Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5 và 40°C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác
định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kếở mức bước sĩng 540 mm. Dựng đường glucose chuẩn:
Hịa tan 100 mg glucose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình
định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây:
Bảng 2.3. Đường glucose chuẩn
Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độglucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dd glucose (1mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 - ml DNS – Lactose 2 2 2 2 2 2 2 - ml nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Lắc đều ống nghiệm, đem đun sơi cách thủy trong 15 phút . Làm lạnh đến nhiệt
độ phịng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sĩng 540 mm.
Xác định hoạt tính của enzyme carboxymethyl cellulase (CM Case):
Ống nghiệm 1: Chỉnh quang phổ kế vềđộ hấp thụ bằng 0.
+ Hút 1 ml dung dịch đệm Na-acetate 50 mH, pH 5 cho vào ống nghiệm đểở 40°C/5 phút.
+ Thêm 2 ml dung dịch DNS Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. + Thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều.
+ Đun sơi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phịng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụở bước sĩng 540 nm bằng 0.
Ống nghiệm 2: phản ứng enzyme.
+ Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 40°C/5 phút. Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 40°C/5 phút.
+ Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Để phản
ứng ở 40oC chính xác 10 phút.
+ Thêm 2 ml dung dịch DNS – Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme.
+ Đem đun sơi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phịng trong chậu nước mát. Đo độ hấp thụở bước sĩng 540 nm (AT).
Ống nghiệm 3: khơng cĩ phản ứng enzyme.
+ Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 40°C/5 phút. Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng của dung dịch CMC 1% thích hợp ở 40°C/5 phút.
+ Thêm 2 ml dung dịch DNS – Lactose và lắc đều.
+ Thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều.
+ Đem đun sơi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phịng trong chậu nước mát. Đo độ hấp thụở bước sĩng 540 nm (AB).
Định nghĩa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phĩng
đường khử glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới điều kiện phản
ứng.
Kết quả:
Giá trị F = 0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 +...+ 0,6/AG0,6
CMCase UI/g = (AT – AB) x F (1000/198) + (1/10phút) x (1/1,0ml) x (1/C)
AT : Độ hấp thụ của dung dịch cĩ phản ứng enzyme.
AB : Độ hấp thụ của dung dịch khơng cĩ phản ứng enzyme F : yếu tố glucose (mg/ml)
1000 : chuyển mg thành µg.
198 : phân tử lượng của glucose monohydrat, chuyển µg thành µmol. 10 : thời gian phản ứng (phút).
1.0 : thể tích dung dịch enzyme (ml). C : Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml).