên phiến kính, để khô tự nhiên. Sau đó cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành nhuộm bằng crytal violet trong 30 giây, rửa với nƣớc cất. Tiếp tục nhỏ dung dịch lugol, để 30 giây rồi rửa bằng nƣớc cất, thấm khô. Tẩy bằng cồn 960
trong 1 giây và rửa lại bằng nƣớc cất sau đó nhuộm dung dịch fuschin lên lam kính trong 1 phút, đổ bỏ dung dịch và rửa qua nƣớc. Để khô tự nhiên, soi vật kính dầu. Khảo sát hình thái tế bào và tính chất bắt màu của vi khuẩn dƣới kính hiển vi với vật kính dầu X-100. Vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin, vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím của violet.
2.2.4. Định danh vi khuẩn Bacillus
Các chủng Bacillus đƣợc định danh bằng bộ kít hóa sinh API 50CHB
(BioMérieux, Pháp) dựa trên 49 phản ứng lên men đƣờng và 12 thử nghiệm hoạt tính enzyme theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm apiweb (BioMérieux, Pháp).
2.2.5. Xác định khả năng sinh trƣởng
Để đánh giá khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn cũng nhƣ khả năng tích lũy sinh khối ta sử dụng phƣơng pháp đo mật độ quang (OD). Các thí nghiệm đƣợc thực hiện ở bƣớc sóng 540 nm.
- Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi
hiện diện trong môi trƣờng cũng làm môi trƣờng trở nên đục. Giá trị OD (optical density, mật độ quang) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trƣởng càng mạnh. Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn thông qua đo độ đục bằng máy so màu.
- Cách tiến hành: Đo độ đục của dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng máy quang phổ. Cho môi trƣờng vào cuvet số 1 làm đối chứng, cho vào máy đo OD ở 540 nm, đƣa về giá trị bằng 0. Lấy dịch nuôi cấy vi khuẩn cho vào cuvet số 2 và cho vào máy đo, đọc kết quả hiện trên màn hình.
2.2.6. Nuôi cấy và thu sinh khối probiotic
Nhân giống – lên men: Các chủng vi khuẩn probiotic đƣợc nuôi cấy độc lập trên các môi trƣờng dinh dƣỡng phù hợp với điều kiện nhiệt độ, pH, sục khí, khuấy trộn tối ƣu cho từng chủng. Lên men đƣợc tiến hành ở 2 mức độ: quy mô phòng thí nghiệm đƣợc thực hiện trong bình tam giác 100ml và quy mô công nghiệp đƣợc trong thiết bị BioFlo 110 (10 lít).
Ly tâm thu sinh khối: sau quá trình tăng sinh, sinh khối tế bào đƣợc thu hồi qua quá trình ly tâm bằng máy ly tâm liên tục với tốc độ ly tâm trong khoảng 6000-8000 vòng/phút. Hệ thống ly tâm liên tục do Đức sản xuất là hệ thống mới tại Việt Nam cho phép ly tâm và hạn chế tối đa việc nhiễm khuẩn trong quá trình ly tâm mà các phƣơng pháp ly tâm theo mẻ hiện hành không thể khắc phục đƣợc. Sau khi ly tâm, sinh khối đƣợc rửa bằng nƣớc muối sinh lý ở nhiệt độ 4o
C.
2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp
Các chủng vi khuẩn nghiên cứu đƣợc nuôi trên môi trƣờng TSB tại pH 7,3 ở nhiệt độ 370
C. Để xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp, lần lƣợt các thông số: nguồn cacbon, nguồn nitơ, nồng độ muối, pH môi trƣờng và nhiệt độ đƣợc thay đổi trong khi các thông số còn lại đƣợc cố định và cải tiến dần. Sau 3 giờ nuôi, khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn đƣợc xác định bằng phép đo độ đục của dịch nuôi tại bƣớc sóng 540 nm (OD540) trên máy đo quang phổ Cary 100 Bio (Varian, Mỹ).
- Nguồn cacbon:
Các chủng probiotic đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng gồm các nguồn cacbon khác nhau: glucose, rỉ đƣờng, tinh bột bắp , tinh bột sắn , tại pH 7,3 lắc 180 vòng/phút. Lƣ̣a chọn nguồn cacbon thích hợp thông qua việc xác định khả năng sinh trƣởng.
Các chủng probiotic đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng gồm các nguồn nitơ khác nhau: bột mì, amoni sulfat, pepton, tại pH 7,3 lắc 180 vòng/phút. Lƣ̣a chọn nguồn nitơ thích hợp thông qua việc xác định khả năng sinh trƣởng.
- Nồng độ muối:
Các chủng probiotic đƣợc nuôi cấ y trên môi trƣờng TSB , lắc 180 vòng/phút, ở các nồng độ muối 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, tại pH 7,3. Lƣ̣a chọn nồng độ muối thích hợp thông qua việc xác định khả năng sinh trƣởng.
- pH môi trƣờng:
Các chủng probiotic đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng TSB, nồng độ muối 1%, lắc 180 vòng/phút, tại các giá trị pH 5, 6, 7, 8, 9. Lƣ̣a chọn pH môi trƣờng thích hợp thông qua việc xác định khả năng sinh trƣởng.
- Nhiệt độ:
Các chủng probiotic đƣợc muôi c ấy trên môi trƣờng TSB , tại pH 8, lắc 180 vòng/phút, ở các nhiệt độ 310
, 340, 370, 400C, nhiệt độ phòng (280-310C). Lƣ̣a chọn nhiệt độ thích hợp thông qua xác định khả năng sinh trƣởng.
2.2.8. Bố trí thí nghiệm xây dựng quy trình lên men ở quy mô pilot
Chủng nghiên cứu có hoạt tính probiotic mạnh đƣợc chọn lên men ở thiết bị BioFlo 110 thể tích 10 lít. Chủng probiotic đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng TSB cải tiến chứa nguồn cacbon là rỉ đƣờng. Để xác định điều kiện lên men thích hợp, lần lƣợt các thông số: pH môi trƣờng, nhiệt độ và thời gian lên men đƣợc thay đổi trong khi các thông số còn lại đƣợc cố định và cải tiến dần. Khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn đƣợc xác định bằng phép đo độ đục của dịch nuôi tại bƣớc sóng 540 nm (OD540) trên máy đo quang phổ Cary 100 Bio (Varian, Mỹ).
- pH:
Môi trƣờng lên men gồm có : 20g/l pepton; 10g/l NaCl; 2,5g/l K2HPO4; 2,5g/l rỉ đƣờng. Dịch lên men đƣợc hấp khƣ̉ trùng ở 1210
C trong thời gian 15 phút. Tiến hành lên men ở nhiệt độ 280
C, tốc độ quấy đảo 180 vòng/phút, nồng độ muối 1% và các giá trị pH 6; 7; 8; 9, thời gian lên men là 3 giờ. Tƣ̀ đó lƣ̣a chọn đƣợc pH môi tr ƣờng thích hợp thông qua việc xác định khả năng sinh trƣởng.
- Nhiệt độ:
Môi trƣờng lên men gồm có: 20 g/l pepton; 10 g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4; 2,5 g/l rỉ đƣờng. Dịch lên men đƣợc hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút. Tiến
hành lên men ở nhiệt độ 280
C, tốc độ quấy đảo 180 vòng/phút, nồng độ muối 1%, pH 8 và các giá trị nhiệt độ 28; 31; 34; 37; 40, trong thời gian 3 giờ. Tƣ̀ đó lƣ̣a chọn đƣợc nhiệt độ thích hợp thông qua việc xác định khả năng sinh trƣởng.
- Thời gian:
Môi trƣờng lên men gồm có: 20 g/l pepton; 10 g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4; 2,5 g/l rỉ đƣờng. Dịch lên men đƣợc hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút. Tiến hành lên men ở nhiệt độ 340C, tốc độ quấy đảo 180 vòng/phút, nồng độ muối 1%, pH 8. Sau một giờ đồng hồ tiến hành thu dịch lên men đo độ đục ở OD540 . Tƣ̀ đó lƣ̣a chọn đƣợc thời gian thích hợp thông qua việc xác định khả năng sinh trƣởng.
2.2.9. Xác định các thông số của quá trình đông khô
Mục đích để xây dựng quy trình đông khô chế phẩm probiotic. a. Nguyên lý đông khô
Đầu tiên nguyên liệu đƣợc làm lạnh đông xuống nhiệt độ thấp hơn điểm đông (tùy loại sản phẩm). Sau khi làm đông, áp suất trong buồng giảm tới 1 giá trị làm thăng hoa nƣớc đá. Hơi nƣớc tạo bởi thăng hoa sẽ khuếch tán ra khỏi sản phẩm. Trong quá trình đông khô thì sản phẩm ở trong môi trƣờng áp suất chân không (nhỏ hơn 6,11 mBar) và hơi nƣớc bay ra từ sản phẩm sẽ đƣợc ngƣng tụ tại bề mặt của bộ ngƣng tụ.
Khoảng 90-99% lƣợng nƣớc đƣợc lấy ra từ sản phẩm trong quá trình đông khô chính. Lƣợng nƣớc bám dính còn lại sẽ đƣợc lấy ra trong quá trình đông khô cuối cùng dƣới điều kiện áp suất chân không rất thấp (Martin Christ, 2009).
Nếu áp suất khí quyển lớn hơn 6.11 mBar và cố định thì nƣớc sẽ tồn tại ở 3 trạng thái: lỏng, rắn và khí. Bằng việc thay đổi nhiệt độ: Tại áp suất chính xác 6.11 mBar và nhiệt độ 00C thì nƣớc sẽ tồn tại cả ở 3 trạng thái rắn, lỏng, khí. Nếu áp suất nhỏ hơn 6.11 mBar thì nƣớc sẽ chuyển trực tiếp từ rắn sang khí và ngƣợc lại bằng việc thay đổi nhiệt độ (quá trình chuyển trực tiếp từ rắn sang khí đƣợc gọi là quá trình thăng hoa).
b. Các bƣớc của quá trình đông khô
- Phase 1: Cấp đông
Điểm đông có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo nhiệt độ và điện trở trong phase làm đông tại điều kiện áp suất khí quyển. Điểm đông của sản phẩm là điểm cắt giữa nhiệt độ và điện trở. Điện trở của sản phẩm thay đổi khi chuyển từ trạng
thái lỏng sang trạng thái rắn. Nếu cấp đông trong các bình cố định thì chiều dày của lớp sản phẩm từ 1-2 cm. Vì nếu quá dày gây bất lợi cho thời gian sấy.
- Phase 2: Bơm chân không
Nếu sản phẩm đạt nhiệt độ đông khô và toàn bộ sản phẩm đã bị đông thì phase bơm chân không bắt đầu. Trong phase này bơm chân không chạy khởi động và nhiệt độ dàn ngƣng giảm xuống đến mức thấp nhất (thời gian chuẩn bị từ 15-30 phút). Trong phase chuẩn bị giá không đƣợc cấp nhiệt và khoang không có áp suất chân không, vì vậy van giữa bơm chân không và khoang phải đƣợc đóng.
- Phase 3: Làm khô cấp 1
Tại lúc bắt đầu giai đoạn làm khô cấp 1, áp suất sẽ giảm xuống tới áp suất chân không, van điều khiển áp suất giữa khoang và bơm chân không mở ra. Trong quá trình đông khô chính phải quan sát độ chân không và nhiệt độ dàn ngƣng. Nhiệt độ dàn ngƣng phải thấp hơn nhiệt độ tại sản phẩm khoảng 50
-150C trong toàn bộ quá trình. Áp suất chân không phải thấp hơn áp suất chân không an toàn. Để thăng hoa thì cần thiết phải cấp nhiệt cho sản phẩm qua giá, nhiệt độ của giá phải đƣợc tăng chậm từng bƣớc và lớn nhất tới nhiệt độ phòng. Nếu dùng các chai đáy tròn thì năng lƣợng nhiệt đƣợc cấp từ môi trƣờng.
Áp suất chân không: Nhiệt độ đông của sản phẩm là rất quan trọng để xác định độ chân không và nhiệt độ khô. Trong quá trình khô, nhiệt độ sản phẩm đƣợc điều chỉnh chủ yếu bởi áp suất chân không - theo áp suất bay hơi của nƣớc.
Trong quá trình khô thì phải đảm bảo sản phẩm không bị tan chảy, bởi vậy nhiệt độ khô nên thấp hơn ít nhất nhiệt độ đông 100C. Căn cứ vào nhiệt độ này ta dễ dàng tra đƣợc áp suất chân không khô theo bảng đƣờng cong áp suất bay hơi (Bảng PL.17).
Áp suất an toàn: Để sản phẩm có độ an toàn cao nhất thì nhất thiết phải đặt áp suất an toàn. Nếu áp suất trong buồng khô tăng quá cao (quá giới hạn áp suất an toàn) thì nhiệt độ của giá cấp cho sản phẩm phải đƣợc dừng và quá trình thăng hoa chậm lại, tránh đƣợc sự tan chảy của sản phẩm. Nhiệt độ an toàn nên thấp hơn 50C so với điểm tan chảy (hay điểm đông). Theo đƣờng cong áp suất bay hơi dễ dàng tìm đƣợc psafe.
Áp suất báo động: Các máy lớn có máy điều nhiệt bằng chất lỏng thì có thể có hệ thống cảnh báo áp suất báo động. Nếu áp suất trong buồng khô tăng tới giá trị đặt áp suất báo động thì máy sẽ cắt cấp nhiệt cho sản phẩm. Bộ điều khiển sẽ cho ra âm
thanh báo động và nhiệt độ giá đƣợc làm lạnh xuống nhiệt độ tiền đông càng nhanh càng tốt. Nhiệt độ báo động nên thấp hơn nhiệt độ đông từ 30
- 50C. - Phase 4: Làm khô cấp 2
Nhiệt độ giá sẽ tăng lên đến 200