Nguyên lý
Phương pháp sấy chân không phụ thuộc vào áp suất điểm sôi của nước. Ở một áp suất nhất định nước sẽ có một điểm sôi nhất định, nếu làm giảm (hạ thấp) áp suất trong một thiết bị chân không xuống đến áp suất mà ở đây nước trong vật bắt đầu sôi và bốc hơi sẽ tạo nên một dòng chênh lệch áp suất đáng kể dọc theo bề mặt vật, hình thành nên một dòng ẩm chuyển động theo hướng từ trong ra bề mặt vật[42].
Hệ thống sấy chân không
Hệ thống sấy chân không gồm buồng sấy, thiết bị ngưng tụ và bơm chân không.
Vật sấy được cho vào trong buồn kín, sau đó buồng này được hút chân không. Lượng ẩm trong vật được tách ra khỏi vật và được hút ra ngoài[43].
Ưu điểm
Sấy chân không được dùng để sấy các vật liệu, dược liệu quý hiếm như các loại vật liệu có chứa nhiều hàm lượng tinh dầu, hương hoa, dược phẩm, các nông sản thực phẩm có yêu cầu nhiệt độ thấp.
Giữ được các tính chất đặc trưng ban đầu: tính chất sinh học, màu sắc, hương vị, hình dạng của sản phẩm[42].
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu
Hóa chất, thiết bị và dụng cụ do Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung cấp.
2.1.1. Hóa chất
- Định tính cellulase:thuốc thử Lugol(0,5g iod + 5g KI, thêm nước cất cho đủ 200ml),1% carboxymethyl cellulose (CMC).
- Nhuộm Gram: dung dịch Lugol, dung dịch Crystal violet, dung dịch NaCl 0,9%, cồn 960
, safranin.
- Nhuộm bào tử: Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1%, xanh methylen, nước cất.
- Định tính protease: thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, NaCl 0,8%, CaCl22,5%, fibrin.
•Phương pháp thu sợi fibrin:
Dùng 5ml huyết heo: bổ sung 0,5% kalioxalat (K2C2O4.H2O), thêm 150ml NaCl 0,8%, 5ml dung dịch CaCl2 (2,5g/100ml nước cất). Để 10-15 phút. Lọc qua giấy lọc. Rửa mẫu trên giấy bằng NaCl 0,8% đến khi sợi fibrin không còn máu. Đem sấy ở nhiệt độ 400C. Sau đó đem đi nghiền mịn.
- Định tính amylase:dung dịch Lugol.
- Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase):
CMC 1% (w/v): cân 1g CMC, hòa tan trong 80ml dung dịch đệm Na- acetate 50mM, pH 5, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm đến vạch, lắc đều.
Dung dịch enzyme: pha loãng dung dịch enzyme với dung dịch đệm Na- acetate 50mM, pH 5 đến độ pha loãng thích hợp.
Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS). Dung dịch lactose.
Dung dịch DNS-lactose: trộn 75ml dung dịch DNS với 25ml dung dịch lactose.
-Xác định hoạt tính enzyme protease:
HCl 0,1M, H3PO41/30M, trichloroacetic 5%, NaCl 2M,Na2CO3
0,4M,Tyrosin tinh khiết, NaOH 0,1N, Ca(CH3COOH)2 0,2M, casein 1%, thuốc thử Folin, dung dịch đệm phosphat pH 6,2.
•Cách pha dung dịch đệm phosphat pH 6,2: trộn 81,5ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M với 18,5ml dung dịch dinatri hydrophosphate:
+ Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M: 27,8 g NaH2PO4 hòa tan, dẫnnước đến 1000ml
+ Dung dịch dinatri hydrophosphate: 53,05 Na2HPO4.7H2O hoặc 71,1g Na2HPO4.12H2O hòa tan dẫn nước đến 1000ml.
-Xác định hoạt tính enzyme amylase: đệm phosphate pH 6,2, Lugol,HCl 1N, NaCl 3%, tinh bột 1% (1g tinh bột tan, cho vào bình định mức 100ml, thêm 50ml nước cất, lắc đều trong bể cách thủy 10–15 phút, đến khi tinh bột tan hoàn toàn, thêm 10ml dung dịch đệm phosphate 6,2. Thêm nước cất cho đủ 100ml). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Xác định hàm lượng Nitơ tổng số (Nts): H2SO4đậm đặc, NaOH 40%, H2SO4 0,01N, H3BO3 2%, chất xúc tác: K2SO4/CuSO4 (9:1), Thuốc thử tarshiro.
•Thuốc thử tarshiro: Trộn xanh methylen 0,1% trong cồn tuyệt đối với methyl đỏ 0,2% trong cồn tuyệt đối theo tỉ lệ 1:2.
-Xác định hàm lượng Nitơ formol (Nformol ):
+ Dung dịch formol pha loãng ½ (tỷ lệ1:1) đã trung hòa bằng NaOH 0,1N: lấy 50ml dung dịch formol pha loãng ½, thêm vào vài giọt phenolphtalein 1%, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch có màu hồng nhạt
+ Dung dịch NaOH 0,1N
+ Chất chỉ thị màu phenolphtalein 1% trong cồn.
-Xác định hàm lượng đạm ammoniac (NNH3): MgO khan, H2SO4 0,1N, NaOH 0,1N, phenolphtalein 1%.
-Xác định đường tổng: Cồn 960
, cồn 800
, pheno l5%, H2SO4 đậm đặc, đường saccharose 0,1%: 500mg saccharose sấy khô ở 600
C, hòa tan trong 50ml nước cất.
-Xác định đường khử:
+ Dung dịch kali ferixianua (K3Fe(CN) 6): hòa tan 1,65 K3Fe(CN)6 và 10g NaNO3 trong 1 lít nước cất. Bảo quản dung dịch trong lọ thủy tinh màu nâu. Dung dịch sắt sulphate (Fe2(SO4)3): hòa tan 1g Fe2(SO4)3trong 10ml H2SO4đậm đặc. Đổ từ từ dung dịch vào nước cất có sẵn trong bình định mức, pha loãng thành 1000ml
+ Gelatin 10%
+ Trộn lẫn dung dịch Fe2(SO4)3 và gelatin 10% theo tỉ lệ 20:1. Hỗn hợp dung dịch chỉ sử dụng trong ngày.
-Xác định tinh bột: HCl 5%, NaOH 5%, Pb(CH3COO)2 10%, Na2HPO4
bão hòa, các thuốc thử dùng xác định đường khử.
-Xác định hàm lượng lipid: ether dầu hỏa ether ethylic.
-Xác định chỉ số peroxide:acid acetic, KI bão hòa (pha dùng ngay), lắc kỹ đậy nút cẩn thận, Na2S2O3 0,01N, dung dịch hồ tinh bột 1%, Cloroform.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
- Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: bình định mức 500ml, 100ml, 50ml, ống nghiệm, becher, erlen, ống đong, pipet, đĩa Petri, buret, phễu lọc, giấy lọc, cối chày sứ,…
- Thiết bị thí nghiệm: tủ cấy, kính hiển vi, máy lắc, tủ hấp, cân điện tử, bể ổn nhiệt, máy Kjeldahl bán tự động, máy đo quang phổ, tủ lạnh, máy sấy
chân không, tủ sấy, cân phân tích, bình hút ẩm, bếp nung, bình chưng cất,hệ thống sinh hàn hoàn lưu, máy Soxhlet…
2.1.3. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng
- Môi trường giữ giống:
+ Ba, Bn: môi trường thạch cá peptone (CP) (nước mắm 300
N 10ml, peptone 5g, agar 10g, nước cất 500ml).
+ Nấm Linh chi: môi trường thạch nước giá (500ml nước giá, 0,5% CMC, 1% glucose) .
- Môi trường nhân giống:
+ Ba, Bn: môi trường sữa đậu nành (sữa đậu nành, 3% saccharose). + Nấm Linh chi: môi trường dịch nước giá (500ml nước giá + 0,5% CMC + 1% glucose) . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Môi trường định tính:
+ Định tính cellulase: môi trường thạch có bổ sung 1% CMC.
+ Định tính protease: môi trường thạch Nutrient Broth có bổ sung 1% casein và môi trường thạch có bổ sung 1% fibrin.
+ Định tính amylase: môi trường thạch có bổ sung 1% tinh bột.
- Môi trường quan sát hình thái nấm Linh chi:môi trường thạch nước giá ( 500ml nước giá, 0,5% CMC, 1% glucose).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật
2.2.1.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa của nấm sợi Linh chi
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái
Quan sát đại thể trên môi trường thạch. Cách tiến hành:
Cắt miếng sinh khối tơ nấm Linh chi từ ống giống, đặt lên môi trường thạch nước giá, ủ trong 2–3 ngày, tiến hành quan sát đại thể hệ sợi nấm Linh chi.
Quan sát vi thể tơ nấm Linh chi bằng phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm[5].
Cách tiến hành:
- Đặt vào đáy hộp Petri một tờ giấy thấm, đặt tiếp lên đó một miếng lame. Đậy lại, gói giấy và đem khử trùng.
- Đun chảy môi trường môi trường thạch nước giá đã khử trùng trong ống nghiệm.
- Mở hé nắp đĩa Petri gần ngọn lửa đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên miếng lame sao cho thạch chảy dài thành một lớp mỏng một bên của tấm lame.
- Khi thạch trên lame đã đặc lại, nhỏ nước cất vô trùng thấm đều tờ giấy thấm mà không tràn lên lame.
- Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm sợi rồi chấm lên phần thạch của miếng lame trong phòng ẩm.
- Hộp được gói giấy và nuôi ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày. - Mở hộp Petri và lấy lame bên trong ra.
- Dùng giấy thấm chùi mặt đáy của lame.
- Đậy lamelle lên chỗ có tơ nấm Linh chi mọc và đặt dưới kính hiển vi để quan sát mẫu.
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa
Định tính cellulase Nguyên tắc:
Nấm sợi Linh chi tiết enzyme cellulase phân giải CMC thành các phân tử bé và các dạng đường khử không cho phản ứng màu với Iod.
Nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi trong môi trường dịch nước giá. Chuẩn bị môi trường thạch có bổ sung 1% CMC, khoan lỗ thạch. Cấy sinh khối tơ nấmLinh chi và ủ trong 24 giờ, tiến hành nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân giải.
Kết quả:
Phản ứng (+): môi trường xung quanh sinh khối tơ nấm Linh chi không bắt màu với thuốc thử Lugol.
Phản ứng (-): môi trường xung quanh bắt màu với thuốc thử Lugol.
2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Ba, Bn
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp nhuộm Gram [5].
Nguyên tắc :
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và iod mà vi khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau:
Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu tím của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn do có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan. Cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím tinh thểiod bị giữ lại trong tế bào, ngoài ra các vi khuẩn thuộc nhóm này có ít lipid hơn nên khi bắt màu, màu cũng ít bị rửa trôi hơn. Vi sinh vật thuộc nhóm này là Gram dương.
Nhóm thứ hai có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) nhưng lượng lipid của lớp màng ngoài cao hơn; khi bị tẩy bằng cồn, lipid bị hòa tan nhiều hơn và vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung, chúng sẽ bắt màu thuốc nhuộm mới (đỏ vàng, đỏ tía, hồng). Vi sinh vật nhóm này là Gram âm.
Cách tiến hành:
-Dùng bút lông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lame để đánh giấuvết khuẩn phía trên lame.
-Nhỏ dung dịch NaCl 0,9% lên giữa vòng tròn.
-Dùng que cấy khử trùng để nguội lấy một ít sinh khối vi khuẩn hòa vào giọt NaCl 0,9% trên lame.
-Dàn mỏng thành vết bôi, cố định bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn.
-Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa. -Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính.
-Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây-1 phút, rửa trôi thuốc nhuộm dư với nước.
-Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước. -Tẩy màu bằng cồn 960
từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ và cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm chảy theo. Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước. Thời gian khử màu trong bước này đóng vai trò quyết định kết quả của quá trình nhuộm.
-Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin và để yên trong vòng 30 giây. Rửa với nước.
-Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100).
Phương pháp nhuộm bào tử[5].
Cách tiến hành:
Với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1% và xanh methylen -Làm vết bôi trên phiến kính sạch và để khô tự nhiên.
-Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến bốc hơi trong 2 phút rồi rửa với nước.
-Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fucshin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho đến bốc hơi trong 5 phút.
-Rửa vết bôi bằng nước.
-Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen trong 5-15 phút. -Rửa lại với nước và để khô tự nhiên.
-Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100). Bào tử sẽ mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh.
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý
Xây dựng đường cong tăng trưởng trong môi trường sữa đậu nành[22]. Khảo sát đường cong sinh trưởng của vi khuẩn là một công việc quan trọng, nó cho biết tại thời điểm nào thì chất lượng giống vi khuẩn cho vào lên men là tốt nhất.
Nguyên tắc:
Sự tăng trưởng vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong quần thể. Tốc độ tăng trưởng là sự tăng trưởng của vi sinh vật trong một đơn vị thời gian. Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật theo thời gian ta có thể xác định được đường cong tăng trưởng của chúng.
Dụng cụ và môi trường:
Đĩa Petri, ống nghiệm, nước cất, đầu típ 1ml đã được hấp khử trùng. Môi trường thạch CP, môi trường sữa đậu nành. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách tiến hành:
Vi khuẩn được nuôi tăng sinh (nhân giống cấp 1) trong môi trường sữa đậu nành từ ống giống gốc, lắc ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.
Hút 1ml giống từ bình nhân giống cấp 1 sang một bình chứa môi trường sữa đậu nành mới (nhân giống cấp 2), lắc ở nhiệt độ phòng.
Khoảng 4 giờ lấy mẫu, cấy trên môi trường thạch CP.
Pha loãng mẫu ở các nồng độ khác nhau sao cho khuẩn lạc mọc riêng lẻ trên mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán.
Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 30–300 khuẩn lạc trên đĩa.
Tính kết quả:
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức:
CFU/ml = 𝐀𝐢 × 𝐃𝐢 𝐕 (2.1)
Ai: số khuẩn lạc trung bình trên đĩa Di: độ pha loãng thứ i
V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml).
Vẽ đồ thị đường cong sinh trưởng giữa log CFU/ml – trục tung và thời gian – trục hoành.
Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Ba, Bn[31].
Định tính protease
- Khả năng thủy phân casein
Nguyên tắc:
Vi sinh vật tiết enzyme protease phân giải casein thành polypeptide và acid amin.
Cách tiến hành:
Tăng sinh vi khuẩn Ba trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% casein. Nhỏ dịch tăng sinh Ba vào, ủ ở 37o
C trong 24 giờ. Tiến hành tương tự đối với Bn.
Nhỏ thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần lên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng phân giải casein.
- Khả năng thủy phân Fibrin
Nguyên tắc:
Vi sinh vật tiết protease phân giải fibrin thành polypeptide và các acid amin.
Cách tiến hành:
Tăng sinh vi khuẩn Bavà Bntrên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% fibrin. Nhỏ dịch tăng sinh Bavà Bnvào, ủ ở 37o
C trong 24 giờ.
Đọc kết quả:
Nhỏ thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần lên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng phân giải fibrin.
Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn xuất hiện màu xanh. Phản ứng (-): môi trường xung quanh không bắt màu với thuốc thử folin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Định tính amylase Nguyên tắc:
Một số vi sinh vật có enzyme α-amylase thuộc nhóm hydrolase phân giải liên kết glycozide tạo thành dextrin có phân tử bé và maltose. Vì vậy dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột bị phân giải thành dextrin không cho phản ứng màu xanh tím với iod.
Cách tiến hành:
Tăng sinh vi khuẩn Ba trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường Starch agar, ủ ở 37o
C trong 24 giờ. Tiến hành tương tự đối với Bn.
Kết quả:
Dùng thuốc thử Lugol nhỏ lên bề mặt môi trường để quan sát đường kính vòng phân giải tinh bột:
Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn không bắt màu với thuốc thử Lugol.
Phản ứng (-): môi trường xung quanh bắt màu với thuốc thử Lugol.
2.2.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của vi sinh vật sử dụng trong đề tài theo thời gian
Phương pháp xác định hoạt tínhCMCase của nấm sợi Linh chi[8].
Định nghĩa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng đường khử glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới điều kiện phản ứng.
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi CMCase ở pH 5 và 40°C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với DNS, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở