Nghiên cứu chế biến thực phẩm ăn liền từ bã đậu nành (okara) bằng phương pháp vi sinh

Hỗn hợp các chủng vi sinh vật, có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa probiotic B.subtilis, vi khuẩn lactic và có dược tính nấm sợi Linh chi… được sử dụng để chế biến các sản phẩm từ đậu nành có t

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày tháng năm 2010)

NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN THỰC PHẨM ĂN LIỀN TỪ BÃ ĐẬU NÀNH

(OKARA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: VÕ THANH TRANG

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

THÁNG 1/ 2010

LỜI CẢM ƠN

Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

Thầy, TS Lê Chiến Phương, người đã gợi mở đề tài, tận tình hướng dẫn và cung cấp nhiều kiến thức thực nghiệm quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành đề tài này

Chân thành cảm ơn bạn Phan Văn Dân và các em sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực phẩm thuộc phòng Công nghệ biến đổi sinh học đã hỗ trợ tôi hoàn thành đề tài này

Xin chân thành cảùm ơn quý thầy cô, anh chị, các bạn đồng nghiệp công tác tại Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM đãõ nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình công tác và hoàn thành đề tài

TÓM TẮT ĐỀ TÀI

Ðậu nành và các sản phẩm chế biến từ nó, rất giàu protein, lipid, carbohydrat,

và các hoạt chất sinh học quý như polyphenols, lecithin, saponin, phytoestrogen (isoflavonoids, lignans, isoflavones, coumestans …) có tính năng đa dạng bảo vệ cơ thể phòng, chống nhiều bệnh hiểm nghèo Protein đậu nành còn có tác dụng hữu hiệu giảm cholesterol trong máu, giảm thiểu nguy cơ các bệnh liên quan đến tim mạch, phòng ngừa ung thư vú, bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh xốp xương, và các triệu chứng rối loạn tiền mãn kinh ở phụ nữ… Chất xơ (xơ tan) của đậu nành còn được cho

là có tác dụng hấp thu chất béo ở dạ dày, ức chế sản xuất cholesterol ở gan và làm giảm cholesterol máu, làm chậm tốc độ hấp thu đường từ ruột Tận dụng và xử lý chất

xơ của đậu nành thành dạng dễ sử dụng và làm cho sản phẩm thực phẩm có đặc điểm cảm quan tốt là vấn đề cần thiết Trong khi đó, ở Việt Nam, ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành hàng năm thải ra lượng xác bã (okara) rất lớn Mặc dù lượng xác bã này còn chứa nhiều chất dinh dưỡng nhưng khó làm thực phẩm cho người do có lượng lớn chất khó ăn như cellulose… Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp khả dĩ có thể tận dụng được phế phẩm này để phục vụ lại con người là rất quan trọng Một trong những giải pháp đó là sử dụng enzyme vi sinh vật và sinh khối nấm sợi Linh chi Các chất dinh dưỡng và hoạt chất sinh học của sinh khối nấm sợi cũng phong phú và có thể so sánh với tai nấm về thành phần và hàm lượng Hỗn hợp các chủng vi sinh vật, có tác

dụng hỗ trợ tiêu hóa (probiotic) (B.subtilis, vi khuẩn lactic) và có dược tính (nấm sợi

Linh chi)… được sử dụng để chế biến các sản phẩm từ đậu nành có tác dụng tốt cho sức khỏe, trong việc chế biến và sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng

Abstract: Soybean and its products, rich in protein, lipid, carbohydrate and many precious biological active substances such as polyphenols, lecithin, saponin, phytoestrogen (isoflavonoids, lignans, isoflavones, coumestans …), can save our health from a lot of serious diseases Soy protein also may reduce cholesterol and the risk of heart disease, prevent cancers of the breast, kidney diseases, diabetes, porous bone diseases, and some pre-menopausal disorders in women… Soy fibers (dietary fibers) are considered as an agent for absorbing fat in stomach, inhibiting cholesterol production in liver, slowering suger absorption Taking adventage and treatment the fiber of soybean into the easy taken and good organoleptic food are necessary problems Meanwhile, in Vietnam, the annual residue of the soymilk processing industry is numerous Although that by-product contains a high nutritional component,

it can not be used as a human food because of indigestable substances such as cellulose…Consequently, an important method which can utilise this residue as a food

supply is using microorganisms’ enzymes such as Linhzhi (G.lucidum) hyphae The

hyphae’s nutritions and biological substances are equivalent to the mushroom’s A

complex of microorganisms which has digestive support effect (probiotic) (B.subtilis, latic acid bacteria) and pharmacological properties (Ganoderma lucidum)… is used to produced many soy food and funtional food

MỤC LỤC

Trang Tóm tắt đề tài/dự án……… …I Mục lục………II Danh sách các chữ viết tắt……….V

Danh sách bảng……… VI

Danh sách hình………VII

Danh sách đồ thị……….VIII

Phần mở đầu……… …1

Báo cáo nghiệm thu……….2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 Okara……… 4

1.2 Các tác nhân hóa học và sinh học……….5

1.2.1 Chitosan……… …5

1.2.2 Muối kiềm và muối polyphosphate……….6

1.2.3 Butyl hydroxy toluen (BHT) ……… 6

1.2.4 Enzyme cellulase……….6

1.3 Chất xơ………6

1.3.1 Định nghĩa……… 6

1.3.2 Công dụng của chất xơ………7

1.4 Các giống vi sinh vật sử dụng………8

1.4.1 Bacillus subtilis……….8

1.4.1.1 Giới thiệu ………8

1.4.1.2 Hệ enzyme của Bacillus subtilis……… 8

1.4.1.3 Công dụng của B subtilis………9

1.4.2 Lactobacillus……… 9

1.4.2.1 Giới thiệu……….9

1.4.2.2 Ứng dụng……… .10

1.4.3 Nấm Linh chi……….10

1.4.3.1 Đặc tính sinh học……… 10

1.4.3.2 Dược tính của nấm Linh chi……… 11

1.4.3.3 Công dụng của nấm Linh chi………12

1.5 Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn………12

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……… 15

2.1 Vật liệu……… 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu ………15

2.2.1 Nội dung 1 Nghiên cứu hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật sử dụng……… 15

2.2.1.1 Nghiên cứu hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Lactobacillus

sp ……… 15

2.2.1.2 Nghiên cứu hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Bacillus subtilis……… 16

2.2.1.3 Nghiên cứu hình thái, các hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi……… 17

2.2.2 Nội dung 2 Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của các vi sinh vật sử dụng theo thời gian……… 19

2.2.2.1 Enzyme amylase của B.subtilis……… 19

2.2.2.2 Enzyme protease của B.subtilis……….20

2.2.2.3 Enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) của nấm sợi Linh chi……… ……… 21

2.2.3 Nội dung 3 Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm……… 23

2.2.4 Nội dung 4 Phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm……… 24

2.2.4.1 Xác định độ ẩm……… ……… 24

2.2.4.2 Xác định hàm lượng N tổng số bằng phương pháp Kjeldahl………24

2.2.4.3 Xác định hàm lượng N amoniac ……… ………… 26

2.2.4.4 Xác định hàm lượng N formol ……… … 27

2.2.4.5 Xác định hàm lượng đường tổng ……… …… 28

2.2.4.6 Xác định hàm lượng đường khử……… ……….29

2.2.4.7 Xác định hàm lượng lipid ……… …… 29

2.2.4.8 Xác định chỉ số peroxide……… …30

2.2.4.9 Xác định hàm lượng cellulose……… ……30

2.2.5 Nội dung 5 Đánh giá cảm quan sản phẩm……… 31

2.2.6 Nội dung 6 Phân tích chỉ tiêu tổng VSV gây bệnh 33

CHƯƠ NG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 34

3.1 Nội dung 1 Kết quả nghiên cứu hình thái, đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi sinh vật sử dụng……… 34

3.1.1 Lactobacillus sp ……… 34

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái……… 34

3.1.1.2 Đặc điểm sinh lý……… 34

3.1.1.3 Đặc điểm sinh hóa……… 35

3.1.2 Bacillus subtilis……… 36

3.1.2.1 Đặc điểm hình thái……… 36

3.1.2.2 Đặc điểm sinh lý……… 36

3.1.2.3 Đặc điểm sinh hóa……… 37

3.1.3 Nấm Linh chi……… 37

3.1.3.1 Hình thái……… 38

3.1.3.2 Định tính các chất có hoạt tính sinh học 38

3.1.3.3 Ảnh hưởng của nấm Linh chi đến sự phát triển của B.subtils……… ………… 39

3.2 Nội dung 2 Kết quả định lượng hệ enzyme của các vi sinh vật 40

3.2.1 Hoạt tính enzyme amylase của B.subtilis theo thời gian 40

3.2.1 Hoạt tính enzyme protease của B.subtilis theo thời gian 39

3.2.3 Hoạt tính enzyme cellulase của nấm Linh chi theo thời gian 40

3.3 Nội dung 3 Chế biến sản phẩm 41

3.3.1 Xử lý nguyên liệu 41

3.3.1.1 Thí nghiệm 3.1: xay mịn okara 41

3.3.1.2 Thí nghiệm 3.2: xác định độ ẩm của nguyên liệu 42

3.3.1.3 Thí nghiệm 3.3: khả năng biến tính nguyên liệu của một số tác nhân 42

3.3.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ enzyme celluclast sử dụng……….43

3.3.3 Xử lý với vi sinh vật……… 44

3.3.3.1 Thí nghiệm 3.4: kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.subtilis……….44

3.3.3.2 Thí nghiệm 3.5: kết quả khảo sát tỉ lệ giống Lactobacillus sp……… 44

3.3.3.3 Thí nghiệm 3.6: kết quả khảo sát thời gian tạo vỏ bọc cho sản phẩm phomai từ sinh khối nấm sợi Linh Chi……… 44

3.3.3.4 Kết quả chế biến sản phẩm từ okara……….45

3.4 Nội dung 4 Phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng của sản phẩm……… 45

3.4.1 Độ ẩm (%)……… 46

3.4.2 Hàm lượng NTS (%)……… 46

3.4.3 Hàm lượng N formol (%)……… 47

3.4.4 Hàm lượng Namoniac (%)……….47

3.4.5 Hàm lượng đường tổng (%)……… 48

3.4.6 Hàm lượng đường khử (%)………48

3.4.7 Hàm lượng lipid (%)……… 49

3.4.8 Chỉ số peroxide……… 49

3.4.9 Hàm lượng cellulose……… 49

3.5 Nội dung 5 Đánh giá cảm quan sản phẩm……….50

3.6 Nội dung 6 Phân tích chỉ tiêu vi sinh vật……… 50

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ……….51

4.1 Kết luận……… 51

4.2 Đề nghị……… 51

PHỤ LỤC……….53

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 61

Liều dùng hàng ngày chấp nhận được CBTP Chế biến thực phẩm

SP Sản phẩm FDA Food and Drugs Administration Tổ chức thuốc và thực phẩm

DANH SÁCH BẢNG

1.1 Thành phần hoạt chất cơ bản trong nấm Linh chi 11

2.1 Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của B.subtilis 17

2.2 Bố trí thí nghiệm định lượng enzyme amylase 19

2.4 Bảng cơ sở đánh giá sản phẩm theo TCVN 3215 – 79 31

2.5 Bảng quy định các cấp chất lượng theo TCVN 3215 – 79 32

2.6 Bảng mô tả thang điểm cho các tiêu chuẩn của sản phẩm 1 33

2.7 Bảng mô tả thang điểm cho các tiêu chuẩn của sản phẩm 2 33

3.1 Sự biến đổi số lượng tế bào B.subtilis theo điều kiện nuôi và

3.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ trương nước của okara (bột okara:nước) 42

3.3 Khả năng biến tính bã okara bằng muối kiềm 42

3.4 Khả năng biến tính bã okara bằng muối polyphosphate 42

3.5 Kết quả khảo sát tỉ lệ enzyme celluclast 43

3.6 Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.subtilis 44

3.7 Kết quả khảo sát thời gian tạo vỏ bọc cho sản phẩm phomai

3.10 Bảng hệ số quan trọng 50 3.11 Bảng điểm tổng hợp kết quả kiểm nghiệm cảm quan 50

DANH SÁCH HÌNH

3.1 Khuẩn lạc Lactobacillus sp 34

3.2 Tế bào Lactobacillus sp 34

3.3 Khả năng làm đông tụ sữa của Lactobacillus sp 34

3.16 Định tính saponin - phản ứng Liebermann-Burchard 38

3.18 Định tính steroid - phản ứng Salkowki 39

3.20 Vòng kháng vi khuẩn B.subtilis của nấm Linh chi 39

DANH SÁCH ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ

3.1 Đường biểu diễn sự biến đổi số lượng tế bào B.subtilis theo thời gian ở pH 2 36

3.2 đường biểu diễn sự biến đổi số lượng tế bào B.subtilis theo thời gian ở pH 7 37

3.3 Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của B.subtilis theo thời gian 40

3.4 Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của B.subtilis theo thời gian 40

3.5 Đường biến thiên hoạt tính enzyme cellulase của nấm sợi Linh chi theo thời gian 41

3.7 Sự biến đổi hàm lượng NTS của sản phẩm theo thời gian 46

3.8 Sự biến đổi hàm lượng Nformol của sản phẩm theo thời 47

3.9 Sự biến đổi hàm lượng Namoniac của sản phẩm theo thời gian 47

3.10 Sự biến đổi hàm lượng đường tổng của sản phẩm theo thời gian 48

3.11 Sự biến đổi hàm lượng đường khử của sản phẩm theo thời gian 48

3.12 Sự biến đổi hàm lượng lipid của sản phẩm theo thời gian 49

3.13 Sự biến đổi chỉ số peroxide của sản phẩm theo thời gian 49

MỞ ĐẦU

Bã đậu nành (okara) là phần bã và các chất dinh dưỡng khác không tan trong nước, còn lại sau khi đã tách khỏi dịch các chất tan hoặc huyền phù trong nước của công nghiệp sản xuất sữa đậu nành hay đậu hũ, chứa một lượng lớn protein, carbohydrate, lipid, có cả calci, sắt, riboflavin Tuy nhiên, trong việc xử lý okara để bổ sung vào thực phẩm hay để chế biến thực phẩm từ okara thường gặp một số khó khăn như thành phần protein trong okara rất cao (từ 30-40%), chủ yếu là protein không tan nên tạo cảm giác khó chịu về cơ học khi nhai và làm khó ăn Hàm lượng xơ chủ yếu là

xơ không tan với thành phần chính là xơ tinh thể trong bã đậu nành khá cao tạo cảm giác nhám, cứng do đó khó nuốt khi ăn Vì vậy để dễ chế biến thực phẩm từ okara phải giảm lượng xơ không tan, thủy phân protein thành dạng dễ tan, tăng tỷ lệ peptide và đường khử

Bên cạnh đó sinh khối của một số loại VSV được dùng để xử lý okara (tơ nấm

Linh chi, B.subtilis, vi khuẩn lactic) có khả năng sinh tổng hợp các enzyme

peroxydase (hoặc catalase), polyphenoloxydase… có thể làm giảm lượng và hoạt tính của các chất oxy hóa ở nơi chúng tồn tại Mặt khác có thể cũng vì lý do này nên ở phần ruột già các VSV yếm khí phân hủy xơ có thêm điều kiện để hoạt động mạnh hơn

do đó xơ được phân hủy nhiều hơn, tạo thêm dinh dưỡng cho cơ thể Trong trường hợp này xơ và các enzyme chống oxy hóa đóng vai trò prebiotic (tạo điều kiện phù hợp cho các VSV có sẵn trong đường ruột hoạt động mạnh hơn) Các loại VSV này và các HCSH do chúng tạo ra đóng vai trò probiotic vì bản thân sinh khối của chúng làm tăng

số lượng quần thể VSV có lợi cho cơ thể và ức chế VSV có hại nhờ khả năng cạnh tranh thức ăn hay tạo yếu tố bất lợi (như tạo pH chua) đối với VSV có hại

Trong các trường hợp trên, các sản phẩm đã được chế biến từ okara chủ yếu bằng phương pháp sinh học có được vai trò chức năng là synbiotic (do prebiotic kết hợp với probiotic) Đây là những đặc điểm mà ngành chế biến thực phẩm chức năng rất quan tâm

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Tên đề tài: Nghiên cứu chế biến thực phẩm ăn liền từ bã đậu nành (okara) bằng

phương pháp vi sinh

Chủ nhiệm đề tài: Võ Thanh Trang

Cơ quan công tác: Viện Sinh học Nhiệt đới

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ trẻ

Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng

Kinh phí được duyệt: 80.000.000đ (tám mươi triệu đồng)

Kinh phí đã cấp: theo TB số : /TB-SKHCN ngày / /

Nội dung:

+ Giải quyết hiện tượng oxy hoá trong quá trình xử lý okara để chế biến thực phẩm Chọn các điều kiện thích hợp nhất để chống oxy hóa cho sản phẩm được chế biến từ okara

+ Thủy phân okara bằng các enzyme thương phẩm

+ Thủy phân okara bằng sinh khối B.subtilis (nguyên liệu được dùng là mẫu sau

khi được thủy phân bằng enzyme thương phẩm)

+ Biến tính toàn diện okara

Okara sau khi được xử lý cơ học và được thủy phân bằng enzyme cellulase thương phẩm (celluclast), được dùng để chế biến thực phẩm bằng phương pháp vi sinh

+ Nghiên cứu các giống VSV dùng để chế biến thực phẩm từ okara bằng

phương pháp vi sinh (Lactobacillus sp., B.subtilis, Ganoderma lucidum.) về đặc điểm

hình thái và khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học

+ Chế biến 2 sản phẩm từ okara đã được biến tính toàn diện bằng phương pháp lên men VSV có bổ sung gia vị

+ Phân tích các chỉ tiêu hoá sinh của nguyên liệu và của sản phẩm

+ Phân tích ATVSTP của sản phẩm (định lượng VSV có hại tạp nhiễm)

+ Nghiên cứu thời gian bảo quản và hiện tượng thoái hóa chất lượng sản phẩm + Đánh giá cảm quan sản phẩm

+ Xác lập các tiêu chuẩn chính của sản phẩm

Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện

- Xử lý cơ học okara bằng máy xay chà

2 mặt đá

+ Xay khô

+ Xay ướt

(có và không có bổ sung BHT)

- Xử lý sinh học nguyên liệu okara

+ Với enzyme celluclast

- Nghiên cứu vi sinh

+ Vi khuẩn lactic và propionic

+ Vi khuẩn subtilis

+ Nấm sợi G.lucidum

+ Định tính và định lượng các HCSH

được sinh tổng hợp

+ Acid hữu cơ (a.lactic của VK lactic)

+ Các enzyme protease và amylase của

B.subtilis

+ Hệ enzyme cellulase của G.lucidum,

+ Enzyme peroxydase (hay catalase)

của tất cả các giống được dùng để

- Kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh

- Xử lý cơ học okara bằng máy xay chà

2 mặt đá + Xay khô + Xay ướt (có và không có bổ sung BHT)

- Xử lý sinh học nguyên liệu okara + Với enzyme celluclast

+ Với B.subtilis

- Xử lý hóa học okara + Với muối kiềm + Với CaO + Với muối polyphosphate + Với chitosan

- Nghiên cứu vi sinh

+ Vi khuẩn lactic Lactobacillus + Vi khuẩn B.subtilis

+ Nấm sợi Linh chi G.lucidum

+ Định tính và định lượng các HCSH được sinh tổng hợp

+ Acid hữu cơ (a.lactic của VK lactic) + Các enzym protease và amylase của

B.subtilis + Enzym cellulase của G.lucidum

+ Sử dụng nấm sợi Linh chi làm vỏ bọc sinh học cho sản phẩm

- Chế biến 2 sản phẩm từ okara + Sản phẩm “phomai” nấu + Sản phẩm “phomai” có vỏ bọc sinh học

- Nghiên cứu thời gian bảo quản sản phẩm

- Phân tích sinh hóa (đạm, đường, béo…)

- Đánh giá cảm quan sản phẩm

- Kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Okara

Bã đậu nành (tên tiếng Nhật là okara và “okara” đã trở thành thuật ngữ quốc tế

để gọi bã đậu nành) còn gọi là “soy-pulp” (sẽ gọi tắt là okara) là phần bã và các chất dinh dưỡng khác không tan trong nước còn lại sau khi đã tách khỏi dịch các chất tan hoặc huyền phù trong nước của công nghiệp sản xuất sữa đậu nành hay đậu hũ Okara

là thứ bã màu trắng hay trắng ngà, thường nằm trên mặt lưới lọc sữa đậu nành, sau khi sấy khô có màu vàng|8| Nhiều người không nhận ra rằng phần bã này là một sản phẩm giàu dinh dưỡng, rất giàu xơ tan và xơ không tan, cũng như chứa một lượng lớn protein, lipid… |27|

Thành phần dinh dưỡng của okara (tính theo 100g): |27|

Năng lượng: 77kcal, protein: 3.22g, béo tổng số: 1.73g, béo bão hòa: 0.193g, béo 1 nối đôi: 0.295g, béo nhiều nối đôi: 0.755g, tro: 0.88g, carbohydrate: 12.54g, Ca: 80mg, Fe: 1.30mg, Mg: 26mg, P: 60mg, K: 213mg, Na: 9mg, Zn: 0.56mg, Cu: 0.2mg, Mn: 0.4mg, Se: 10.6mcg, Thiamin: 0.02mg, Riboflavin: 0.02mg, Niacin: 0.1mg, Pantothenic acid: 0.088mg, Vitamin B6: 0.115mg

Okara tươi, mới có thể được dùng ngay hay có thể giữ 2-3 ngày trong tủ lạnh hoặc hơn 4-5 tháng nếu đông lạnh

Tuy nhiên, phần lớn thợ làm đậu hũ ở Nhật thường bỏ okara hoặc thải cho trại nuôi heo Ở Thụy Sĩ, okara được dùng nuôi bò |8|

Bột okara khô có giá trị ở Nhật, Châu Á nhờ lợi ích về dinh dưỡng của nó Okara tươi hoặc khô được dùng để chế bíên nhiều loại thức ăn mềm, mịn với nước hoặc sữa, nấu cháo với các nguyên liệu khác như bột bắp, lúa mạch hay làm salad, bánh mì |27|

Theo các thông tin của công ty sữa Việt Nam (Vinamilk) cung cấp cho Viện Sinh học Nhiệt đới thì ở nước ngoài, có khi giá của bột okara không thấp hơn nhiều so với giá của đậu nành hạt do hàm lượng dinh dưỡng của nó khá cao Còn ở nước ta tại cty Sữa Việt Nam, nơi có công nghệ sản xuất sữa đậu nành tận thu bột okara hiện đại của nước ngoài thì okara có thành phần như sau |19|:

- Okara dạng ướt có hàm ẩm: 17.76%, xơ: 1.75%

- Okara dạng bột có hàm ẩm: 6.7%, béo: 10.59%, xơ: 1.99% và đạm: 36.43%

Cho tới thời điểm cuối năm 2006, lượng okara do Vinamilk sản xuất (có hàm lượng đạm 39.5% và xơ thô 8.36%) trên dây chuyền thiết bị hiện đại của nước ngoài (có công suất khoảng 10 tấn/giờ) mới chỉ dùng làm thức ăn thô cho chăn nuôi.|7 |

Tại công ty Tribeco theo quy trình sản xuất sữa đậu nành lọc sữa 1 lần chỉ thu được khoảng 50% protein của hạt đậu nành (ở nước ngoài lọc 2 lần sẽ thu được khoảng 65 – 70%) Từ 1kg đậu nành thu được 1.5kg bã đậu nành ướt (sau ly tâm), chứa khoảng 20% chất khô Bã ướt là dạng phế liệu cuối cùng của công nghệ sản xuất sữa đậu nành và hiện nay mới chỉ được sử dụng cho chăn nuôi |10|

Cho tới vài năm gần đây chỉ có một số ít công trình nghiên cứu về okara và tất

cả tập trung tại TP.Hồ Chí Minh Vũ Văn Độ và CTV|3| nghiên cứu dùng nấm sợi của

các loại nấm lớn (Linh chi (Ganoderma lucidum), Bào ngư (Pleurotus florida)) xử lý

okara để chế biến bánh bistcuit, trà túi lọc

Lê Chiến Phương và CTV (2004)|15| xử lý okara bằng nấm mốc Mucor và vi

khuẩn lactic Ngô Đại Nghiệp dùng Asp.oryzae chế biến okara thành tương xay|14| Lại Mai Hương và CTV dùng enzyme kết hợp với phương pháp cơ học xử lý cellulose

trong okara để sản xuất chế phẩm giàu chất xơ bổ sung vô một số thực phẩm |8| Chưa

có sản phẩm nào trong số các sản phẩm nêu trên được triển khai sản xuất thử ở quy mô công nghiệp

Điều này cho thấy ở Việt Nam ngay cả nơi có sản xuất okara ở quy mô công nghiệp, hiện đại như công ty sữa Việt Nam, loại phụ phế liệu đậu nành này vẫn chưa được tận dụng có hiệu quả vào các mục đích khác ngoài thức ăn chăn nuôi

1.2 Các tác nhân hóa học và sinh học

Trong sản xuất chế biến thực phẩm, phụ gia có tác dụng làm tăng độ giòn, dai, thơm, tươi, chống vi sinh vật tạp nhiễm khiến người ăn cảm thấy ngon hơn và bảo quản được lâu hơn Nhưng thời gian gần đây, do thiếu hiểu biết thậm chí cố ý, một số nhà sản xuất đã dùng thái quá cả một số loại phụ gia trôi nổi trên thị trường không được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm như formol, hàn the… Những chất này gây tác hại trước mắt và lâu dài đến sức khỏe người dùng|13| Vì thế việc ứng dụng các phụ gia như BHT, chitosan, polyphosphate… vừa có khả năng chống oxy hóa cho sản phẩm, vừa đảm bảo độ giòn, dai và an toàn cho người sử dụng

Vì thành phần protein trong okara rất cao (từ 30-40%), chủ yếu là protein không tan (lượng protein tan hầu hết đã được dùng làm sữa đậu nành) Đây là thành phần chính tạo nên giá trị của okara Chính thành phần protein không tan này tạo cảm giác khó chịu về cơ học khi nhai và làm khó ăn Điều này cũng gây khó khăn trong việc chế biến không chỉ các thực phẩm từ okara mà cả những thực phẩm khô từ protein đậu nành Các tác nhân khác nhau đã được sử dụng để biến tính okara để sau khi sấy khô, sản phẩm vẫn có thể trương nước thành mềm và dai trở lại, trong nhiều trường hợp các đặc điểm cơ học đã được cải thiện tốt hơn nguyên liệu gốc Các nhóm tác nhân đó là: 1.2.1 Chitosan

Chitosan là một aminopolysaccharide, có nguồn gốc từ chitin – được tách chiết

từ và biến tính từ vỏ các loài giáp xác như tôm, cua, …|28|

Chitosan là chất rắn, xốp nhẹ, màu trắng ngà, không mùi, không vị, hòa tan dễ dàng trong các dung dịch acid loãng

Chitosan không độc, dùng an toàn cho người, có tính hòa hợp sinh học cao với

cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như tính kháng nấm, kháng khuẩn, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, cầm máu, chống sưng u… Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, làm to vi động mạch và hạ huyết áp, điều trị bệnh thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết

Trong công nghệ thực phẩm, chitosan được dùng để bảo quản, đóng gói thức

ăn, bảo quản hoa quả tươi vì nó tạo màng sinh học không độc Chitosan cũng được đưa vào thành phần trong thức ăn như sữa chua, bánh kẹo, nước ngọt v.v… Nhật Bản đã có

những sản phẩm ăn kiêng có chứa chitosan để làm giảm cholesterol, giảm cân nặng, chống béo phì (bánh mì, khoai tây chiên…) Năm 1983, FDA chấp nhận chitosan được dùng làm chất phụ gia trong thực phẩm và dược phẩm

1.2.2 Muối kiềm và muối polyphosphate

Muối polyphosphate rất tốt cho cơ thể người Theo các nghiên cứu gần đây cho thấy muối polyphosphate cũng có tác dụng tương tự như hàn the trong việc làm dai thực phẩm nhưng không gây độc hại cho sức khỏe con người

Muối kiềm tốt nhưng nếu sử dụng nhiếu sẽ làm cho sản phẩm có độ pH cao, tạo

vị oi nồng, gắt cho sản phẩm, không tốt về mặt cảm quan

1.2.3 Butyl hydroxy toluen (BHT)

BHT là chất chống oxy hóa được Bộ Y tế cho phép sử dụng trong thực phẩm ở mức ADI: 0-0,125 |21| BHT thường được bổ sung trong dầu mỡ (giới hạn tối đa cho phép 75mg/kg), magarin (giới hạn tối đa 100mg/kg)

• 1,4 β-D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) Enzyme cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzyme này còn có các tên khác như: cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng

• 1,4 β-D-glucan 4 (EC.3.2.1.4) Enzyme này tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose, trong lichenin và β-D-glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose Enzyme này còn có các tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase, C-cellulase

• β-D glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21) Enzyme này phân hủy cellobiose tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy Chúng còn được gọi là cellobiase và β-glucosidase

- Enzyme thương phẩm celluclast |30|

Celluclast được sử dụng nhằm thủy phân các nguyên liệu giàu xơ thành các loại đường lên men được, khử tính nhớt của các cơ chất là cellulose tan, hoặc làm tăng năng suất các sản phẩm có nguồn gốc thực vật

Trong thực nghiệm, điều kiện tối ưu cho cho hoạt tính enzyme là: pH 4,5-6,0, nhiệt độ 50-60oC Thường được lưu giữ ở nhiệt độ 25oC, hoạt tính ổn định trong 3 tháng; ở nhiệt độ thấp hơn (5-10 °C), thời gian này có thể kéo dài hơn

1.3 Chất xơ

1.3.1 Định nghĩa |23|

Xơ tổng: chất xơ gồm các phần còn lại của tế bào thực vật, các polysaccharide,

lignin và các chất liên quan chịu được sự thủy phân của các enzyme trong hệ tiêu hóa người

Tùy theo độ phân tán trong nước mà chất xơ được chia thành 2 loại là tan và không tan Tất cả các thức ăn có nguồn gốc từ thực vật đều có cả 2 loại chất xơ này

Xơ không tan |17, 23|: loại xơ này chiếm khoảng 2/3 lượng xơ trong thực phẩm Chủ yếu là cellulose, ngoài ra còn có hemicellulose, lignin, cutin… Chất xơ không hòa tan có đặc tính thẩm thấu nước trong ruột, trương lên tạo điều kiện cho chất bã thải dễ thoát ra ngoài

• Cellulose: là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật, được cấu tạo bởi

các β-D glucose-pyranose, các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glycoside Cellulose không tan trong nước (cả nước nóng và nước lạnh), tan trong acid và kiềm Khi đun sôi với acid sulfuric đậm đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo nên disaccharide cellobiose Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng của người vì không tiêu hóa được ở ống tiêu hóa Động vật nhai lại có thể tiêu hóa dễ dàng cellulose vì trong ruột của chúng có chứa các vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme cellulase là enzyme thủy phân cellulose

• Hemicellulose: là nhóm polysaccharide không tan được trong nước, chỉ tan được

trong dung dịch kiềm Hemicellulose cũng là thành phần của thành tế bào thực vật

và tồn tại chủ yếu ở các phần như vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu được các monosaccharide thuộc nhóm hexose (như manose, galactose) và nhóm pentose (như arabinose, xilose) Trong thiên nhiên, loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ…

khi đi qua ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thu một số chất dinh dưỡng vào máu, và cũng làm tăng độ xốp, mềm của bã thải tiêu hóa

• Pectin: là polysaccharide có nhiều ở quả, củ hoặc thân cây Trong thực vật, pectin

tồn tại dưới hai dạng: dạng protopectin không tan (tồn tại chủ yếu ở thành tế bào)

và dạng hòa tan của pectin (tồn tại ở dịch tế bào) Dưới tác dụng của acid, enzyme protopectinase hoặc khi đun sôi, protopectin chuyển sang dạng pectin hòa tan Đặc tính quan trọng của pectin là khi có mặt acid và đường, nó có khả năng tạo thành chất gel, vì vậy nó được ứng dụng rộng rãi trong kỹ nghệ sản xuất mứt kẹo

1.3.2 Công dụng của chất xơ |23|

Vài năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu đã đưa ra bằng chứng về những tác dụng đáng kể của chất xơ trong việc phòng và chữa bệnh, ngoài một vài tác dụng đã biết đến

từ rất lâu Tác dụng phòng và điều trị của chất xơ chủ yếu tập trung vào các chứng bệnh mạn tính gắn với tuổi già

- Phòng ngừa táo bón: do có đặc tính hút nước, chất xơ không hòa tan trương

lên khi ở trong ruột, làm nở và mềm khối phân, kích thích thành ruột, tăng nhu động ruột khiến việc đẩy phân ra ngoài dễ dàng hơn Ngoài ra, chất xơ có tác dụng hấp phụ các chất độc có trong hệ tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch của hệ thống này, tăng cường hoạt động của hệ vi khuẩn đường ruột nên giảm được nguy cơ nhiễm trùng đường tiêu hóa, nhất là bệnh tiêu chảy

- Phòng ngừa bệnh ung thư: các chuyên gia về ung thư học của Mỹ đã khẳng

định rằng: chất xơ có tác dụng rất mạnh trong việc phòng ung thư đường tiêu hóa mà đặc biệt là ung thư đại tràng Nó làm tăng khả năng miễn dịch của hệ thống tiêu hóa, khuyến khích hệ vi khuẩn hữu ích trong ruột phát triển Chính hệ vi khuẩn này đã tác động thường xuyên lên thành ruột, hạn chế sự phân chia bất thường của các tế bào, kìm hãm sự phát sinh, phát triển các túi nang bất thường trên thành ruột Hơn nữa, khi

ở trong ruột, chất xơ còn tạo môi trường có tính khử cao, chống lại các chất oxy hóa, chất độc phát sinh trong quá trình chuyển hóa thức ăn ở đại tràng

Chất xơ còn có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ ung thư vú ở phụ nữ Với những phụ nữ có chế độ ăn nhiều chất xơ, ít chất béo và đạm thì nguy cơ ung thư vú có liên quan đến oestrogen giảm đáng kể Ở những trẻ em gái có chế độ ăn như vậy, tuổi xuất hiện kinh nguyệt cũng muộn hơn và vì thế sẽ ít bị ung thư vú hơn khi trưởng thành

- Giảm mỡ máu: khi các chất xơ không hòa tan hút nước, chúng giữ luôn một

phần muối mật nên kích thích cơ thể tăng cường sản xuất muối mật để bù vào lượng thiếu hụt, vì thế mà tăng sử dụng cholesterol Lượng cholesterol tích lũy sẽ giảm đi kéo theo lượng cholesterol trong máu cũng giảm Còn các chất xơ hòa tan tác động lên quá trình chuyển hóa lipid nên giảm nguy cơ xơ vữa động mạch Các chuyên gia khuyên rằng những người bị tăng cholesterol máu nên tăng lượng chất xơ trong khẩu phần hằng ngày

- Phòng ngừa và điều trị tiểu đường: chất xơ làm hạn chế tăng đường huyết sau

khi ăn (nhất là các chất xơ hòa tan) do có khả năng tăng tính nhạy cảm của insulin Nó tham gia chuyển hóa triglycerid nên giúp kiểm soát nồng độ đường trong máu một cách hiệu quả Đường sẽ được giải phóng từ từ vào máu, duy trì được nồng độ đường/máu một cách ổn định Đây chính là mục đích của việc phòng ngừa và kiểm soát bệnh tiểu đường

- Chống béo phì: chất xơ không có giá trị dinh dưỡng nên chỉ tạo cảm giác no

mà không tăng lượng calo cho cơ thể Vì thế, nó rất lợi cho những người bị béo phì Mặt khác, do chất xơ có thể hạn chế và kiểm soát lượng đường trong máu nên không tạo ra tình trạng thừa đường để chuyển hóa thành mỡ dự trữ Ngay trong quá trình tiêu hóa thức ăn, cả chất xơ hòa tan và không hòa tan đều làm tăng tốc độ vận chuyển thức

ăn trong ruột, hạn chế được sự hấp thu các chất dinh dưỡng nên cũng hạn chế tăng cân

- Điều trị sỏi mật: khi kết hợp với acid mật, các chất xơ tự nhiên ngăn chặn

nguy cơ tạo ra sỏi mật

Chất xơ quan trọng như vậy nhưng vẫn ngày càng giảm đi trong khẩu phần ăn hằng ngày Theo một khảo sát gần đây, lượng chất xơ trong khẩu phần ăn của chúng ta hiện nay chỉ bằng 40-50% so với 30 năm trước Điều này có thể được giải thích là do

sự phổ biến loại thực phẩm tinh chế (đã bị loại bỏ gần hết chất xơ) Đây cũng chính là một trong những nguyên nhân làm tăng nguy cơ mắc các căn bệnh của xã hội hiện đại như ung thư, tim mạch, tiểu đường Với người Việt Nam, để có đủ chất xơ trong một ngày, mỗi người cần ăn tối thiểu 300 g rau xanh và 100g quả tươi

mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ nên còn gọi là “trực khuẩn rơm cỏ” Chúng còn phân bố trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế

biến từ các loại hạt đó Trong bột mì, B.subtilis chiếm khoảng 75-95% vi khuẩn tạo

bào tử Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua)… chúng cũng có mặt và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh học

1.4.1.2 Hệ enzyme của Bacillus subtilis

• Hệ enzyme protease |11, 25|

B subtilis được nuôi trên môi trường lỏng để kích thích việc sinh tổng hợp

enzyme protease (trung tính và kiềm) Điều kiện tối ưu cho việc sinh tổng enzyme protease là : nồng độ cơ chất: 0,5%, thời gian ủ: 30 giờ, nhiệt độ ủ: 40oC, pH: 7, dung dịch đệm: đệm phosphate, môi trường dinh dưỡng: nước chiết thịt bò có bổ sung muối, nguồn C: lactose, nguồn N: (NH4)2SO4, nguồn acid amin: valine; các acid hữu cơ như acid acetic, acid lactic, acid citric ở các nồng độ khác nhau có thể làm giảm khả năng sinh tổng hợp protease Enzyme protease được tinh sạch bằng muối (NH4)2SO4 và màng lọc sephadex G200

Điều kiện để hoạt tính enzyme protease đạt cực đại là: pH 7, dung dịch đệm: đệm phosphate, thời gian ủ: 24 giờ, nhiệt độ ủ: 35oC

B subtilis tổng hợp protease ngoại bào (exoprotease) phân giải protein và các

cơ chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp

để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ

• Hệ enzyme amylase |11|

B subtilis có khả năng tạo một lượng lớn α- amylase ngoại bào

Amylase của B subtilis không có các liên kết sulfihidril và có khả năng phân giải tinh

bột nhanh gấp 2÷2,5 lần so với α- amylase nấm mốc

α- amylase của vi khuẩn B subtilis thủy phân tinh bột tạo ra các dextrin có mạch dài

khoảng 6-8 gốc glucose Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ:

1.4.1.3 Công dụng của B subtilis

- Tạo kháng sinh: subtilin, eumycin, bacillin, bacillomin chống được nhiều loại

vi trùng gây bệnh

- Người ta cũng thường thu α- amylase chịu nhiệt cao, dùng trong công nghiệp

dệt để tách hồ tinh bột trên vải từ B subtilis

Chế phẩm amylase từ vi khuẩn B subtilis được thay thế đại mạch nảy mầm

(malt) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột

Amylase của B subtilis chỉ được tạo thành ở giai đoạn đã hoặc đang kết thúc

quá trình sinh trưởng, bền nhiệt hơn so với enzyme của nấm mốc

- Các enzyme thủy phân protein được tìm thấy ở khắp nơi, trong tất cả các sinh vật sống, quan trọng cho sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào Mặc dù có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng chỉ có vài loài sinh tổng hợp được

enzyme protease có giá trị thương mại, trong đó B.subtilis có vai trò nổi bật trong các

ngành công nghiệp khác nhau như thực phẩm, sữa, dược, dệt

Protease là một trong những nhóm enzyme công nghiệp quan trọng nhất, chiếm gần 60% tổng lượng enzyme được bán ra, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp tẩy

rửa khô, sản xuất các loại thuốc tiêu hóa, thuốc điều trị các vết thương do bỏng hay do tác nhân virus |25|

1.4.2 Lactobacillus |22|

1.4.2.1 Giới thiệu

Tế bào hình que ngắn, thường có kích thước 0,5 – 1,2 x 1 – 10µm, đôi khi có dạng hình cầu kết thành chuỗi ngắn Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, hiếm khi di động bằng lông roi, kị khí không bắt buộc nhưng phát triển tốt hơn trong điều kiện không có oxy hay có bổ sung thêm 5% CO2

Khuẩn lạc có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ đục, không nhuộm màu Hình thức dinh dưỡng là hóa dưỡng hữu cơ, đòi hỏi môi trường nuôi cấy phải giàu chất dinh dưỡng, phức tạp, có khả năng lên men và phân huỷ saccharose Không khử được nitrate, không làm tan gelatin, không có catalase cũng như cytochrome Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30 – 40oC Phân bố rộng rãi trong môi trường đặc biệt trên thực phẩm có nguồn gốc thực vật, động vật, ruột chim và động vật hữu nhũ Hiếm khi gây

bệnh Các chủng điển hình: Lactobacillus delbrueckii

1.4.2.2 Ứng dụng |5, 26|

™ Bacteriocin:

Việc lên men thực phẩm bằng cách sử dụng vi khuẩn lactic là phương pháp bảo quản thực phẩm bằng sinh học cổ xưa nhất dựa vào sự đối kháng của các loại vi sinh vật khác nhau Tuy nhiên, đến những năm gần đây, phương pháp này mới nhận được sự chú ý của các nhà khoa học, đặc biệt là việc sử dụng các vi khuẩn lactic khác nhau Một trong những đặc điểm quan trọng của vi khuẩn lactic là khả năng tạo các hoạt chất

có khả năng kháng khuẩn gọi là các bacteriocin Các bacteriocin có khả năng kìm hãm

sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh hay gây hư hỏng thực phẩm như Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Bacillus spp., Enterococcus spp

™ Probiotics:

Khi bắt đầu bước vào kỷ nguyên mới, chế độ ăn uống được con người chú ý nhiều hơn và đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa bệnh tật và gia tăng sức khỏe Khái niệm “probiotics” được biết vào đầu thập kỷ 1900, cho đến năm 1965, thuật ngữ này chính thức được Lilly và Stillwell sử dụng Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi được đưa vào cơ thể người hay động vật, nó có những tác động có lợi lên sức khỏe vật chủ và làm tăng khả năng hoạt động hệ vi sinh vật của vật chủ (Havenaar và Huis in’t Veld, 1992)

Một số loài vi sinh vật được sử dụng như probiotics là: Lactobacillus acidophilus, L.plantarum, L.casei, L.casei subsp rhamnosus, L.delbrueckii subsp bulgaricus, L.fermentum, L.reuteri, Lactococcus lactis subsp lactis, Bifidobacterium bifidum B.infantis, Streptococcus salivarius subsp thermophilus, Enterococcus faecalis, Saccharomyces boulardii (Nguồn: Conway, 1996)

™ Một số ứng dụng khác

Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa để sản xuất sữa chua, kefir, phomai,

Ứng dụng trong muối chua rau quả: bắp cải muối, dưa chuột muối…

Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi

Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và các loại muối lactate

Acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo, công nghiệp thực phẩm

Lactate calci là loại dược phẩm bổ sung calci dưới dạng dễ hấp thu, lactate sắt dùng để chữa bệnh thiếu máu, lactate đồng dùng làm dung môi…

1.4.3 Nấm Linh chi

1.4.3.1 Đặc tính sinh học |16|

Nấm Linh chi đã nổi tiếng từ ngàn xưa ở các nước Á Đông, phiên âm theo tiếng Trung Quốc gọi là Lingzhi, theo tiếng Nhật là reishi, ở Việt Nam thì hay gọi là nấm Lim Nấm Linh chi còn có nhiều tên gọi khác như: Bất lão thảo, Vạn niên nhung, Mộc Linh chi… nhưng tên Linh chi có lẽ mang tính tiêu biểu và được sử dụng phổ biến hơn

cả (tên Linh chi chính thức được sử dụng trong sách “Thần nông bản thảo” cách đây hơn 2000 năm)

Linh chi thường mọc ký sinh trên các cây gỗ trong nhiều năm Cây gỗ bộ Đậu (Fabales) là những cây chủ ưa thích của chúng, ta thường gặp Linh chi trên các cây Lim, phượng vĩ, so đũa và một số loài cây khác đã chết, mục hoặc cả trên cây sống như xoài, mít, mãng cầu, phi lao, dừa v.v…

Tính đa dạng của các loài Linh chi ở Việt Nam bộc lộ qua biến dị hình thái thể quả Cuống thể quả biến dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài

cỡ hàng 5-10cm hoặc rất dài 20-25cm Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do quá trình liên tán mà thành Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng nâu – vàng cam - đỏ cam - đỏ nâu – nâu tím – nâu đen, nhẵn bóng, láng như verni Sẫm màu dần khi già Kích thước tán biến động từ 2-30cm dày 0,8-2,5cm Thịt nấm dày từ 0,4-1,8cm màu vàng kem – nâu nhạt - trắng Nấm mềm dai khi tươi, trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống

1.4.3.2 Dược tính của nấm Linh chi |16|

Số lượng các chủng loài nấm Linh chi được sử dụng trong công nghệ dược liệu, dược phẩm ngày càng tăng và đó cũng là bí quyết của các quốc gia Á Đông Vào thập niên 70-80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh chi

Một số loài Linh chi đã được phân chất: Ganoderma applanatum, G.boninese, G.lucidum … với các nhóm hoạt chất steroid, triterpenoid, và polysaccharide

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV, IR… đặc biệt là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phổ kế plasma (ICP), đã được xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi Có thể khái quát trong bảng sau:

Bảng 1.1 Thành phần hoạt chất cơ bản trong nấm Linh chi

Adenosine dẫn xuất Nucleotide Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giãn

cơ, giảm đau Lingzhi-8 Proteine Chống dị ứng phổ rộng, điều hòa

miễn dịch

Lanosporeric acid A Steroide Giảm cholesterol

II, III, IV, V Steroide Giảm cholesterol

Ganoderans A, B, C Polysaccharide Hạ đường huyết

Beta-D-Glucan Polysaccharide Chống ung thư, tăng tính miễn dịch BN-3B: 1, 2, 3, 4 Polysaccharide

D-6 Polysaccharide Tăng tổng hợp protein, tăng chuyển

hóa acid nucleic

Ganoderic acids R, S Triterpenoid Trợ tim

Ganoderic acids B, D, F,

H, K, Y

Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE

Ganoderic acids Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Ganodermadiol Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE

Ganodermic acids Mf Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Ganodermic acids T.O Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Lucidone A Triterpenoid Bảo vệ gan

Ganosporelacton A Triterpenoid Chống khối u

Ganosporelacton Triterpenoid Chống khối u

Oleic acid dẫn xuất Acid béo Ức chế giải phóng histamine

Điều đáng lưu ý là các nhóm hoạt chất này gặp khá phổ biến trong cấu trúc nấm, trong thể mang bào tử, trong bào tử đảm và trong hệ sợi (Mycelia), trong nấm tự nhiên hoang dại và nuôi trồng chủ động

1.4.3.3 Công dụng của nấm Linh chi |29|

+ Hạ bớt lượng đường trong máu của người bị tiểu đường (nhờ chất Ganoderan) nhất

là tiểu đường type 2 (do cơ thể sản xuất insulin không đủ)

+ Tăng cường đào thải các chất phóng xạ nhiễm vào trong cơ thể Dùng uống kèm khi

xạ trị và hóa trị để giảm các triệu chứng xấu như đau đớn, rụng tóc

+ Ức chế sự tạo thành u bướu, ngăn ngừa ung thư

+ Điều hoà huyết áp, dưỡng tim lọc máu, chống tích mỡ trong mạch máu gây ra bệnh tim, tai biến mạch máu não

+ Thanh tâm, êm dịu thần kinh giúp dễ ngủ, ăn ngon; chống dị ứng

+ Làm chậm quá trình lão hóa, tăng cường thể lực, giảm mệt mỏi

+ Chống độc: giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc vô cơ và hữu cơ do ăn uống, tiếp xúc, hít thở; các độc tố do ký sinh trùng, vi trùng gây bệnh trong cơ thể, các bệnh suy gan, suy thận v.v

+ Kích thích quá trình phục hồi hệ miễn dịch (tăng cường tính thực bào, tiết ra interferon) làm tăng sức đề kháng (theo Cổ Đức Trọng) Đây là điểm quan trọng khiến trên thế giới dùng Linh chi như là thực phẩm vì sức khỏe và được dùng kèm với các loại thuốc trị bệnh Vì vậy nên dùng nấm ở những thời gian hay xảy ra dịch bệnh cảm cúm để nâng cao sức khỏe

1.5 Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn

Trong việc xử lý okara để bổ sung vào thực phẩm hay để chế biến thực phẩm từ okara thường gặp một số khó khăn chính như sau:

™ Vì thành phần protein trong okara rất cao (từ 30-40%), chủ yếu là protein không tan (lượng protein tan hầu hết đã được dùng làm sữa đậu nành) Đây là thành phần chính tạo nên giá trị của okara Chính thành phần protein không tan này tạo cảm giác khó chịu về cơ học khi nhai và làm khó ăn vì sau khi bị sấy khô protein không tan rất

khó trương nước để mềm trở lại, dù được nấu sôi lâu, kỹ, nhất là ở pH acid Điều này cũng gây khó khăn trong việc chế biến không chỉ các thực phẩm từ okara mà cả những thực phẩm khô từ protein đậu nành

Để khắc phục nhược điểm đó, đề tài đã sử dụng các nhóm tác nhân như muối kiềm, hệ enzyme của các vi sinh vật để xử lý okara Ngoài ra còn có một phát hiện mới

có lợi trong trường hợp này: B.subtilis có thể sinh tổng hợp một loại dịch nhớt trong

quá trình sống, làm cơ chất nhão ra, giảm được độ cứng cố hữu

™ Hàm lượng xơ chủ yếu là xơ không tan với thành phần chính là xơ tinh thể trong bã đậu nành khá cao, từ 9,0 – 19,0% tạo cảm giác nhám, cứng do đó khó nuốt khi ăn Vì vậy để dễ chế biến thực phẩm từ okara phải giảm lượng xơ không tan và biến tính một phần thành xơ tan và đường khử

Nghiên cứu của Vũ Văn Độ và CTV (2004) đã nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi và Bào ngư (là 2 loại nấm hoại gỗ có hoạt tính enzyme phân hủy xơ cao nhất trong số những loại nấm ăn được) trên cơ chất okara sau đó sấy khô và nghiền thành bột mà không dùng sinh khối tươi sống

Nghiên cứu của Lê Chiến Phương và CTV (2004) đã nuôi sinh khối nấm sợi Mucor theo phương pháp truyền thống làm vỏ bọc cho sản phẩm từ đậu hũ và từ bã đậu nành Sản phẩm có hình khối lớn, chứa 7-8% NaCl và 7.5% cồn etilic Nấm sợi Mucor có hoạt tính enzyme protease khá cao song hoạt tính enzyme cellulase không mạnh lắm

Ngoài ra Lê Chiến Phương và CTV (2007) còn dùng mốc trắng Penicillium camemberti tạo vỏ bọc sinh học cho sản phẩm từ đậu hũ lên men

Nghiên cứu của Ngô Đại Nghiệp và CTV (2005) đã nuôi sinh khối nấm mốc

Aspergillus oryzae trên cơ chất bã đậu nành để chế biến thành tương xay và tương

gừng sản phẩm chứa 14,5% NaCl Nấm mốc này có hoạt tính enzyme protease khá mạnh song hoạt tính enzyme cellulase không cao lắm

Nghiên cứu của Lại Mai Hương và CTV đã dùng phương pháp nghiền cơ học (xay ướt và xay khô kết hợp dùng 2 enzym cellulase và pectinase thương phẩm của hãng NOVO (Đan Mạch) để xử lý okara

Ở đề tài này, sinh khối nấm sợi Linh chi được cho phát triển trên cơ chất okara đã được tạo hình khối cụ thể (trước đó đã được xay cơ học, xử lý xơ bằng enzyme cellulase rồi thủy phân hoặc biến tính protein) để tạo vỏ bọc sinh học tươi, sống có các tính chất:

• Màu trắng bông: Dày và bền chắc, đảm bảo hình dáng ổn định cho sản phẩm

• Có khả năng sinh tổng hợp các enzyme đặc trưng, trong đó có cellulase, có thể hoạt động âm thầm phân hủy xơ trong suốt quá trình bảo quản và lưu trữ sản phẩm

• Có chứa phần lớn các hoạt chất sinh học (HCSH) quý có trong thể quả của nấm Linh chi: Polyphenols, saponin, alkaloid, sterol, glucoside…

™ Nếu chỉ giải quyết được một trong hai khó khăn nêu trên mà không giải quyết được cả hai thì bất kỳ một sản phẩm nào từ okara đều khó sử dụng và khó tiêu thụ

Đề tài đã học tập và vận dụng kết hợp các thành tựu của các tác giả đi trước mong đạt được kết quả toàn diện hơn trong việc xử lý 2 thành phần chủ yếu và cũng là khó khăn nhất của okara là protein không tan và xơ thô

™ Ngoài giá trị dinh dưỡng cao (giàu protein, lipid) và khả năng hỗ trợ tiêu hóa (nhiều xơ) thì giá trị về thực phẩm chức năng của các nguyên liệu và sản phẩm từ okara chưa được chú ý giữ gìn và nâng cao đúng mức

™ Trong okara hàm lượng chất béo còn khá cao (9,0-22,0%) mà phần lớn chất béo của đậu nành là không no và nhiều nối đôi Trong quá trình chế biến từ đậu nành hạt tới okara thô đã có một số công đoạn làm tăng khả năng oxy hóa chất béo (ngâm, xay các kích cỡ hạt, lọc…) Vì vậy trong quá trình xử lý tinh tiếp theo để ngăn chặn và giảm bớt hiện tượng oxy hóa phải tiến hành xử lý chống oxy hóa ngay từ đầu

™ Phát hiện khả năng chất xơ (cellulose) có thể đóng vai trò của chất chống oxy hóa nhờ bản thân chất xơ có tính khử Mạch phân tử cellulose càng ngắn, hoạt tính khử chung của khối lượng xơ cố định càng cao vì đầu mạch có tính khử tăng

™ Bên cạnh đó sinh khối của một số loại VSV được dùng để xử lý okara (tơ nấm

Linh chi và các loại nấm sợi khác, B.subtilis, VK lactic và propionic) có khả năng

sinh tổng hợp các enzyme peroxydase, (hoặc catalase), polyphenoloxydase… có thể làm giảm lượng và hoạt tính của các chất oxy hóa ở nơi chúng tồn tại

™ Mặt khác có thể cũng vì lý do này nên ở phần ruột già các VSV yếm khí phân hủy xơ có thêm điều kiện để hoạt động mạnh hơn do đó xơ được phân hủy nhiều hơn, tạo thêm dinh dưỡng cho cơ thể

Trong trường hợp này xơ và các enzyme chống oxy hóa đóng vai trò prebiotic (tạo điều kiện phù hợp cho các VSV có sẵn trong đường ruột hoạt động mạnh hơn)

™ Các sản phẩm từ okara có chứa sinh khối VK B.subtilis, lactic, nấm sợi Linh chi Một phần của sinh khối B.subtilis là những bào tử có sức chịu đựng cao trong

nhũng điều kiện bất lợi (pH chua của dạ dày) và khi sang ruột non và ruột già (có pH thích hợp) chúng nảy mầm và tạo các tế bào dinh dưỡng hoạt động sống

Các loại VSV này và các HCSH do chúng tạo ra đóng vai trò probiotic vì bản thân sinh khối của chúng làm tăng số lượng quần thể VSV có lợi cho cơ thể và ức chế VSV có hại nhờ khả năng cạnh tranh thức ăn hay tạo yếu tố bất lợi (như tạo pH chua) đối với VSV có hại

™ Trong cả hai trường hợp trên, các sản phẩm đã được chế biến từ okara chủ yếu bằng phương pháp sinh học có được vai trò chức năng là synbiotic (do prebiotic kết hợp với probiotic) Đây là những đặc điểm mà ngành CBTP chức năng rất quan tâm Đồng thời lại tiết kiệm, tận dụng mọi nguồn nguyên liệu nhất là phụ phế liệu để biến đổi thành những dạng hàng hóa có giá trị hơn

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi sinh học cung cấp

- Các hóa chất, dụng cụ và máy móc tại Viện Sinh học nhiệt đới

- Enzyme cellulase thương phẩm có tên thương mại là celluclast của hãng Novo

- Đan Mạch

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung 1 Nghiên cứu hình thái; các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật

sử dụng

2.2.1.1 Nghiên cứu hình thái; các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Lactobacillus sp

™ Quan sát hình thái bằng phương pháp nhuộm Gram |4, 5|

Nguyên tắc:

Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và iod mà vi khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau là:

Vi sinh vật có màu tím đậm là Gram dương

Vi sinh vật có màu hồng, đỏ nhạt là Gram âm

Cách tiến hành:

- Làm vết bôi trên lame

- Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây - 1 phút, rửa trôi thuốc nhuộm dư với nước

- Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước

- Tẩy màu bằng cồn 96o từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ và cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm chảy theo Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước

- Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin và để yên trong vòng 30 giây Rửa với nước

- Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu x100

™ Phương pháp định tính acid lactic

Nguyên tắc:

- Khi tác dụng với acid lactic, thuốc thử Ufermen sẽ đổi màu từ xanh tím sang màu vàng

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị khoảng 5 ml môi trường dinh dưỡng, cấy vi khuẩn lactic vào

- Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng khoảng một ngày Sau đó cho dịch lên men phản ứng với thuốc thử Ufermen

- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa các thành phần như sau:

Ống 1: 3 ml dịch môi trường, 1 ml thuốc thử Ufermen

Ống 2: 3 ml dịch lên men, 1 ml thuốc thử Ufermen

Ống 3: 3 ml acid lactic 98%, 1 ml thuốc thử Ufermen

- Quan sát và nhận xét sự đổi màu của thuốc thử

™ Phương pháp định lượng acid lactic |24|

Nguyên tắc:

Acid tổng được đo bằng cách chuẩn độ với NaOH 0,1M; thêm 1-2 giọt phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị Kết quả % acid lactic được tính theo công thức:

mmẫu x 1000 x D 90: trọng lượng phân tử acid lactic (g)

- Lên men glucose

2.2.1.2 Nghiên cứu hình thái; các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Bacillus subtilis

™ Phương pháp nhuộm Gram:

Tương tự mục 2.2.1.1

™ Phương pháp nhuộm bào tử |4|:

Với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1% và xanh methylen

- Làm vết bôi trên một phiến kính sạch và để khô tự nhiên

- Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến bốc hơi trong hai phút rồi rửa với nước

- Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuchsin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho đến bốc hơi trong vòng 5 phút

- Rửa vết bôi bằng nước

- Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút

- Rửa vết bôi bằng nước

- Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen trong 5-15 phút

- Rửa lại với nước và để khô tự nhiên

- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100) Bào tử sẽ mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh

™ Phương pháp xác định sinh khối tế bào B.subtilis bằng phương pháp đo độ

môi trường NB khác (nhân giống cấp 2), lắc 24 giờ Từ bình tăng sinh cấp 2, dùng pippette vô trùng hút một thể tích canh khuẩn đem pha loãng sao cho mật độ tế bào đạt OD540 = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8 Tại mỗi giá trị OD khác nhau, tiến hành trải dịch tăng sinh đã được pha loãng thích hợp lên môi trường thạch NA (nutrient agar), ghi nhận kết quả

¾ Khảo sát điều kiện pH ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển B subtilis Nguyên tắc:

pH là thước đo nồng độ ion hydro trong dung dịch Dung dịch với nồng độ ion hydro tăng mang tính acid, ngược lại khi nồng độ ion hydro giảm thì mang tính kiềm Hầu hết các vi khuẩn thuộc loại trung tính, biên độ pH khoảng 6,5 -7,5 Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được Đây là cơ sở của việc định lượng tế bào trên thạch đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chỉ số lượng tế bào sống có trong thể tích giống đó Thông thường, tất cả các tế bào ở phase tăng trưởng hay giai đoạn sớm của phase ổn định đều có khả năng hình thành khuẩn lạc Vì vậy, số lượng khuẩn lạc đếm được gần như tương đương với số lượng tế bào sống

Khảo sát sinh khối sau 0 giờ, 8 giờ, 16 giờ, 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ và 48 giờ Sau mỗi thời gian quy định như trên, hút từ mỗi bình 5ml Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở các nồng độ thích hợp 10-1, 10-2, 10-3 Đem đo OD ở bước sóng 540nm Chiếu lên đường cong chuẩn để tính được mật độ tế bào (CFU/ml) Thí nghiệm lặp lại

3 lần

Kết quả sau khi tính toán được ghi nhận vào bảng bố trí thí nghiệm sau:

Bảng 2.1 Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển

của B.subtilis

CFU/ml Trạng

2.2.1.3 Phương pháp nghiên cứu hình thái, hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi

™ Phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm để quan sát nấm sợi Linh chi |4|

- Đặt vào đáy hộp petri một tờ giấy thấm, đặt tiếp lên đó một miếng lame Đậy lại, gói giấy và đem khử trùng

- Đun chảy môi trường dinh dưỡng PGA đã khử trùng trong ống nghiệm

- Mở hé nắp đĩa petri gần ngọn lửa đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên miếng lame sao cho thạch chảy dài thành một lớp mỏng một bên của tấm lame

- Khi thạch trên lame đã đặc lại, nhỏ nước cất vô trùng thấm đều tờ giấy thấm

mà không tràn lên lame

- Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm sợi rồi chấm lên phần thạch của miếng lame trong phòng ẩm

- Hộp được gói giấy và nuôi ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày

- Mở hộp petri và lấy lame bên trong ra

- Dùng giấy thấm chùi mặt đáy của lame

- Đậy lamelle lên chỗ có khuẩn lạc mọc và đặt dưới kính hiển vi để quan sát mẫu

™ Phương pháp xác định các hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi |20|

¾ Định tính saponin bằng phương pháp hóa học

Phản ứng Liebermann-Burchard

Cho vào ống nghiệm khoảng 0,5g dược liệu, thêm 5ml cồn 70o và đun cách thủy trong 5 phút Lọc qua bông vào một chén sứ, cô trên bếp cách thủy đến cặn thật khô

Cho vào cặn này 1ml anhydrid acetic và 1 ml CHCl3, khuấy kỹ cho tan, Lọc bằng pipet Pasteur bịt bông, cho vào một ống nghiệm thật khô Để ống nghiệm trên giá, nghiêng giá và dùng pipet cho thật nhẹ nhàng khoảng 0,5ml H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm Mặt ngăn cách giữa 2 lớp sẽ có màu từ nâu tới đỏ, đỏ-tím hay tím Quan sát đồng thời lớp dung dịch phía trên có thể có màu xanh lá, xanh rêu, vàng-nâu, nâu-đỏ…

¾ Định tính alkaloid

Chuẩn bị mẫu: ngâm bột nguyên liệu trong dung dịch H2SO4 loãng 1%, sau đó cho lên nồi đun cách thủy 15 phút Lọc nước chiết Từ đây có thể định tính được alkaloid

Cách tiến hành:

Dùng các loại thuốc thử sau:

Thuốc thử Mayer: 1.35g HgCl2 hòa tan trong 100ml dung dịch KI 5% Các alkaloid

sẽ tủa vô định hình màu trắng vàng

Thuốc thử Wagner: hòa tan 5g I2 trong 100ml dung dịch KI 10% Các alkaloid cho tủa màu nâu sáng đến nâu đen (phần lớn ở dạng tủa bông hoặc bột, đôi khi tạo thành giọt dầu có màu nâu đen)

- Đổ môi trường lên đĩa petri vô trùng

- Dùng que cấy vòng cấy chuyền một ít sinh khối vi khuẩn từ ống giống qua các ống nghiệm chứa nước muối sinh lý vô trùng

- Dùng pipetteman hút 0,1ml dịch vi khuẩn ở trên vào các đĩa môi trường

- Trải đều bằng que gạt thủy tinh

- Đặt lên mỗi đĩa 3 miếng sinh khối sợi nấm, đường kính mỗi miếng 1cm

- Ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng

- Quan sát kết quả thu được

2.2.2 Nội dung 2 Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của các vi sinh vật sử

dụng theo thời gian

2.2.2.1 Enzyme amylase của B.subtilis |12|

Nguyên tắc:

Hoạt tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp Smith và Roe (1966) Hoạt tính amylase biểu thị khả năng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50oC và được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme đó trong một gam mẫu Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa bị phân hủy sẽ tạo phản ứng với iod và được đo bằng máy so màu quang học

1 ml dung dịch tinh bột 1% 1 ml dung dịch tinh bột 1%

0,5 ml dung dịch NaCl 3% 0,5 ml dung dịch NaCl 3%

Đem ủ ở nhiệt độ 50oC trong 30 phút, sau đó cho mỗi ống 1 ml dung dịch HCl 1N để kiềm hãm sự hoạt động của enzyme Cho nước cất đến 10 ml mỗi ống Cho tiếp một giọt dung dịch Lugol vào mỗi ống Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm

Đơn vị hoạt tính của enzyme amylase được tính theo công thức:

a: mật độ quang học của ống chuẩn L: hệ số pha loãng

b: mật độ quang học của ống thử m: trọng lượng (g) hoặc thể tích (ml) mẫu C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (10 mg)

UI = (a-b) × C × L

a × t × m

2.2.2.2 Enzyme protease của B.subtilis |6|

Nguyên tắc:

Dùng protein casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin

Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng enzyme

Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 µg tyrosin / 1

ml HCl 0,1M Thêm 5 ml Na2CO3 0,4M vào 1 ml dung dịch tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp Sau khi trộn đều để ổn định dung dịch ở 37±0,5oC trong 20 phút

Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả AS10, AS20, AS30, AS40, AS50.)

Ống đối chứng: dùng 1 ml HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này AS0)

Dựng đường chuẩn theo hàm lượng µg tyrosin và độ hấp thụ:

Định lượng enzyme trong mẫu:

Cho 1ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37±0,5oC trong 15 phút Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme vào, lắc đều, ủ hỗn hợp này

ở nhiệt độ 37±0,5oC trong 60 phút Sau đó cho vào hỗn hợp này 2ml dung dịch trichloroacetic (TCA) 5% Để ổn định nhiệt trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa Cho 5ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc Cho thêm thuốc

+

5

thử Folin đã pha loãng 5 lần vào hỗn hợp, để yên ở 37±0,5oC trong 20 phút Khi xuất

hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660nm

Mẫu đối chứng: lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành

các bước tương tự ở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện

Tính kết quả:

Một đơn vị hoạt tính enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra

một lượng amino acid tương đương với 100µg tyrosin trong 1ml dịch lọc trong điều

kiện thí nghiệm

Hoạt tính enzyme protease:

ĐVHT/g hoặc ml dung dịch enzyme = A60 – A0 × F × n × 1/100

A60: độ hấp thụ của mẫu

A0: độ hấp thụ của mẫu đối chứng

F: hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosin và độ hấp thu ở bước sóng 660nm trên đường chuẩn

n: hệ số pha loãng mẫu

1/100: hệ số chuyển đổi

2.2.2.3 Enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) của nấm sợi Linh chi |6|

Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi

enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5 và 40°C Lượng đường khử sinh ra được cho

phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác

định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở mức bước sóng 540 mm

Dựng đường glucose chuẩn:

Hòa tan 100 mg glucose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình

định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều

Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây:

Bảng 2.3 Đường glucose chuẩn

Lắc đều ống nghiệm, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt

độ phòng trong một chậu nước mát Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540 mm

Xác định hoạt tính của enzyme carboxymethyl cellulase (CM Case):

Ống nghiệm 1: Chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0

+ Hút 1 ml dung dịch đệm Na-acetate 50 mH, pH 5 cho vào ống nghiệm để ở 40°C/5

phút

+ Thêm 2 ml dung dịch DNS Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme

+ Thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều

+ Đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước

mát Đặt độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm bằng 0

Ống nghiệm 2: phản ứng enzyme

+ Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 40°C/5 phút Đồng thời ta

cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 40°C/5 phút

+ Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều Để phản ứng ở 40oC chính xác 10 phút

+ Thêm 2 ml dung dịch DNS – Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme

+ Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước mát Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm (AT)

Ống nghiệm 3: không có phản ứng enzyme

+ Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 40°C/5 phút Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng của dung dịch CMC 1% thích hợp ở 40°C/5 phút

+ Thêm 2 ml dung dịch DNS – Lactose và lắc đều

+ Thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều

+ Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước mát Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm (AB)

Định nghĩa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng

đường khử glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới điều kiện phản ứng

Kết quả:

Giá trị F = 0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 + + 0,6/AG0,6

CMCase UI/g = (AT – AB) x F (1000/198) + (1/10phút) x (1/1,0ml) x (1/C)

AT : Độ hấp thụ của dung dịch có phản ứng enzyme

AB : Độ hấp thụ của dung dịch không có phản ứng enzyme

2.2.3 Nội dung 3 Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm

Quy trình chế biến “phomai” từ okara Bước 1: xử lý nguyên liệu

- Thí nghiệm 3.1: xay mịn bột okara (lọc qua rây)

+ Nhiệt độ tối ưu: 50oC

+ Liều lượng enzyme sử dụng: 1%, 2%, 3%

+ Xác định thời gian phản ứng: 1giờ, 2giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ

Bước 3: xử lý với vi sinh vật

+ Điều kiện thanh trùng nguyên liệu: hấp 121oC/15phút

+ Khảo sát điều kiện cấy phức hợp vi sinh vật

Bột okara Xay mịn, xử lý với các tác nhân

hóa học Enzyme celluclast Bột okara có độ mịn cao và có hàm

lượng cellulose thấp

Hấp thanh trùng

Để nguội

Cấy B.subtilis Cấy Lactobacillus và đổ khuôn

Cấy Linh chi

- Thí nghiệm 3.4: điều kiện cấy B.subtilis:

+ Chỉnh pH nguyên liệu: 6.5 - 7

+ Khảo sát tỉ lệ giống: 1%, 2%, 3%

+ Khảo sát thời gian ủ nguyên liệu với B.subtilis: 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ, 28 giờ

- Thí nghiệm 3.5: điều kiện cấy Lactobacillus sp.:

Khảo sát tỉ lệ đường sucrose: 0%, 1%

Khảo sát tỉ lệ giống Lactobacillus: 0%, 1%, 2%

Thời gian ủ: 24 giờ

- Thí nghiệm 3.6: cấy Linh chi (đối với sản phẩm “phomai” trắng): cắt một miếng sinh

khối sợi nấm Linh chi từ môi trường dịch thể nuôi tĩnh, dùng kẹp vô trùng chuyển miếng sinh khối nấm đã cắt lên bề mặt cơ chất hình khối Đặt khối cơ chất đã được cấy nấm ở nơi có nhiệt độ thích hợp cho nấm bung tơ

2.2.4 Nội dung 4 Phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm

G : trọng lượng dĩa petri (g)

G1 : trọng lượng dĩa petri và trọng lượng mẫu thử trước khi sấy(g)

G2 : trọng lượng dĩa petri và trọng lượng mẫu thử sau khi sấy (g)

2.2.4.2 Xác định hàm lượng N tổng số bằng phương pháp Kjeldahl |9|

BO2- là một base mạnh, vì vậy dung dịch của bình hứng sẽ chuyển từ màu tím

đỏ sang màu xanh lá mạ Lượng BO2- được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm Xác định lượng BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với HCl 0,25N Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ

+ Hòa tan 0,264g methyl đỏ trong 250 ml cồn tuyệt đối

+ Hòa tan 1,28g bromocresol blue trong 50 ml cồn tuyệt đối

Trộn đều hai dung dịch trên , bổ sung đến 1 lít bằng cồn tuyệt đối

Dung dịch acid boric 4% với chỉ thị màu : hòa tan 80g acid boric trong 1800 ml nước cất, đun nóng một chút, để nguội bổ sung 25 ml hỗn hợp chỉ thị màu Bổ sung đến 2 lít bằng nước cất

Cách tiến hành :

Vô cơ hóa mẫu:

- Nguyên tắc : sự vô cơ hóa chất đạm là sự vô cơ hóa tất cả các chất đạm dù ở bất cứ

dạng nào (hữu cơ ,protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là amonsulphate (NH4)2SO4) đậm đặc và chất xúc tác

- Thực hành: cân 100mg mẫu đã nghiền nhỏ, 1g chất xúc tác cho vào ống phá mẫu +

5 ml H2SO4 đậm đặc, nối bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu Khi thời gian phá mẫu kết thúc để ống phá mẫu nguội Bổ sung 50 ml nước cất, trộn đều và để nguội, lắp vào máy chưng cất

Chưng cất:

Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 80 ml NaOH 32% Khởi động quá trình chưng cất, dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa sẵn 20 ml dung dịch acid boric 4% có chỉ thị màu

Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ) Chuẩn độ bằng HCl 0,25N Ngừng chuẩn độ khi xuất hiện màu phớt đỏ