2.2.1.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa của nấm sợi Linh chi
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái
Quan sát đại thể trên môi trường thạch. Cách tiến hành:
Cắt miếng sinh khối tơ nấm Linh chi từ ống giống, đặt lên môi trường thạch nước giá, ủ trong 2–3 ngày, tiến hành quan sát đại thể hệ sợi nấm Linh chi.
Quan sát vi thể tơ nấm Linh chi bằng phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm[5].
Cách tiến hành:
- Đặt vào đáy hộp Petri một tờ giấy thấm, đặt tiếp lên đó một miếng lame. Đậy lại, gói giấy và đem khử trùng.
- Đun chảy môi trường môi trường thạch nước giá đã khử trùng trong ống nghiệm.
- Mở hé nắp đĩa Petri gần ngọn lửa đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên miếng lame sao cho thạch chảy dài thành một lớp mỏng một bên của tấm lame.
- Khi thạch trên lame đã đặc lại, nhỏ nước cất vô trùng thấm đều tờ giấy thấm mà không tràn lên lame.
- Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm sợi rồi chấm lên phần thạch của miếng lame trong phòng ẩm.
- Hộp được gói giấy và nuôi ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày. - Mở hộp Petri và lấy lame bên trong ra.
- Dùng giấy thấm chùi mặt đáy của lame.
- Đậy lamelle lên chỗ có tơ nấm Linh chi mọc và đặt dưới kính hiển vi để quan sát mẫu.
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa
Định tính cellulase Nguyên tắc:
Nấm sợi Linh chi tiết enzyme cellulase phân giải CMC thành các phân tử bé và các dạng đường khử không cho phản ứng màu với Iod.
Nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi trong môi trường dịch nước giá. Chuẩn bị môi trường thạch có bổ sung 1% CMC, khoan lỗ thạch. Cấy sinh khối tơ nấmLinh chi và ủ trong 24 giờ, tiến hành nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân giải.
Kết quả:
Phản ứng (+): môi trường xung quanh sinh khối tơ nấm Linh chi không bắt màu với thuốc thử Lugol.
Phản ứng (-): môi trường xung quanh bắt màu với thuốc thử Lugol.
2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Ba, Bn
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái
Phương pháp nhuộm Gram [5].
Nguyên tắc :
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và iod mà vi khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau:
Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu tím của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn do có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan. Cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím tinh thểiod bị giữ lại trong tế bào, ngoài ra các vi khuẩn thuộc nhóm này có ít lipid hơn nên khi bắt màu, màu cũng ít bị rửa trôi hơn. Vi sinh vật thuộc nhóm này là Gram dương.
Nhóm thứ hai có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) nhưng lượng lipid của lớp màng ngoài cao hơn; khi bị tẩy bằng cồn, lipid bị hòa tan nhiều hơn và vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung, chúng sẽ bắt màu thuốc nhuộm mới (đỏ vàng, đỏ tía, hồng). Vi sinh vật nhóm này là Gram âm.
Cách tiến hành:
-Dùng bút lông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lame để đánh giấuvết khuẩn phía trên lame.
-Nhỏ dung dịch NaCl 0,9% lên giữa vòng tròn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Dùng que cấy khử trùng để nguội lấy một ít sinh khối vi khuẩn hòa vào giọt NaCl 0,9% trên lame.
-Dàn mỏng thành vết bôi, cố định bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn.
-Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa. -Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính.
-Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây-1 phút, rửa trôi thuốc nhuộm dư với nước.
-Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước. -Tẩy màu bằng cồn 960
từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ và cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm chảy theo. Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước. Thời gian khử màu trong bước này đóng vai trò quyết định kết quả của quá trình nhuộm.
-Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin và để yên trong vòng 30 giây. Rửa với nước.
-Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100).
Phương pháp nhuộm bào tử[5].
Cách tiến hành:
Với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1% và xanh methylen -Làm vết bôi trên phiến kính sạch và để khô tự nhiên.
-Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến bốc hơi trong 2 phút rồi rửa với nước.
-Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fucshin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho đến bốc hơi trong 5 phút.
-Rửa vết bôi bằng nước.
-Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen trong 5-15 phút. -Rửa lại với nước và để khô tự nhiên.
-Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100). Bào tử sẽ mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh.
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý
Xây dựng đường cong tăng trưởng trong môi trường sữa đậu nành[22]. Khảo sát đường cong sinh trưởng của vi khuẩn là một công việc quan trọng, nó cho biết tại thời điểm nào thì chất lượng giống vi khuẩn cho vào lên men là tốt nhất.
Nguyên tắc:
Sự tăng trưởng vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong quần thể. Tốc độ tăng trưởng là sự tăng trưởng của vi sinh vật trong một đơn vị thời gian. Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật theo thời gian ta có thể xác định được đường cong tăng trưởng của chúng.
Dụng cụ và môi trường:
Đĩa Petri, ống nghiệm, nước cất, đầu típ 1ml đã được hấp khử trùng. Môi trường thạch CP, môi trường sữa đậu nành.
Cách tiến hành:
Vi khuẩn được nuôi tăng sinh (nhân giống cấp 1) trong môi trường sữa đậu nành từ ống giống gốc, lắc ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.
Hút 1ml giống từ bình nhân giống cấp 1 sang một bình chứa môi trường sữa đậu nành mới (nhân giống cấp 2), lắc ở nhiệt độ phòng.
Khoảng 4 giờ lấy mẫu, cấy trên môi trường thạch CP.
Pha loãng mẫu ở các nồng độ khác nhau sao cho khuẩn lạc mọc riêng lẻ trên mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán.
Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 30–300 khuẩn lạc trên đĩa.
Tính kết quả:
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CFU/ml = 𝐀𝐢 × 𝐃𝐢 𝐕 (2.1)
Ai: số khuẩn lạc trung bình trên đĩa Di: độ pha loãng thứ i
V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml).
Vẽ đồ thị đường cong sinh trưởng giữa log CFU/ml – trục tung và thời gian – trục hoành.
Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Ba, Bn[31].
Định tính protease
- Khả năng thủy phân casein
Nguyên tắc:
Vi sinh vật tiết enzyme protease phân giải casein thành polypeptide và acid amin.
Cách tiến hành:
Tăng sinh vi khuẩn Ba trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% casein. Nhỏ dịch tăng sinh Ba vào, ủ ở 37o
C trong 24 giờ. Tiến hành tương tự đối với Bn.
Nhỏ thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần lên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng phân giải casein.
- Khả năng thủy phân Fibrin
Nguyên tắc:
Vi sinh vật tiết protease phân giải fibrin thành polypeptide và các acid amin.
Cách tiến hành:
Tăng sinh vi khuẩn Bavà Bntrên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% fibrin. Nhỏ dịch tăng sinh Bavà Bnvào, ủ ở 37o
C trong 24 giờ.
Đọc kết quả:
Nhỏ thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần lên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng phân giải fibrin.
Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn xuất hiện màu xanh. Phản ứng (-): môi trường xung quanh không bắt màu với thuốc thử folin.
Định tính amylase Nguyên tắc:
Một số vi sinh vật có enzyme α-amylase thuộc nhóm hydrolase phân giải liên kết glycozide tạo thành dextrin có phân tử bé và maltose. Vì vậy dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột bị phân giải thành dextrin không cho phản ứng màu xanh tím với iod.
Cách tiến hành:
Tăng sinh vi khuẩn Ba trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường Starch agar, ủ ở 37o
C trong 24 giờ. Tiến hành tương tự đối với Bn.
Kết quả:
Dùng thuốc thử Lugol nhỏ lên bề mặt môi trường để quan sát đường kính vòng phân giải tinh bột:
Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn không bắt màu với thuốc thử Lugol. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng (-): môi trường xung quanh bắt màu với thuốc thử Lugol.
2.2.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của vi sinh vật sử dụng trong đề tài theo thời gian
Phương pháp xác định hoạt tínhCMCase của nấm sợi Linh chi[8].
Định nghĩa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng đường khử glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới điều kiện phản ứng.
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi CMCase ở pH 5 và 40°C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với DNS, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở mức bước sóng 540 nm.
Dựng đường glucose chuẩn:
Hòa tan 100mg glucose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây:
Bảng 2.1. Đường glucose chuẩn
Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dd glucose (1mg/l) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 - ml dd DNS – Lactose 2 2 2 2 2 2 2 - ml nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
Lắc đều ống nghiệm, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút . Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
Xác định hoạt tính của CMCase:
Ống nghiệm 1: phản ứng enzyme
-Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 40°C/5 phút. Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 40°C/5 phút.
-Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Đểphản ứng ở 400
C chính xác 10 phút.
-Thêm 2ml dung dịch DNS–lactose, lắc đều đểngừng phản ứng enzyme. -Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm (AT).
Ống nghiệm 2: đối chứng
-Hút 1ml dung dịch đệm Na-acetate 50 mM, pH 5 cho vào ống nghiệm để ở40°C/5 phút.
-Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều.
-Thêm 2ml dung dịch DNS-lactose, lắc đều đểngừng phản ứng enzyme. Đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độphòng trong một chậunước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm (AB).
Kết quả:
-Giá trị hệ số glucose trung bình (F)
F = (0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 +...+ 0,6/AG0,6)/6(2.2) -Hoạt tính enzyme:
CMCase UI/g = (AT – AB) x F (1000/198) x (1/10phút) x (1/1,0ml) x (1/C)
(2.3)
AB: Độ hấp thụ của dung dịch không có phản ứng enzyme F: yếu tố glucose (mg/ml)
1000: chuyển mg thành µg
198: phân tửlượng của glucose monohydrat, chuyển µg thành µmol. 10: thời gian phản ứng (phút)
1,0: thểtích dung dịch enzyme (ml) C: Nồng độdung dịch mẫu (g/ml). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease của Ba,Bn[8].
Định nghĩa đơn vị hoạt tính:Một đơn vị hoạt tính enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra một lượng amino acid tương đương với 100µg tyrosin trong 1ml dịch lọc trong điều kiện thí nghiệm.
Nguyên tắc:
Dùng protein casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.
Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng enzyme.
Cách tiến hành: Dựng đường chuẩn
Ống số chĐối ứng 1 2 3 4 5 Nồng độ (𝜇g/ml) 0 10 20 30 40 50 Dung dịch tyrosine chuẩn (𝜇l) 0 10 20 30 40 50 Dung dịch HCl (𝜇l) 1000 990 980 970 960 950 Na2CO3 0.4M (ml) 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử Folin (ml) 1 1 1 1 1 1
Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 μg tyrosin/1ml HCl 0,1M. Thêm 5ml Na2CO3 0,4M vào 1ml dung dịch tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều để ổn định dung dịch ở 37±0,50
C trong 20 phút.
Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả AS10, AS20, AS30, AS40, AS50).
Ống đối chứng: dùng 1ml HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này AS0).
𝑭 = 𝟏𝟏 𝑨𝑺𝟏𝟏−𝑨𝑺𝟏+ 𝑨 𝟐𝟏 𝑺𝟐𝟏−𝑨𝑺𝟏+ 𝑨 𝟑𝟏 𝑺𝟑𝟏−𝑨𝑺𝟏+𝑨 𝟒𝟏 𝑺𝟒𝟏−𝑨𝑺𝟏+𝑨 𝟓𝟏 𝑺𝟓𝟏−𝑨𝑺𝟏 𝟓 (2.4)
Dựng đường chuẩn theo hàm lượng μg tyrosin và độ hấp thụ. Định lượng enzyme trong mẫu:
Ống nghiệm 1: phản ứng enzyme
Cho 1ml dung dịch cơchất casein vào ống nghiệm, ủ ởnhiệt độ37±0,50
C trong 15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme vào, lắc đều, ủhỗn hợp này ởnhiệt độ37±0,50C trong 60 phút. Sau đó cho vào hỗn hợp này 2ml
dung dịch trichloroacetic 5%. Để ổn định nhiệt trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc đểloại tủa. Cho 5ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc. Cho thêm thuốc thửFolin đã pha loãng 5 lần vào hỗn hợp, đểyên ở37±0,50
C trong 20 phút. Khi xuất hiện màu xanh, đem đo độhấp thu ởbước sóng 660nm.
Ống nghiệm 2: đối chứng
Lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự ởmẫu thí nghiệm với cùng điều kiện.
Kết quả:
Hoạt tính enzyme protease:
ĐVHT/g hoặc ml dung dịch enzyme = (A60 – A0) × F × n × 1/100 (2.5) A60: độ hấp thụ của mẫu
A0: độ hấp thụ của mẫu đối chứng
F: hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosin và độ hấp thu ở bước sóng 660nm trên đường chuẩn
n: hệ số pha loãng mẫu 1/100: hệ số chuyển đổi
Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase của Ba,Bn[13].
Nguyên tắc:
Hoạt tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp Smith và Roe (1966). Hoạt tính amylase biểu thịkhảnăng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở500C và được thểhiện bằng số đơn vịcủa enzyme đó trong một gam mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa bịphân hủy sẽtạo phản ứng với iod và được đo bằng máy so màu quang học.
Cách tiến hành: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dùng các ống nghiệm có đánh dấu sẵn và tiến hành cho vào các ống nghiệm các dung dịch và hóa chất.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm định lượng enzyme amylase
Ống đối chứng Ống thử
1ml nước cất 1ml dịch enzyme các mẫu 1ml đệm phosphate pH 6,2 1ml đệm phosphate pH 6,2 1ml dung dịch tinh bột 1% 1ml dung dịch tinh bột 1%
0,5ml dung dịch NaCl 3% 0,5ml dung dịch NaCl 3%
Đem ủ ở nhiệt độ500C trong 30 phút, sau đó cho mỗi ống 1ml dung dịch HCl 1N để kiềm hãm sự hoạt động của enzyme. Cho nước cất đến 10ml mỗi ống.
Cho tiếp một giọt dung dịch Lugol vào mỗi ống. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm.
Đơn vị hoạt tính của enzyme amylase được tính theo công thức:
UI = (𝐚−𝐛) ×𝐂 × 𝐋 𝐚 ×𝐭 × 𝐦 (2.6)
a: mật độquang học của ống chuẩn b: mật độquang học của ống thử
C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (0,01g) L: hệ số pha loãng
m: trọng lượng (g) hoặc thểtích (ml) mẫu.