Phương pháp nhuộm Gram:
Tương tự mục 2.2.1.1
Phương pháp nhuộm bào tử |4|:
Với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1% và xanh methylen - Làm vết bơi trên một phiến kính sạch và để khơ tự nhiên.
- Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bơi, hơ nĩng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến bốc hơi trong hai phút rồi rửa với nước.
- Nhuộm vết bơi với thuốc nhuộm Fuchsin, qua miếng giấy lọc, hơ nĩng cho đến bốc hơi trong vịng 5 phút.
- Rửa vết bơi bằng nước
- Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút. - Rửa vết bơi bằng nước.
- Nhuộm vết bơi bằng xanh methylen trong 5-15 phút - Rửa lại với nước và để khơ tự nhiên.
- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100). Bào tử sẽ mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh.
Phương pháp xác định sinh khối tế bào B.subtilis bằng phương pháp đo độ đục |18, 24|
Chuẩn bị mơi trường canh NB phân vào bình thủy tinh, đem hấp vơ trùng ở
121oC, 15 phút.
Cấy tăng sinh: lấy một vịng que cấy vi khuẩn từ thạch nghiêng CP cấy vào một bình NB (nhân giống cấp 1), lắc ở nhiệt độ phịng trong 48 giờ.
Từ bình tăng sinh, dùng pippette vơ trùng hút một thể tích canh khuẩn đem pha lỗng sao cho mật độ tế bào ở OD540 ~ 0,1. Sau đĩ cấy dịch pha lỗng này sang bình
% acid lactic
= = =
mơi trường NB khác (nhân giống cấp 2), lắc 24 giờ. Từ bình tăng sinh cấp 2, dùng pippette vơ trùng hút một thể tích canh khuẩn đem pha lỗng sao cho mật độ tế bào đạt OD540 = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8. Tại mỗi giá trị OD khác nhau, tiến hành trải dịch tăng sinh đã được pha lỗng thích hợp lên mơi trường thạch NA (nutrient agar), ghi nhận kết quả.
¾ Khảo sát điều kiện pH ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển B. subtilis
Nguyên tắc:
pH là thước đo nồng độ ion hydro trong dung dịch. Dung dịch với nồng độ ion hydro tăng mang tính acid, ngược lại khi nồng độ ion hydro giảm thì mang tính kiềm. Hầu hết các vi khuẩn thuộc loại trung tính, biên độ pH khoảng 6,5 -7,5. Một tế bào cĩ thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc cĩ thể trơng thấy
được. Đây là cơ sở của việc định lượng tế bào trên thạch đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chỉ số lượng tế bào sống cĩ trong thể
tích giống đĩ. Thơng thường, tất cả các tế bào ở phase tăng trưởng hay giai đoạn sớm của phase ổn định đều cĩ khả năng hình thành khuẩn lạc. Vì vậy, số lượng khuẩn lạc
đếm được gần như tương đương với số lượng tế bào sống.
Cách thực hiện:
Cấy tăng sinh: Lấy một vịng que cấy vi khuẩn từ thạch nghiêng CP cấy vào một bình NB (20ml) (nhân giống cấp 1), lắc ở nhiệt độ phịng trong 48giờ.
Từ bình tăng sinh, dùng pippette vơ trùng hút một thể tích canh khuẩn đem pha lỗng sao cho mật độ tế bào ở OD540 ~ 0,1. Sau đĩ cấy dịch pha lỗng này sang các bình mơi trường NB khác đã được chỉnh pH thích hợp (pH2 và pH 7) (tỉ lệ 1%).
Khảo sát sinh khối sau 0 giờ, 8 giờ, 16 giờ, 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ và 48 giờ. Sau mỗi thời gian quy định như trên, hút từ mỗi bình 5ml. Pha lỗng dịch huyền phù tế bào ở các nồng độ thích hợp 10-1, 10-2, 10-3... Đem đo OD ở bước sĩng 540nm. Chiếu lên đường cong chuẩn để tính được mật độ tế bào (CFU/ml). Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Kết quả sau khi tính tốn được ghi nhận vào bảng bố trí thí nghiệm sau:
Bảng 2.1. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của B.subtilis CFU/ml Trạng thái nuơi pH 0 giờ 8 giờ 16 giờ 24 giờ 32 giờ 40 giờ 48 giờ 2 Lắc 7
Các đặc điểm sinh hĩa của vi khuẩn B.subtilis|22|
¾ Nitratase dương tính
¾ Protease dương tính
¾ Amylase dương tính
2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái, hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi
Phương pháp làm tiêu bản phịng ẩm để quan sát nấm sợi Linh chi |4|
- Đặt vào đáy hộp petri một tờ giấy thấm, đặt tiếp lên đĩ một miếng lame. Đậy lại, gĩi giấy và đem khử trùng.
- Đun chảy mơi trường dinh dưỡng PGA đã khử trùng trong ống nghiệm.
- Mở hé nắp đĩa petri gần ngọn lửa đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên miếng lame sao cho thạch chảy dài thành một lớp mỏng một bên của tấm lame.
- Khi thạch trên lame đã đặc lại, nhỏ nước cất vơ trùng thấm đều tờ giấy thấm mà khơng tràn lên lame.
- Dùng que cấy mĩc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm sợi rồi chấm lên phần thạch của miếng lame trong phịng ẩm.
- Hộp được gĩi giấy và nuơi ủở nhiệt độ phịng 2-3 ngày. - Mở hộp petri và lấy lame bên trong ra.
- Dùng giấy thấm chùi mặt đáy của lame.
- Đậy lamelle lên chỗ cĩ khuẩn lạc mọc và đặt dưới kính hiển vi để quan sát mẫu.
Phương pháp xác định các hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi |20|
¾ Định tính saponin bằng phương pháp hĩa học
Phản ứng Liebermann-Burchard
Cho vào ống nghiệm khoảng 0,5g dược liệu, thêm 5ml cồn 70o và đun cách thủy trong 5 phút. Lọc qua bơng vào một chén sứ, cơ trên bếp cách thủy đến cặn thật khơ.
Cho vào cặn này 1ml anhydrid acetic và 1 ml CHCl3, khuấy kỹ cho tan, Lọc bằng pipet Pasteur bịt bơng, cho vào một ống nghiệm thật khơ. Để ống nghiệm trên giá, nghiêng giá và dùng pipet cho thật nhẹ nhàng khoảng 0,5ml H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. Mặt ngăn cách giữa 2 lớp sẽ cĩ màu từ nâu tới đỏ, đỏ-tím hay tím. Quan sát đồng thời lớp dung dịch phía trên cĩ thể cĩ màu xanh lá, xanh rêu, vàng- nâu, nâu-đỏ…
¾ Định tính alkaloid
Chuẩn bị mẫu: ngâm bột nguyên liệu trong dung dịch H2SO4 lỗng 1%, sau đĩ cho lên nồi đun cách thủy 15 phút. Lọc nước chiết. Từ đây cĩ thể định tính được alkaloid.
Cách tiến hành:
Dùng các loại thuốc thử sau:
Thuốc thử Mayer: 1.35g HgCl2 hịa tan trong 100ml dung dịch KI 5%. Các alkaloid sẽ tủa vơ định hình màu trắng vàng.
Thuốc thử Wagner: hịa tan 5g I2 trong 100ml dung dịch KI 10%. Các alkaloid cho tủa màu nâu sáng đến nâu đen (phần lớn ở dạng tủa bơng hoặc bột, đơi khi tạo thành giọt dầu cĩ màu nâu đen).
¾ Định tính steroid
Phản ứng Salkowki:
Hịa tan 1-2mg mẫu trong CHCl3 và nhỏ vào 1ml H2SO4 đậm đặc. Phản ứng dương tính là cho màu đỏ sẫm, xanh, xanh tím
Phương pháp khảo sát sự ảnh hưởng của nấm Linh chi đến sự phát triển của B.subtilis |24|
Đối tượng:
Vi khuẩn Bacillus subtilis
Cách tiến hành:
- Đổ mơi trường lên đĩa petri vơ trùng
- Dùng que cấy vịng cấy chuyền một ít sinh khối vi khuẩn từống giống qua các ống nghiệm chứa nước muối sinh lý vơ trùng
- Dùng pipetteman hút 0,1ml dịch vi khuẩn ở trên vào các đĩa mơi trường. - Trải đều bằng que gạt thủy tinh.
- Đặt lên mỗi đĩa 3 miếng sinh khối sợi nấm, đường kính mỗi miếng 1cm. - Ủ qua đêm ở nhiệt độ phịng.
- Quan sát kết quả thu được
2.2.2. Nội dung 2. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của các vi sinh vật sử
dụng theo thời gian
2.2.2.1. Enzyme amylase của B.subtilis|12|
Nguyên tắc:
Hoạt tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp Smith và Roe (1966). Hoạt tính amylase biểu thị khả năng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50oC và được thể hiện bằng sốđơn vị của enzyme đĩ trong một gam mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột cịn lại chưa bị phân hủy sẽ tạo phản ứng với iod và được đo bằng máy so màu quang học.
Dụng cụ và hĩa chất: Máy đo quang phổ. Bểổn nhiệt. Dung dịch đệm phosphate (pH 6,2) Dung dịch tinh bột 1% Dung dịch Lugol Dung dịch HCl 1N Dung dịch NaCl 3% Tiến hành:
Dùng các ống nghiệm cĩ đánh dấu sẵn và tiến hành cho vào các ống nghiệm các dung dịch và hĩa chất
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm định lượng enzyme amylase
Ống chuẩn Ống thử
1 ml nước cất 1 ml dịch enzyme các mẫu 1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml dung dịch tinh bột 1% 1 ml dung dịch tinh bột 1% 0,5 ml dung dịch NaCl 3% 0,5 ml dung dịch NaCl 3%
Đem ủ ở nhiệt độ 50oC trong 30 phút, sau đĩ cho mỗi ống 1 ml dung dịch HCl 1N để kiềm hãm sự hoạt động của enzyme. Cho nước cất đến 10 ml mỗi ống. Cho tiếp một giọt dung dịch Lugol vào mỗi ống. Đem đo mật độ quang ở bước sĩng 595 nm.
Đơn vị hoạt tính của enzyme amylase được tính theo cơng thức:
a: mật độ quang học của ống chuẩn. L: hệ số pha lỗng
b: mật độ quang học của ống thử. m: trọng lượng (g) hoặc thể tích (ml) mẫu. C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (10 mg).
UI = (a-b) × C × L a × t × m
2.2.2.2. Enzyme protease của B.subtilis|6|
Nguyên tắc:
Dùng protein casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sởđịnh lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản
ứng màu với thuốc thử Folin.
Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng enzyme.
Dụng cụ hĩa chất: Ống nghiệm. Giấy lọc. Bểổn nhiệt. Máy đo quang phổ. HCl 0,1M. H3PO41/30M Dung dịch trichloroacetic 5% Dung dịch đệm phosphat pH = 6,2. NaCl 2M Na2CO3 0,4M. Tyrosin tinh khiết. NaOH 0,1N Ca(CH3COOH)2 0,2M Dung dịch casein 1%. Thuốc thử Folin. Tiến hành: Dựng đường chuẩn:
Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 µg tyrosin / 1 ml HCl 0,1M. Thêm 5 ml Na2CO3 0,4M vào 1 ml dung dịch tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha lỗng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều đểổn định dung dịch ở 37±0,5oC trong 20 phút.
Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sĩng 660 nm (ghi nhận kết quả AS10, AS20, AS30, AS40, AS50.)
Ống đối chứng: dùng 1 ml HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sĩng 660 nm (ghi nhận kết quả này AS0).
Dựng đường chuẩn theo hàm lượng µg tyrosin và độ hấp thụ:
Định lượng enzyme trong mẫu:
Cho 1ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37±0,5oC trong 15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme vào, lắc đều, ủ hỗn hợp này
ở nhiệt độ 37±0,5oC trong 60 phút. Sau đĩ cho vào hỗn hợp này 2ml dung dịch trichloroacetic (TCA) 5%. Để ổn định nhiệt trong 25 phút, sau đĩ lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc. Cho thêm thuốc
5 + 20 10 F = AS10 – AS0 + AS20 – AS0 30 AS30 – AS0 + 40 AS40 – AS0 50 AS50 – AS0 + + 5
thử Folin đã pha lỗng 5 lần vào hỗn hợp, để yên ở 37±0,5oC trong 20 phút. Khi xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sĩng 660nm.
Mẫu đối chứng: lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tựở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện.
Tính kết quả:
Một đơn vị hoạt tính enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra một lượng amino acid tương đương với 100µg tyrosin trong 1ml dịch lọc trong điều kiện thí nghiệm.
Hoạt tính enzyme protease:
ĐVHT/g hoặc ml dung dịch enzyme = A60 – A0 × F × n × 1/100 A60: độ hấp thụ của mẫu.
A0: độ hấp thụ của mẫu đối chứng.
F: hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosin và độ hấp thu ở bước sĩng 660nm trên đường chuẩn.
n: hệ số pha lỗng mẫu. 1/100: hệ số chuyển đổi.
2.2.2.3. Enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) của nấm sợi Linh chi |6|
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5 và 40°C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác
định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kếở mức bước sĩng 540 mm. Dựng đường glucose chuẩn:
Hịa tan 100 mg glucose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình
định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây:
Bảng 2.3. Đường glucose chuẩn
Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độglucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dd glucose (1mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 - ml DNS – Lactose 2 2 2 2 2 2 2 - ml nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Lắc đều ống nghiệm, đem đun sơi cách thủy trong 15 phút . Làm lạnh đến nhiệt
độ phịng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sĩng 540 mm.
Xác định hoạt tính của enzyme carboxymethyl cellulase (CM Case):
Ống nghiệm 1: Chỉnh quang phổ kế vềđộ hấp thụ bằng 0.
+ Hút 1 ml dung dịch đệm Na-acetate 50 mH, pH 5 cho vào ống nghiệm đểở 40°C/5 phút.
+ Thêm 2 ml dung dịch DNS Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. + Thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều.
+ Đun sơi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phịng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụở bước sĩng 540 nm bằng 0.
Ống nghiệm 2: phản ứng enzyme.
+ Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 40°C/5 phút. Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 40°C/5 phút.
+ Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Để phản
ứng ở 40oC chính xác 10 phút.
+ Thêm 2 ml dung dịch DNS – Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme.
+ Đem đun sơi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phịng trong chậu nước mát. Đo độ hấp thụở bước sĩng 540 nm (AT).
Ống nghiệm 3: khơng cĩ phản ứng enzyme.
+ Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 40°C/5 phút. Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng của dung dịch CMC 1% thích hợp ở 40°C/5 phút.
+ Thêm 2 ml dung dịch DNS – Lactose và lắc đều.
+ Thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều.
+ Đem đun sơi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phịng trong chậu nước mát. Đo độ hấp thụở bước sĩng 540 nm (AB).
Định nghĩa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phĩng
đường khử glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới điều kiện phản
ứng.
Kết quả:
Giá trị F = 0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 +...+ 0,6/AG0,6
CMCase UI/g = (AT – AB) x F (1000/198) + (1/10phút) x (1/1,0ml) x (1/C)
AT : Độ hấp thụ của dung dịch cĩ phản ứng enzyme.
AB : Độ hấp thụ của dung dịch khơng cĩ phản ứng enzyme F : yếu tố glucose (mg/ml)
1000 : chuyển mg thành µg.
198 : phân tử lượng của glucose monohydrat, chuyển µg thành µmol. 10 : thời gian phản ứng (phút).
1.0 : thể tích dung dịch enzyme (ml). C : Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml).
2.2.3. Nội dung 3. Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm
Quy trình chế biến “phomai” từ okara Bước 1: xử lý nguyên liệu
- Thí nghiệm 3.1: xay mịn bột okara (lọc qua rây) + Xay khơ
+ Xay ướt
Cĩ và khơng cĩ bổ sung BHT
- Thí nghiệm 3.2: xác định độẩm: okara được làm ẩm bằng nước với các độ ẩm khác nhau: bột okara:nước = 1:1, 1:2, 1:3, 1:4
- Thí nghiệm 3.3: khảo sát khả năng biến tính nguyên liệu của một số tác nhân: + Nồng độ K2CO3: 0%, 2%, 4% so với chất khơ
+ Nồng độ muối polyphosphate (so với chất khơ):