nghiên cứu chế biến thực phẩm chức năng từ bã đậu nành (okara) và cám gạo bằng công nghệ vi sinh

Với khả năng hoạt động mạnh của enzyme cellulase từ hệ sợi nấm Linh chi Ganoderma lucidum có thể thủy phân cellulose trong bã đậu nành và cám gạo, cùng enzyme amylase và protease từ Baci

Tr ần Thị Thảo Nguyên

NĂNG TỪ BÃ ĐẬU NÀNH (OKARA) VÀ CÁM

LU ẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành ph ố Hồ Chí Minh-2014

Tr ần Thị Thảo Nguyên

NĂNG TỪ BÃ ĐẬU NÀNH (OKARA) VÀ CÁM

Có được thành quả như ngày hôm nay, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu

sắc đến:

• Cán bộ hướng dẫn: TS Lê Chiến Phương đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn cũng như những kinh nghiệm quý báu trong

suốt quá trình thực hiện luận văn

• Ban giám hiệu trường ĐHSP TP.HCM, quý thầy cô bộ môn vi sinh vật

đã giảng dạy, hướng dẫn để tôi có được nền kiến thức như ngày hôm nay

• Các anh chị em phòng thí nghiệm Biến đổi sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

• Các bạn học viên cao học niên khóa 2012-2014 ngành Vi sinh vật đã giúp đỡ, động viên, đóng góp ý kiến cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn

• Cuối cùng tôi xin cám ơn ba mẹ và những người thân yêu đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, tháng 09, năm 2014

Trần Thị Thảo Nguyên

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác

Tác giả luận văn

Trần Thị Thảo Nguyên

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các sơ đồ

Danh mục các đồ thị

M Ở ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Thực phẩm chức năng 4

1.2 Nguyên liệu sử dụng trong đề tài 4

1.2.1 Bã đậu nành (Okara) 4

1.2.2 Cám gạo 6

1.2.3 Chất xơ và vai trò của chất xơ trong bã đậu nành và cám gạo 7

1.2.4 Những nghiên cứu và ứng dụng của bã đậu nành và cám gạo 9

1.3 Các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài 11

1.3.1 Nấm Linh chi 11

1.3.2 Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus natto 16

1.4 Sấy chân không 21

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Vật liệu 23

2.1.1 Hóa chất 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 26

2.2.2 Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm 38

2.2.3 Phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm 41

2.2.4 Phương pháp định tính một số HCSH của nấm sợi Linh chi 51

2.2.5 Phương pháp định lượng Ba tổng số và bào tử Ba trong sản phẩm .52

2.2.6 Phương pháp kiểm tra vệ sinh an toàn toàn thực phẩm 53

2.2.7 Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm 54

2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 56

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 57

3.1 Kết quả nghiên cứu vi sinh vật 57

3.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa của nấm sợi Linh chi 57

3.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của Ba, Bn 58

3.1.3 Kết quả xác định hoạt tính hệ enzyme của vi sinh vật sử dụng trong đề tài theo thời gian 62

3.2 Kết quả chế biến sản phẩm 66

3.2.1 Kết quả thủy phân xơ của hỗn hợp bã đậu nành và cám bằng các enzyme của tơ nấm Linh chi 66

3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein, tinh bột trên cơ chất bã đậu nành và cám gạo bằng các enzyme của Ba 67

3.2.3 Kết quả phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm 71

3.2.5 Kết quả định lượng Ba tổng số và bào tử Ba trong sản phẩm 74

3.2.6 Hoạt tính enzyme có trong 1g sản phẩm 75

3.2.7 Kết quả kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm 75

3.2.8 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm 75

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 79

PHỤ LỤC 1

Ba

Bn

CMC CMCase

CP

CFU/ml (g)

DNS

HCSH MPN NL

NNH3 Nformol NtsOD

SP

Bacillus amyloliquefaciens Bacillus natto Carboxymethyl cellulose Enzyme carboxymethyl cellulase Môi trường cá peptone

Số đơn vị khuẩn lạc trong 1ml hoặc 1g mẫu Acid 2-hydroxy-3,5 dinitrobenzoic

Hoạt chất sinh học

Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất

Nguyên liệu Đạm ammoniac Nitơ formol Nitơ tổng số

Mật độ quang học

Sản phẩm

Bảng 1.1 Thành phần bã đậu nành (100g)………6

Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo……… 7

Bảng 1.3 Điều kiện cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi………… 13

Bảng 1.4 Thành phần hoạt chất cơ bản và hoạt tính dược lý trong nấm Linh chi……… 14

Bảng 2.1 Đường glucose chuẩn……… 33

Bảng 2.2 Đường chuẩn tyrosine……….36

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm định lượng enzyme amylase……… 38

Bảng 2.4 Chỉ tiêu và giới hạn vi sinh trong ngũ cốc và sản phẩm chế biến từ ngũ cốc……… 54

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Ba và Bn………59

Bảng 3.2 Kết quả mật độ tế bào theo thời gian……… 60

Bảng 3.3 Sự biến thiên hoạt tính CMCase của nấm sợi Linh chi theo thời gian………62

Bảng 3.4 Sự biến thiên hoạt tính protease của Ba, Bn theo thời gian………63

Bảng 3.5 Sự biến thiên hoạt tính amylase của Ba, Bn theo thời gian………65

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng thủy phân xơ………67

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein………68

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột………69

Bảng 3.9 Kết quả phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm………71

Bảng 3.10 Kết quả định lượng Ba tổng số và bào tử Ba trong sản phẩm… 74

Bảng 3.11 Hoạt tính enzyme có trong 1g sản phẩm……… 75

Bảng 3.12 Kết quả kiểm tra vệ sinh an toàn toàn thực phẩm……….75

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát………76

Bảng 3.14 Các tham số đặc trưng……… 76

Hình 1.2 Cám gạo……….6

Hình 1.3 Lớp cám trong hạt lúa……….……… 6

Hình 1.4 Cellulose………8

Hình 1.5 Hemicellulose………9

Hình 1.6 Pectin……….9

Hình 1.7 Sự thủy phân các polysaccharide………11

Hình 1.8 Nấm Linh chi……… 11

Hình 1.9 Chu trình sống của Linh chi………12

Hình 1.10 Hình thái Ba ……… 17

Hình 1.11 Hình thái Bn ……… 17

Hình 1.12.Cấu trúc và bề mặt Bacillus………….……… 18

Hình 3.1 Hệ sợi nấm Linh chi trên môi trường thạch………57

Hình 3.2 Hình thái sợi nấm Linh chi trên tiêu bản phòng ẩm (100x)………57

Hình 3.3 Khả năng thủy phân cellulose……….57

Hình 3.4 Khuẩn lạc Ba (trái),Bn (phải)……….58

Hình 3.5 Tế bào Ba (trái),Bn (phải)……… 58

Hình 3.6 Khả năng thủy phân casein của Ba (trái), của Bn (phải)………….61

Hình 3.7 Khả năng thủy phân fibrin của Ba (trái), của Bn (phải)………… 62

Hình 3.8 Khả năng thủy phân tinh bột của Ba (trái), của Bn (phải)……… 62

Hình 3.9 Bịch cơ chất sau 9 ngày nuôi tơ nấm Linh chi………66

Hình 3.10 Mặt cắt đôi khối cơ chất sau 9 ngày nuôi tơ nấm Linh chi …… 66

Hình 3.11 Định tính saponin……… 73

Hình 3.12 Định tính steroid………73

Hình 3.13 Định tính alkaloid……… 73

Hình 3.14 Định tính triterpenoid………74

Hình 3.15 Sản phẩm dạng bột………75

Sơ đồ 1.1.Quy trình thu nhận bã đậu nành từ công nghệ sản xuất sữa………5 Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm………36

Đồ thị 3.1 Đường cong sinh trưởng của Ba, Bn trên môi trường sữa đậu nành

60

Đồ thị 3.2 Sự biến thiên hoạt tính CMCase của nấm sợi Linh chi theo thời gian 63

Đồ thị 3.3 Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của Ba, Bn theo thời gian 64

Đồ thị 3.4 Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của Ba, Bn theo thời gian 65

Đồ thị 3.5 Hàm lượng Nformol theo thời gian và tỉ lệ giống Ba sử dụng 68

Đồ thị 3.6 Hàm lượng tinh bột theo thời gian và tỉ lệ giống Ba sử dụng 70

Đồ thị 3.7 Kết quả phân phối tần suất 76

MỞ ĐẦU

1 Lí do ch ọn đề tài

Bã đậunành (okara)và cám gạo là hai nguồn phụ phế phẩm dồi dào của ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành và xay xát gạo ở nước ta Trong hai

loại phụphế phẩm này còn chứa rất nhiều thành phần dinh dưỡng,theo Vander

và cộng sự[32], hàm lượng protein trong bã đậu nành chiếm 25,4-25,8%, xơ thô chiếm 52,8-58,1% cùng một lượng lớn lipid và carbonhydrate Cám gạo chiếm 65% chất dinh dưỡng của gạo trong đó 28% là carbohydrate,13,3% là protein, chất xơ chiếm 21%, lipid 21% và nhiều loại vitamin nhóm B, E [36]

Do hàm lượng xơ cao và thành phần protein, tinh bột trong bã đậu nành

và cám gạo là những thành phần không tan, khó tiêu hóa đặc biệt trong cám

gạo chứa một lượng lớn lipid rất dễ bị oxi hóa gây khó khăn trong việc chế

biến và bảo quản vì vậy, hiện nay chúng vẫn chưa được tận dụng hiệu quả mà

chủ yếu được dùng làm thức ăn cho ngành chăn nuôi

Với khả năng hoạt động mạnh của enzyme cellulase từ hệ sợi nấm Linh

chi (Ganoderma lucidum) có thể thủy phân cellulose trong bã đậu nành và cám gạo, cùng enzyme amylase và protease từ Bacillus amyloliquefaciens (Ba)có thể thủy phân tinh bột và protein có trong nguyên liệu, biến các chất không tan, khó tiêu hóa thành những chất dễ hấp thu, đồng thời chứa các enzyme hỗ trợ tiêu hóa (cellulase, amylase, protease), dược chất từhệ sợi nấm Linh chi và cả sinh khối của Linh chi và vi khuẩn Ba, có thể biến những

nguồn nguyên liệu rẻ tiền thành sản phẩm có thể dùng làm thực phẩm chức năng góp phần bảo vệ sức khỏe con người, Do đó, việc thực hiện đề tài

“Nghiên c ứu chế biến thực phẩm chức năng từ bã đậu nành (okara) và cám gạo bằng công nghệ vi sinh” là điều hết sức cần thiết và có ý nghĩa thực

tiễn

2 M ục tiêu

Tạo thực phẩm dạng bột dùng ngay có thể được sử dụng làm thực phẩm

chức năng chứa các enzyme hỗ trợ tiêu hóa: amylase, protease, cùng sinh khối

của Ba; đặc biệt là cellulase cùng các hoạt chất sinh học (HCSH) có dược tính

từ sinh khối tơ nấm Linh chi từ bã đậu nành và cám gạo bằng công nghệ vi sinh

3 Nhi ệm vụ

- Nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi và sinh khối các vi khuẩn Ba, Bacillus natto (Bn) trong các môi trường dịch thể và khảo sát hoạt tính các enzyme cellulase của nấm sợi Linh Chi, amylase và protease của Ba, Bn

- Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của bã đậu nành và cám gạo thông qua việc nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi trên hai nguyên liệu nói trên

- Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột và protein của bã đậu nành và cám bằng việc nuôi vi khuẩn Ba, Bn trên hai nguyên liệu đó

- Tạo sản phẩm dạng bột

- Định tính các HCSH của sinh khối tơ nấm Linh chi trong sản phẩm

- Định lượng các chất trong sản phẩm: cellulose, protein (NTS, NNH3,

NNH2), đường tổng, đường khử

- Định lượng vi sinh vật

- Xác định hoạt tính enzyme cellulase, amylase, protease

- Đánh giá an toàn vệ sinh thực phẩm

- Đánh giá cảm quan sản phẩm

4 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm Linh chi, Ba, Bndo phòng thí nghiệm Công nghệ biến

đổi Sinh học – Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung cấp

Bã đậu nành mua tại công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk

Cám gạo mua loại cám mịn lấy ngay sau khi xay, tại nhà máy xay lúa

Bảy Đạm, Long An

5 Ý nghĩa của đề tài

Tận dụng được các phụ phế phẩm công nghiệp để chế biến được các loại

sản phẩm có giá trị gia tăng cao, có thể làm thực phẩm chức năng góp phần

bảo vệ sức khỏe con người

6 Th ời gian, địa điểm thực hiện đề tài

Dự kiến thời gian: từ11/2013 đến tháng 08/2014

Địa điểm thực hiện đề tài: phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh

học – Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Th ực phẩm chức năng

Một số khái niệm về thực phẩm chức năng[35]:

Cho đến nay chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ

về thực phẩm chức năng, mặc dù đã có nhiều Hội nghị quốc tế và khu vực về

thực phẩm chức năng Gần đây các định nghĩa về thực phẩm chức năng được đưa ra nhiều hơn và có xu hướng gần thống nhất với nhau

- Hiệp Hội thông tin thực phẩm quốc tế (International Food Information Council), định nghĩa: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm mang đến những

lợi ích cho sức khỏe vượt xa hơn dinh dưỡng cơ bản”

- Hiệp Hội nghiên cứu thực phẩm Leatherhead (châu Âu): “Thực phẩm

chức năng là thực phẩm được chế biến từ thức ăn thiên nhiên, được sử dụng như một phần của chế độ ăn hàng ngày và có khả năng cho một tác dụng sinh

lý nào đó khi được sử dụng”

- Bộ Y tế Việt Nam: Thông thư số 08/TT-BYT ngày 23/8/2004 về việc

“Hướng dẫn việc quản lý các sản phẩm thực phẩm chức năng” đã đưa ra định nghĩa: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các

bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh”

Khái quát lại có thể đưa ra một định nghĩa như sau: “Thực phẩm chức năng (TPCN) là thực phẩm (hoặc sản phẩm) dùng để hỗ trợ (phục hồi, duy trì

hoặc tăng cường) chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật”

1.2 Nguyên li ệu sử dụng trong đề tài

1.2.1 Bã đậu nành (Okara)

1.2.1.1 Giới thiệu về bã đậu nành

Bã đậu nành hay còn được gọi là okara hoặc soy-pulp (okara đã trở thành thuật ngữ quốc tếđể gọi bã đậu nành) là

phần bãvà các chất dinh dưỡng khác không tan trong nước còn lại sau khi đã tách khỏi dịch các chất tan hoặc huyền phù trong nước, của công nghiệp sản

xuất sữa đậu nành hay đậu hũ [9]

Bã đậu nành có màu trắng hay trắng ngà, thường nằm trên mặt lưới lọc

sữa đậu nành, sau sấy khô có màu vàng, chứa một lượng lớn protein (chiếm khoảng 50% protein tinh chất), carbohydrate, lipid, có cả calci, sắt, riboflavin [9]

Quy trình thu nhận bã đậu nành từ công nghệ sản xuất sữa đậu nành

Sơ đồ 1.1 Quy trình thu nhận bã đậu nành từ công nghệ sản xuất sữa

H ạt đậu nành Ngâm nước nóng đối lưu (5 phút, 85-900C)

Nghi ền Trích ly

1.2.1.2 Thành ph ầnbã đậu nành

Ở Việt nam, theo các thông tin của công ty sữa Vinamilk cung cấp cho

Viện Sinh học Nhiệt đới, nơi có công nghệ sản xuất sữa đậu nành tận thu bã đậu nành hiện đại của nước ngoài thì bã đậu nành có thành phần như sau[19]:

Bã đậu nành dạng bột có hàm ẩm: 6,7%; đạm: 36,43%; xơ: 1,99% và

chất béo: 10,59%

Tại công ty Tribeco theo quy trình sản xuất sữa đậu nành lọc sữa 1 lần

chỉ thu được khoảng 50% protein của hạt đậu nành Từ 1kg đậu nành thu được 1,5kg bã đậu nành ướt (sau ly tâm), chứa khoảng 20% chất khô Bã ướt

là dạng phế liệu cuối cùng của công nghệ sản xuất sữa đậu nành và mới chỉ được sử dụng cho chăn nuôi[11]

Theo một số nghiên cứu ngoài nước thành phần bã đậu nành như sau [32],[33]:

1.2.2.1 Giới thiệu về cám gạo

Hình 1.2 Cám g ạoHình 1.3 Lớp cám trong hạt lúa[36]

Trong qui trình xay xát và chế biến gạo, sau khi thu được sản phẩm chính là gạo thì còn một sản phẩm phụ chiếm khoảng 65% chất dinh dưỡng

của gạo, có giá trị sử dụng khá cao nhưng giá thành lại rất thấp đó chính là cám gạo

Cám gạo là hỗn hợp các lớp vỏ ngoài của hạt gạo và lớp aleurone thường

có dạng bột, mềm và mịn

Hàng năm trên thế giới có khoảng 40–45 triệu tấn cám gạo được sản

suất, trong đó 90% là nằm ở châu Á[36], [37]

1.2.2.2 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo

B ảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo[38]

1.2.3 Ch ất xơ và vai trò của chất xơ trong bã đậu nành và cám gạo

Chất xơ gồm các phần còn lại của tế bào thực vật, các polysaccharide, lignin và các chất liên quan chịu được sự thủy phân của các enzyme trong hệ tiêu hóa người Tùy theo độ phân tán trong nước mà chất xơ được chia thành hai loại là tan và không tan Tất cả các thức ăn có nguồn gốc từ thực vật đều

có cả hai loại chất xơ này

Trong bã đậu nành hàm lượng xơ không tan chiếm đa số, các xơ tan thì chiếm với hàm lượng thấp Chất xơ trong cám gạo có thể từ lớp aleurone,

những lớp vỏ bên ngoài của cám gạo và cũng có thể từ các chất bẩn trên vỏ

gạo (cellulose, lignin và silica)[41]

Xơ không tan:chủ yếu là cellulose, ngoài ra còn có hemicellulose,

lignin, cutin…Chất xơ không hòa tan có đặc tính thẩm thấu nước trong

ruột,trương lên tạo điều kiện cho chất bã thải dễ thoát ra ngoài

• Cellulose: là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật, được

cấu tạo bởi các β-D glucose-pyranose, các thành phần này liên kết với nhau

bởi liên kết glucose Cellulose không tan trong nước (cả nước nóng và nước

lạnh), tan trong acid và kiềm Khi đun sôi với acid sulfuric đậm đặc, cellulose

sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo nên disaccharide cellobiose.Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng

của người vì không tiêu hóa được ở ống tiêu hóa

Hình 1.4 Cellulose[45]

• Hemicellulose: là nhóm polysaccharide không tan được trong nước,

chỉ tan được trong dung dịch kiềm Hemicellulose cũng là thành phần của thành tế bào thực vật và tồn tại chủ yếu ở các phần như vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu được các monosaccharide thuộc nhóm hexose (như manose, galactose) và nhóm pentose (như arabinose, xilose)

Hình 1.5 Hemicellulose[46]

Xơ tan: gồm pectin, β-glucan, galactose, mannan, gum… Chất xơ hòa

tan khi đi qua ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thu một số chất dinh dưỡng vào máu, và cũng làm tăng độ xốp, mềm của bã thải tiêu hóa

• Pectin: là polysaccharide có nhiều ở quả, củ hoặc thân cây Trong

thực vật, pectin tồn tại dưới hai dạng: dạng protopectin không tan (tồn tại chủ

yếu ở thành tế bào) và dạng hòa tan của pectin (tồn tại ở dịch tế bào) Dưới tác dụng của acid, enzyme protopectinase hoặc khi đun sôi, protopectin chuyển sang dạng pectin hòa tan

1.2.4 Nh ững nghiên cứu và ứng dụng của bã đậu nành và cám gạo

Theo các dữ liệu trên thì trong thành phần bã đậu nành còn lại một lượng

lớn protein và xơ không tan, đây là thành phần khó hấp thu trong hệ tiêu hóa

Trong cám có lượng dinh dưỡng rất caolại cân đối với nhiều lọai vitamin và

chất béo tốt, có nhiều xơ dễ tiêu, được xem là rất tốt cho cả con người tuy nhiên các nhóm béo chưa no của cám rất dễ bị oxi hóa tạo mùi hôi khó chịu

chỉ trong vài giờ sau khi chế biến, thêm vào đó do công nghệ xay xát gạo chưa cao lại ít được đầu tư theo hướng thu cám sạchnên cám thường lẫn rất nhiều loại tạp chất.Do vậy, bã đậu nành và cám thường chủ yếu được dùng làm thức ăn cho các loại gia súc và thủy sản

Trong những năm gần đây chỉ có một số ít công trình nghiên cứu sử

dụng bã đậu nành như:

Vũ Văn Độ và các cộng tác viên nghiên cưu dùng nấm sợi của các loại

nấm lớn (Linh chi – Ganoderma lucidum, Bào ngư – Pleurotus florida) xử lý

okara để chế biến bánh biscuit, trà túi lọc…[7]

Lê Chiến Phương và các cộng tác viên (2004) xử lý okara bằng nấm mốc

Mucor và vi khu ẩn Lactic[16]

Ngô Đại Nghiệp dùng Asp.oryzae chế biến okara thành tương xay

Lại Mai Hương và các cộng tác viên dùng enzyme kết hợp với phương pháp cơ học xử lý cellulose trong okara để sản xuất chế phẩm giàu chất xơ bổ xung vào một số thực phẩm [9]

Và vẫn chưa có sản phẩm nào trong các sản phẩm nêu trên được triển khai ở quy mô sản xuất thử

Riêng cám gạo,hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu,

thử nghiệm và sản xuất tạo các sản phẩm thực phẩm chức năng như BioBran MGN-3 hay Lentinplus, nhờ các loại enzyme từ nấm Đông cô (Shiitake mushroom) thủy phân các polysaccharide thành hemicellulose arabinoxylan

có hoạt tính miễn dịch, phòng chống ung thư hiệu quả[24],[25],[39]

Hình1.7 S ự thủy phânpolysaccharide t ừ cám gạo bởi các enzyme của nấm

Nấm Linh chi đã nổi tiếng từ ngàn xưa ở các nước Á Đông, phiên âm theo tiếng Trung Quốc gọi là Lingzhi, theo tiếng Nhật là reishi, ở Việt Nam thì hay gọi là nấm Lim Nấm Linh chi còn có nhiều tên gọi khác như: Bất lão

thảo, Vạn niên nhung, Mộc Linh chi… nhưng tên Linh chi có lẽ mang tính tiêu biểu và được sử dụng phổ biến hơn cả (tên Linh chi chính thức được sử

dụng trong sách “Thần nông bản thảo” cách đây hơn 2000 năm)

Linh chi thường mọc ký sinh trên các cây gỗ trong nhiều năm Cây gỗ bộ Đậu (Fabales) là những cây chủ ưa thích của chúng, ta thường gặp Linh chi trên các cây Lim, phượng vĩ, so đũa và một số loài cây khác đã chết, mục

hoặc cả trên cây sống như xoài, mít, mãng cầu, phi lao, dừa…

 Vòng đời sinh sản của nấm Linh chi

Phần sinh sản là một lớp ống dày từ 0,2-1,7cm gồm các ống nhỏ, thẳng,

miệng tròn, đảm mang 4 đảm bào tử hình trứng Thực chất đó là do màng phủ

lỗ nảy mầm phồng căng hay lõm thụt vào mà thành Bào tử đảm có cấu trúc

vỏ kép, lõm ở đầu, màu vàng mật ong sáng, kích thước 5-6 x 8,5-12µm

Hình 1.9 Chu trình s ống của Linh chi[17]

Các bào tử đảm đơn bội khi gặp điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo ra hệ

sợi sơ cấp (primary hyphae) Hệ sợi sơ cấp đơn nhân đơn bội nhanh chóng phát triển, phối hợp với nhau tạo ra hệ sợi thứ cấp hay còn gọi là hệ sợi song

hạch, phân nhánh rất mạnh tràn ngập khắp giá thể Lúc này, thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày dễ rụng và khi gặp điều kiện thuận

lợi sẽ cho ra hệ sợi song hạch tái sinh Tiếp sau đó là giai đoạn phân hóa hệ

sợi: các hệ sợi nguyên thủy hình thành các sợi cứng màng dài, ít phân nhánh

bện kết lại thành cấu trúc bó được cố kết bởi các sợi bện phân nhánh rất

mạnh Từ đó hình thành các mầm nấm màu trắng mịn vươn dài thành các trụ tròn mập Phần đỉnh trụ bắt đầu xòe tán, lớp vỏ láng đỏ cam xuất hiện Tán

lớn dần hình thành bào tầng và phát tán bào tử đảm liên tục cho đến khi nấm già sẫm màu, khô tóp và lụi dần trong vòng 3-4 tháng[17]

 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi

B ảng 1.3 Điều kiện cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi[4]

1.3.1.3 Dược tính của nấm Linh chi

Số lượng các chủng loài nấm Linh chi được sử dụng trong công nghệ dược liệu, dược phẩm ngày càng tăng Vào thập niên 70-80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh chi.Một số loài Linh chi đã được phân chất trong đó có G.lucidum… với các nhóm hoạt chất steroid,

triterpenoid, và polysaccharide

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế

UV, IR… đặc biệt là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phổ kế plasma (ICP), đã được xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi

Có thể khái quát trong bảng sau:

Bảng 1.4 Thành phần hoạt chất cơ bản và hoạt tính dược lý trong nấm

Linh chi[17]

Adenosine dẫn xuất Nucleotide Ức chế kết dính tiểu cầu,

thư giản cơ,giảm đau

điều hòa miễn dịch

Lanosporeric acid A Steroide Giảm cholesterol

Ganoderans A, B, C Polysaccharide Hạ đường huyết

Beta-D-Glucan Polysaccharide Chống ung thư,tăng tính

miễn dịch BN-3B: 1, 2, 3, 4 Polysaccharide

chuyển hóa acid nucleic

Ganoderic acids R, S Triterpenoid Trợ tim

Ganoderic acids B,

D, F, H, K, Y

Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE

Ganoderic acids Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp

cholesterol Ganodermadiol Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE Ganodermic acids Mf Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp

cholesterrol Ganodermic acids T,

O

Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp

cholesterrol

Ganosporelacton A Triterpenoid Chống khối u

Oleic acid dẫn xuất Acid béo Ức chế giải phóng histamine

Điều đáng lưu ý là các nhóm hoạt chất này gặp khá phổ biến trong cấu trúc n ấm, trong thể mang bào tử, trong bào tử đảm và trong hệ sợi (Mycelia), trong n ấm tự nhiên hoang dại và nuôi trồng chủ động[17]

1.3.1.4 Công dụng của nấm Linh chi

Từ xưa đến nay, ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước châu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi để giúp tăng cường sức khỏe và kéo dài

tuổi thọ của con người

Trong Dược điển Trung Quốc xuất bản vào năm 2000 đã công bố nấm

Linh chi có tác dụng giảm căng thẳng, giảm ho và hen suyễn, được sử dụng

Trước những lợi ích mà nấm Linh chi mang lại, hiện nay nấm Linh chi

đã được sử dụng trong việc phát triển những phương thuốc điều trị bệnh hoặc các loại thực phẩm chức năng Đã có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành trên động vật, trong các mô hình nuôi cấy tế bào trong các ống nghiệm và đã

chứng minh được những tác động tích cực của nấm linh chi đối với sức khoẻ con người[40]

1.3.1.5 Enzyme cellulasecủa nấm Linh chi

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật, và chúng được thực vật

tổng hợp với số lượng nhiều nhất Trong tự nhiên cellulose chỉ bị phân giải

bởi vi sinh vật có khả năng tiết enzyme cellulase Hệ thống cellulase được phân loại dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc của chúng:

- Exo-1,4-β-glucanase (EC.3.2.1.91.): enzyme cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzyme này không có khả năng phân

giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endo 1,4-β glucanase phân giải chúng Enzyme này còn có các tên gọi khác như: exocellulase,cellobiohydrolase, exoglucanase, cellobiosidase

- Endo 1,4-β-D glucanase (EC 3.2.1.4): enzyme này tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose, trong lichenin và β-D-glucan Sản

phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose Enzyme này còn có các tên gọi khác như: endoglucanase, C-cellulase, 1,4-β-D-glucan-

4

- β-D glucoside glucohydrolase (EC3.2.1.21): thủy phân cellodextrin hòa tan và cellobiose thành glucose Chúng còn được gọi là cellobiase và β- glucosidase[12],[30]

1.3.2 Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus natto

1.3.2.2 Phân bốvà điều kiện sống

Bacilluscó mặt khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm

cỏ nên còn gọi là “trực khuẩn rơm cỏ” Chúng còn phân bố trên bề mặt các

loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt đó.Trong các sản phẩm

thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua), natto,… chúng cũng có mặt và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh

học

Hầu hết các loài thuộc chi Bacillussống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện

Chúng có mức độ thích nghi cao Phần lớn Bacillus là vi khuẩn ưa nhiệt với

nhiệt độ tối thích từ 30–450

C, một số chịu nhiệt lên tới 650

C hoặc ưa lạnh

từ5-250C nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 34-370

Như hầu hết các vi khuẩn Gram dương khác, cấu trúc bề mặt của

Bacillus khá phức tạp và có các đặc tính kết dính và chống chịu điều kiện

khắc nghiệt cao Bề mặt tế bào được cấu tạo bởi các lớp giáp mạc, lớp bề mặt

có tính chất protein (S-layer), một vài lớp lót peptidoglycan và các protein trên mặt ngoài của màng tế bào

Hình 1.12.Cấu trúc và bề mặt Bacillus[44]

C=Capsule; S=S-layer; P=Peptidoglycan

S-layers

Hiện diện trong một số thành viên của giống Bacillus Chức năng chưa

được xác định một cách rõ ràng, nhưng dường như có liên quan đến tính kết dính của vi khuẩn

Giáp mạc (capsules)

Thành phần hóa học của lớp vỏ nhầy ở các vi khuẩn khác nhau cũng khác nhau, thường là được tạo nên từ các polysaccharide, nitrogen, phosphorite và có thể có cả polypeptide, nhưng thành phần chủ yếu vẫn là nước (98%), có nhiệm vụ như một hàng rào thẩm thấu để bảo vệ tế bào chống

lại quá trình khô

Vách t ế bào

Vách tế bào rất mỏng (100-200Å) và trong suốt không màu Vách tế bào

có tính chất đàn hồi và có độ bền rất lớn, có thể chịu được áp suất cao Thành

phần hóa học chủ yếu là glucid, một số chất béo, protide và các acid amin Thành phần hóa học thay đổi tùy loại vi khuẩn và môi trường sống

Tiên mao (flagella)

Hầu hết các vi khuẩn tạo bào tử hiếu khí đều di động nhờ vào các tiên mao, là các sợi lông rất mảnh mọc trên những phần xác định của tế bào vi

khuẩn Nó có cấu trúc là protid Chiều dài tiên mao thường bằng chiều dài tế bào, nhưng cũng có thể dài hơn tùy từng loại vi khuẩn Số lượng và vị trí tiên mao ở các tế bào vi khuẩn khác nhau ở mỗi loài Tiên mao có thể mọc ở một đầu, mọc ở hai đầu, mọc xung quanh…[44]

1.3.2.5.Sự hình thành bào tử

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng tạo bào

tử trong những điều kiện nhất định[6]

Sự hình thành bào tử: vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển sẽ sinh ra bên trong tế bào một thể nghỉ có dạng hình cầu hay hình bầu dục được gọi là bào tử hay nội bào tử Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hoá

chất, kháng áp suất thẩm thấu Trong thời kỳ nghỉ, bào tử vi khuẩn ở trạng thái sống ẩn (cryptopiosis) Bào tử có thể giữ sức sống từ vài năm đến vài

chục năm Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống 200-300 năm của bào tử Bacillus

Các tế bào sinh bào tử khi gặp điều kiện cạn kiệt thức ăn hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử Về mặt hình thái, có thể chia quá trình hình thành bào tử ra thành các giai đoạn:

- Hình thành những búi chất nhiễm sắc

- Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là

tiền

bào tử

- Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ

- Lớp vỏ sơ khai hình thành giữa hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũynhiều PG và tổng hợp DPA, tích lũy calci Tính chiết quang tăng cao

- Kết thúc việc hình thành áo bào tử

- Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử, bắt đầu có tính kháng nhiệt

- Bào nang vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài

1.3.2.6 Hệ enzyme

H ệ enzyme protease [29]

Bacillus tổng hợp protease trung tính và kiềm

Các enzyme protease xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid trong các peptid hoặc protein giúp phân giải protein và các cơ chất cao phân

tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử bé, để vi sinh

Bacilluscó khả năng tạo một lượng lớn ∝ −amylase ngoại bào

Một số nghiên cứu cho thấy lượng enzyme amylase được tạo ra nhiều

nhất trong khoảng pH từ 6,0-9,5 và nhiệt độ từ 32-450

C, đạt cực đại tại pH 9,0

và 420C [23]

Amylase của Bacillus không có các liên kết sulfihidril và có khả năng

phân giải tinh bột nhanh gấp 2-2,5 lần so với ∝ −amylase của nấm mốc

∝ − amylase này thủy phân tinh bột tạo ra các dextrin có mạch dài khoảng 6-8 gốc glucose Các dextrin này lại tiếp tục bị phân giải theo sơ đồ : G8  G2 + G6

Hệ enzyme của Bacillusđược dùng để tạo kháng sinh: eumycin, bacillin,

bacillomin chống được nhiều loại vi trùng gây bệnh.Protease là một trong

những nhóm enzyme công nghiệp quan trọng nhất, chiếm gần 60% tổng lượng enzyme được bán ra, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp tẩy rửa

khô, sản xuất các loại thuốc tiêu hóa, thuốc điều trị các vết thương do bỏng hay do tác nhân virus[18]

Trong thực phẩm, Bacillus đã được sử dụng từ rất lâu trong lịch sử Các

chủng Bacillus được sử dụng trong lên men đậu cocoa từ nhiều thế kỉ và sự lên men đậu tương được thực hiện bởi các chủng Bn tạo ra natto (đậu nành lên

men) đã được sử dụng nhiều ở Nhật trong hàng nghìn năm nay, đặc biệt hơn

nữa chủng Bnđã đượcđưa vào sản xuất tạo các sản phẩm thực phẩm chức

năng với khả năng điều trị tắc nghẽn mạch máu, hỗ trợ tim mạch, điều trị huyết áphiệu quả,…[28]

Với Ba, theo nghiên cứu của Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM, thì

chủngBa là lợi khuẩn, không có tác dụng gây hại cho sức khỏe con người

chúng có khả năng tiết ra enzyme amylase và protease thuỷ phân tinh bột, protein không tan, có chức năng tương tự như Bn.

Trong những năm gần đây đã có một số các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn

Ba trong việc chế biến thực phẩm, thực phẩm lên men,… tạo sản phẩm có giá

trị dinh dưỡng cao Tuy nhiên, chưa có sản phẩm nào được triển khai sản xuất

ở quy mô công nghiệp

1.4 Sấy chân không

Nguyên lý

Phương pháp sấy chân không phụ thuộc vào áp suất điểm sôi của nước

Ở một áp suất nhất định nước sẽ có một điểm sôi nhất định, nếu làm giảm (hạ

thấp) áp suất trong một thiết bị chân không xuống đến áp suất mà ở đây nước trong vật bắt đầu sôi và bốc hơi sẽ tạo nên một dòng chênh lệch áp suất đáng

kể dọc theo bề mặt vật, hình thành nên một dòng ẩm chuyển động theo hướng

từ trong ra bề mặt vật[42]

H ệ thống sấy chân không

Hệ thống sấy chân không gồm buồng sấy, thiết bị ngưng tụ và bơm chân không

Vật sấy được cho vào trong buồn kín, sau đó buồng này được hút chân không Lượng ẩm trong vật được tách ra khỏi vật và được hút ra ngoài[43]

Ưu điểm

Sấy chân không được dùng để sấy các vật liệu, dược liệu quý hiếm như các loại vật liệu có chứa nhiều hàm lượng tinh dầu, hương hoa, dược phẩm, các nông sản thực phẩm có yêu cầu nhiệt độ thấp

Giữ được các tính chất đặc trưng ban đầu: tính chất sinh học, màu sắc, hương vị, hình dạng của sản phẩm[42]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Hóa chất, thiết bị và dụng cụ do Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung

cấp

2.1.1 Hóa chất

- Định tính cellulase:thuốc thử Lugol(0,5g iod + 5g KI, thêm nước cất

cho đủ 200ml),1% carboxymethyl cellulose (CMC)

- Nhuộm Gram: dung dịch Lugol, dung dịch Crystal violet, dung dịch NaCl 0,9%, cồn 960

• Phương pháp thu sợi fibrin:

Dùng 5ml huyết heo: bổ sung 0,5% kalioxalat (K2C2O4.H2O), thêm 150ml NaCl 0,8%, 5ml dung dịch CaCl2 (2,5g/100ml nước cất) Để 10-15 phút Lọc qua giấy lọc Rửa mẫu trên giấy bằng NaCl 0,8% đến khi sợi fibrin không còn máu Đem sấy ở nhiệt độ 400C Sau đó đem đi nghiền mịn

- Định tính amylase:dung dịch Lugol

- Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase):

CMC 1% (w/v): cân 1g CMC, hòa tan trong 80ml dung dịch đệm acetate 50mM, pH 5, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm đến vạch, lắc đều

Na-Dung dịch enzyme: pha loãng dung dịch enzyme với dung dịch đệm acetate 50mM, pH 5 đến độ pha loãng thích hợp

Na-Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS)

Dung dịch lactose

Dung dịch DNS-lactose: trộn 75ml dung dịch DNS với 25ml dung dịch lactose

- Xác định hoạt tính enzyme protease:

HCl 0,1M, H3PO41/30M, trichloroacetic 5%, NaCl 2M,Na2CO3

0,4M,Tyrosin tinh khiết, NaOH 0,1N, Ca(CH3COOH)2 0,2M, casein 1%, thuốc thử Folin, dung dịch đệm phosphat pH 6,2

• Cách pha dung dịch đệm phosphat pH 6,2: trộn 81,5ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M với 18,5ml dung dịch dinatri hydrophosphate:

+ Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M: 27,8 g NaH2PO4 hòa tan,

dẫnnước đến 1000ml

+ Dung dịch dinatri hydrophosphate: 53,05 Na2HPO4.7H2O hoặc 71,1g

Na2HPO4.12H2O hòa tan dẫn nước đến 1000ml

- Xác định hoạt tính enzyme amylase: đệm phosphate pH 6,2, Lugol,HCl 1N, NaCl 3%, tinh bột 1% (1g tinh bột tan, cho vào bình định mức 100ml, thêm 50ml nước cất, lắc đều trong bể cách thủy 10–15 phút, đến khi tinh bột tan hoàn toàn, thêm 10ml dung dịch đệm phosphate 6,2 Thêm nước cất cho

đủ 100ml)

- Xác định hàm lượng Nitơ tổng số (Nts): H2SO4đậm đặc, NaOH 40%,

H2SO4 0,01N, H3BO3 2%, chất xúc tác: K2SO4/CuSO4 (9:1), Thuốc thử tarshiro

• Thuốc thử tarshiro: Trộn xanh methylen 0,1% trong cồn tuyệt đối với methyl đỏ 0,2% trong cồn tuyệt đối theo tỉ lệ 1:2

- Xác định hàm lượng Nitơ formol (Nformol ):

+ Dung dịch formol pha loãng ½ (tỷ lệ1:1) đã trung hòa bằng NaOH 0,1N: lấy 50ml dung dịch formol pha loãng ½, thêm vào vài giọt phenolphtalein 1%, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch có màu

hồng nhạt

+ Dung dịch NaOH 0,1N

+ Chất chỉ thị màu phenolphtalein 1% trong cồn

- Xác định hàm lượng đạm ammoniac (NNH3): MgO khan, H2SO4 0,1N, NaOH 0,1N, phenolphtalein 1%

- Xác định đường tổng: Cồn 960

, cồn 800

, pheno l5%, H2SO4 đậm đặc, đường saccharose 0,1%: 500mg saccharose sấy khô ở 600

C, hòa tan trong 50ml nước cất

- Xác định đường khử:

+ Dung dịch kali ferixianua (K3Fe(CN) 6): hòa tan 1,65 K3Fe(CN)6 và 10g NaNO3 trong 1 lít nước cất Bảo quản dung dịch trong lọ thủy tinh màu nâu Dung dịch sắt sulphate (Fe2(SO4)3): hòa tan 1g Fe2(SO4)3trong 10ml

H2SO4đậm đặc Đổ từ từ dung dịch vào nước cất có sẵn trong bình định mức, pha loãng thành 1000ml

+ Gelatin 10%

+ Trộn lẫn dung dịch Fe2(SO4)3 và gelatin 10% theo tỉ lệ 20:1 Hỗn hợp dung dịch chỉ sử dụng trong ngày

- Xác định tinh bột: HCl 5%, NaOH 5%, Pb(CH3COO)2 10%, Na2HPO4

bão hòa, các thuốc thử dùng xác định đường khử

- Xác định hàm lượng lipid: ether dầu hỏa ether ethylic

- Xác định chỉ số peroxide:acid acetic, KI bão hòa (pha dùng ngay), lắc

kỹ đậy nút cẩn thận, Na2S2O3 0,01N, dung dịch hồ tinh bột 1%, Cloroform

2.1.2 Thi ết bị và dụng cụ

- Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: bình định mức 500ml, 100ml, 50ml, ống nghiệm, becher, erlen, ống đong, pipet, đĩa Petri, buret, phễu lọc, giấy lọc, cối chày sứ,…

- Thiết bị thí nghiệm: tủ cấy, kính hiển vi, máy lắc, tủ hấp, cân điện tử,

bể ổn nhiệt, máy Kjeldahl bán tự động, máy đo quang phổ, tủ lạnh, máy sấy

chân không, tủ sấy, cân phân tích, bình hút ẩm, bếp nung, bình chưng cất,hệ

thống sinh hàn hoàn lưu, máy Soxhlet…

2.1.3 Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng

- Môi trường giữ giống:

+ Ba, Bn: môi trường thạch cá peptone (CP) (nước mắm 300

N 10ml, peptone 5g, agar 10g, nước cất 500ml)

+ Nấm Linh chi: môi trường thạch nước giá (500ml nước giá, 0,5% CMC, 1% glucose)

- Môi trường nhân giống:

+ Ba, Bn: môi trường sữa đậu nành (sữa đậu nành, 3% saccharose)

+ Nấm Linh chi: môi trường dịch nước giá (500ml nước giá + 0,5% CMC + 1% glucose)

- Môi trường định tính:

+ Định tính cellulase: môi trường thạch có bổ sung 1% CMC

+ Định tính protease: môi trường thạch Nutrient Broth có bổ sung 1% casein và môi trường thạch có bổ sung 1% fibrin

+ Định tính amylase: môi trường thạch có bổ sung 1% tinh bột

- Môi trường quan sát hình thái nấm Linh chi:môi trường thạch nước giá ( 500ml nước giá, 0,5% CMC, 1% glucose)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật

2.2.1 1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa của nấm sợi Linh chi

 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái

Quan sát đại thể trên môi trường thạch

Cách ti ến hành:

Cắt miếng sinh khối tơ nấm Linh chi từ ống giống, đặt lên môi trường

thạch nước giá, ủ trong 2–3 ngày, tiến hành quan sát đại thể hệ sợi nấm Linh chi

Quan sát vi th ể tơ nấm Linh chi bằng phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm[5]

- Khi thạch trên lame đã đặc lại, nhỏ nước cất vô trùng thấm đều tờ giấy

thấm mà không tràn lên lame

- Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm sợi rồi chấm lên phần

thạch của miếng lame trong phòng ẩm

- Hộp được gói giấy và nuôi ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày

- Mở hộp Petri và lấy lame bên trong ra

- Dùng giấy thấm chùi mặt đáy của lame

- Đậy lamelle lên chỗ có tơ nấm Linh chi mọc và đặt dưới kính hiển vi

để quan sát mẫu

 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa

Định tính cellulase

Nguyên tắc:

Nấm sợi Linh chi tiết enzyme cellulase phân giải CMC thành các phân

tử bé và các dạng đường khử không cho phản ứng màu với Iod

Cách ti ến hành:

Nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi trong môi trường dịch nước giá Chuẩn

bị môi trường thạch có bổ sung 1% CMC, khoan lỗ thạch Cấy sinh khối tơ

nấmLinh chi và ủ trong 24 giờ, tiến hành nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol

để xác định vòng phân giải

K ết quả:

Phản ứng (+): môi trường xung quanh sinh khối tơ nấm Linh chi không

bắt màu với thuốc thử Lugol

Phản ứng (-): môi trường xung quanh bắt màu với thuốc thử Lugol

2.2.1 2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Ba, Bn

 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái

Phương pháp nhuộm Gram [5]

giữ lại trong tế bào, ngoài ra các vi khuẩn thuộc nhóm này có ít lipid hơn nên khi bắt màu, màu cũng ít bị rửa trôi hơn Vi sinh vật thuộc nhóm này là Gram dương

Nhóm thứ hai có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) nhưng lượng lipid của lớp màng ngoài cao hơn; khi bị tẩy bằng cồn, lipid bị hòa tan nhiều hơn và vi khuẩn mất màu Khi nhuộm bổ sung, chúng sẽ bắt màu thuốc nhuộm mới (đỏ vàng, đỏ tía, hồng) Vi sinh vật nhóm này là Gram

âm

Cách ti ến hành:

- Lau nhẹ sạch tiêu bản bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn