Khảo sát sự biểu hiên của ech42 ở trichoderma sp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  THẠCH THÀNH TRUNG KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA ech42 Ở TRICHODERMA SP. Chuyên ngành: HÓA SINH Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG Thành Phố Hồ Chí Minh - 2010 L LL LỜI CA I CAI CA I CAM M M M ƠN NN N Luận văn này được hoàn thành ngoài sự nỗ lực của bản thân không thể thiếu sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của thầy cô, anh chị và bạn bè. Em chân thành gởi lời cảm ơn đến, PGS. TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương, cô đã đặt nền tảng cho em với những kiến thức quý báu về Sinh học phân tử và đã tận tình hướng dẫn em hoàn thành luận văn này. Th.S Đinh Minh Hiệp, một người thầy, cũng là một người anh đã luôn tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Em chân thành gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Sinh, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp. HCM đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức cần thiết cho em trong suốt thời gian học đại học và cao học. Em chân thành gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị trong Bộ môn Sinh hóa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên như cô Thu, cô Hồng, thầy Chín, thầy Quang, cô Huyên, cô Châu, cô Nga, cô Uyên, anh Nghiệp, anh Tuấn, anh Long, chị Tú, bạn Phong, bạn Bình và em Huy. Thầy cô, anh chị và các bạn đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian làm việc và thực hiện luận văn. Em cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến chị Vi, chị Tâm, anh Kiên, bạn Vân bên Bộ Môn Sinh học phân tử, cùng với bạn Khôi, Cẩm, Duyên bên Công ty TNHH CNSH Khoa Thương đã hỗ trợ và giúp đỡ hết mình trong thời gian thực hiện thí nghiệm tại đây. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ông Bà, Ba Mẹ và hai em Lệ Thu, Thanh Thiên. Con cảm ơn ba mẹ đã nuôi nấng, dạy dỗ con nên người, tạo điều kiện tốt nhất cho con được học hành, là chỗ dựa tinh thần và luôn động viên con những lúc khó khăn nhất. Con luôn tự hào khi mình có một gia đình như thế./. Thạch Thành Trung MỞ ĐẦU Vi nấm Trichoderma là một tác nhân kiểm soát sinh học tiềm năng. Chúng có khả năng đối kháng với một phổ rộng nấm gây bệnh cây trồng với nhiều cơ chế khác nhau như kí sinh nấm, tiết chất kháng nấm, cạnh tranh dinh dưỡng, bảo vệ và kích thích hệ rễ phát triển…Một trong những cơ chế quan trọng nhất là sự kí sinh nấm dựa vào việc tiết hệ enzyme phân giải vách tế bào nấm gây bệnh cây trồng như chitinase, β-glucanase, cellulase, protease Hệ chitinase, đặc biệt là nhóm endochitinase, một trong những yếu tố chính trong cơ chế kí sinh ở Trichoderma vì sự cảm ứng đa dạng, thường xuyên hơn những nhóm còn lại trong toàn hệ enzyme phân giải vách tế bào nấm. Một trong những endochitinase được nghiên cứu chi tiết là endochitinase 42 kDa cùng với gene mã hóa tương ứng, ech42. Chúng được cảm ứng một cách mạnh mẽ trong suốt quá trình tương tác giữa Trichoderma với phổ rộng nấm gây bệnh. Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh rõ hơn vai trò quan trọng của ech42 trong sự đối kháng của Trichoderma với nhiều loài nấm gây bệnh cây trồng. Tuy nhiên, những nghiên cứu về sự cảm ứng endochitinase 42 kDa và sự biểu hiện ech42 ở các chủng Trichoderma phân lập tại Việt Nam vẫn còn khá hạn chế. Đề tài này được thực hiện với mục tiêu xác định sự hiện diện của endochitinase 42 kDa và khảo sát sự biểu hiện gene ech42 ở chủng Trichoderma sp. được phân lập tại Việt Nam khi được nuôi cấy cảm ứng với chitin huyền phù hoặc vách tế bào nấm gây bệnh thực vật. Từ đó có thể đánh giá mối quan hệ giữa sự biểu hiện ech42 ở mức mRNA và hoạt tính endochitinase. Trang Trang phụ bìa Mục lục Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU Chương 1-TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi nấm Trichoderma 1 1.1.1. Phân loại 1 1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa 1 1.1.3. Tương tác giữa Trichoderma và nấm bệnh 2 1.1.3.1. Sự kí sinh nấm 2 1.1.3.2. Sự tạo thành chất chuyển hóa thứ cấp 5 1.1.3.3. Tính kháng nấm 6 1.1.3.4. Cạnh tranh dinh dưỡng 6 1.1.4. Tương tác giữa Trichoderma với thực vật 7 1.1.4.1. Hỗ trợ sự tăng trưởng của cây trồng 7 1.1.4.2. Kích thích tính kháng và các cơ chế phòng vệ của cây 8 1.2. Hệ thủy phân chitin ở Trichoderma 9 1.2.1. Định nghĩa 9 1.2.2. Phân loại 9 1.2.3. Đặc điểm hệ chitinase ở Trichoderma 10 1.2.3.1. Nhiệt độ 10 1.2.3.2. pH và điểm đẳng điện (pI) 10 1.2.3.3. Một số hợp chất ảnh hưởng đến hoạt tính của chitinase 11 1.2.3.4. Các gene mã hóa và trọng lượng phân tử của các enzyme trong hệ chitinase ở Trichoderma 12 1.2.3.5. Cơ chế cảm ứng sinh chitinase ở Trichoderma 15 1.3. Endochitinase 42 kDa và ech42 ở Trichoderma 16 1.3.1. Các nghiên cứu ở mức độ protein 17 1.3.2. Các nghiên cứu ở mức độ gene 18 Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên vật liệu 21 2.1.1. Chủng vi nấm dùng trong thực nghiệm 21 2.1.2. Cơ chất 21 2.2. Thiết bị 21 2.3. Môi trường nuôi cấy 22 2.4. Phương pháp 23 2.4.1. Phương pháp điều chế chitin huyền phù 1% 23 2.4.2. Phương pháp điều chế CM-chitin 23 2.4.3. Phương pháp thu nhận vách tế bào sợi nấm 24 2.4.4. Phương pháp đo đường kính vòng phân giải 25 2.4.5. Quy trình nuôi cảm ứng 25 2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 26 2.4.6.1. Xác định hoạt độ chung chitinase 26 2.4.6.2. Phương pháp xác định hoạt độ chung endochitinase 28 2.4.7. Phương pháp điện di SDS-PAGE 28 2.4.8. Phương pháp xác định trọng lượng phân tử protein sau điện di SDS PAGE 30 2.4.9. Phương pháp điện di native-PAGE 31 2.4.10. Phương pháp tách chiết RNA tổng số 32 2.4.11. Thiết lập phản ứng RT-PCR 33 2.4.12. Thiết lập phản ứng PCR 33 2.4.13. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 34 2.4.14. Thiết lập phản ứng real-time PCR 35 2.4.15. Phương pháp 2 -∆∆Ct 35 2.4.16. Phương pháp xử lý số liệu thống kê 36 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Chọn chủng Trichoderma sp. có khả năng sinh hệ enzyme thủy phân chitin cao 37 3.1.1. Sàng lọc sơ bộ khả năng phân giải chitin ở Trichoderma 37 3.1.2. Chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao 38 3.2. Khảo sát sự hiện diện của isozyme endochitinase 42 kDa ở chủng T. longibrachiatum TD16 39 3.2.1. Khảo sát hoạt tính chung endochitinase và chitinase ở chủng T. longibrachiatum TD16 theo thời gian nuôi cấy trong môi trường TSM với nồng độ cơ chất cảm ứng khác nhau 39 3.2.2. Xác định sự hiện diện của các isozyme endochitinase 44 3.2.3. Xác định trọng lượng phân tử các isozyme endochitinase 45 3.3. Khảo sát sự biểu hiện của ech42 ở T. longibrachiatum TD16 47 3.3.1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy trong môi trường SM 47 3.3.2. Định lượng tương đối sự biểu hiện gene mã hóa endochitinase 42 kDa 50 3.3.2.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho ech42 ở T. longibrachiatum TD16 51 3.3.2.2. Thiết kế mẫu dò 55 3.3.2.3. Kiểm tra hệ thống real-time PCR 56 3.3.2.4. Khảo sát khả năng ứng dụng của phương pháp 2 -∆∆Ct 57 3.3.2.5. Định lượng tương đối sự biểu hiện của ech42 59 Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số cơ chất ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp của chitinase 11 Bảng 1.2. Một số hợp chất vô cơ và hữu cơ ảnh hưởng lên hoạt tính chitinase 12 Bảng 1.3. Một số gen mã hóa và enzyme tương ứng trong hệ chitinase ở Trichoderma spp. được nghiên cứu chi tiết [42] 13 Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma 37 Bảng 3.2. Các thông số lí thuyết của 2 cặp mồi 52 Bảng 3.3. Thông số của hai mẫu dò được thiết kế 55 Bảng 3.4. Giá trị Ct của hai gene tại các độ pha loãng khác nhau 58 Bảng 3.5. Mức độ biểu hiện tương đối của ech42 khi chủng T. longibrachiatum TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa chitin huyền phù 1,0% 59 Bảng 3.6. Mức độ biểu hiện tương đối của ech42 khi chủng T. longibrachiatum TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa vách tế bào nấm S.rolfsii 0,5% 59 Bảng 3.7. Mức biểu hiện mRNA ech42 và HđC endochitinase theo thời gian nuôi cấy trong dịch canh trường SM 62 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT bp cặp base (base pair) BLAST Basic Local Alignment Search Tool cDNA DNA bổ sung (complementary Deoxyribonucleic acid) cs cộng sự Ct chu kì ngưỡng (threshold cycle) DDT Dichloro Diphenyl Trichloroethane đvht Đơn vị hoạt tính EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid FAM 6-carboxyfluorescein GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine kDa kilodaltons mRNA RNA thông tin (messenger Ribonucleic acid) NCBI National Center for Biotechnology Information OD Mật độ quang (Optical Density) PCR Polymerase Chain Reaction PGA Potato Glucose Agar PGB Potato Glucose Broth rRNA RNA ribosme (ribosome ribonucleic acid) RT- PCR PCR phiên mã ngược (Reverses Transcription PCR) SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Ectrophoresis SM Synthetic Medium TAE Tris acetate – EDTA TAMRA 6-carboxytetramethylrhodamine Tris tris(hydroxylmethyl) aminomethane TSM Trichoderma Selective Medium DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma harzianum 1 Hình 1.2. Quá trình kí sinh của Trichoderma trên nấm gây bệnh R. solani 4 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của gliovirin phân lập từ Trichoderma sp 6 Hình 1.4. Sự tác động đồng thời của chitinase và peptaipol từ Trichoderma sp. lên vách tế bào nấm 6 Hình 1.5. Sự kích thích tăng trưởng hiệu quả đối với ớt, rau diếp và cà chua khi có sự hiện diện của Trichoderma spp. so với không có (control) 8 Hình 1.6. Vị trí cắt của ba nhóm enzyme thuộc hệ chitinase 10 Hình 1.7. Thuốc lá và khoai tây mang gen mã hoá endochitinase 42 kD được biến nạp từ T. harzianum có khả năng kháng nấm gây bệnh A.alternata và R.solani 17 Hình 1.8. Endochitinase từ chủng T.atroviride 7-121 khi được nuôi cảm ứng với 3 vách tế bào nấm khi xác định bằng phương pháp native-PAGE. (1) B.cinerea, (2) A. alternata, (3) F.oxysporum 18 Hình 1.9. Sự cảm ứng chitinase trong môi trương MM chứa lần lượt chitin và glucose bởi T. harzianum. (A) Hoạt tính chitinase, chitin, glucose ; (B) Kết quả Northern blot với mẫu dò ech42 ; (C) Kết quả Northern blot với mẫu dò gen chứng 5S rRNA 20 Hình 3.1. Các băng protein trên gel polyacrylamide sau khi chạy native-PAGE nhuộm comassive brilliant blue (giếng 1) và nhuộm cơ chất đặc hiệu endochitinase trên gel agarose (giếng 2) tương ứng hình A- protein thu nhận khi cảm ứng bởi chitin huyền phù (chi), hình B- protein thu nhận khi cảm ứng bởi vách tế bào nấm S. rolfsii (SR) 45 Hình 3.2. Kết quả SDS-PAGE hai isozyme endochitinase. Cơ chất cảm ứng là chitin huyền phù 1% (Chi1 và Chi2) và vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% SR1 và SR2) cùng với mẫu thô tương ứng (Chi và SR) 46 Hình 3.3. Kết quả SDS-PAGE hai mẫu tủa protein thu được từ dịch môi trường SM chứa chitin huyền phù 1% (Chitin) hay vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% (SR) cùng với thang trọng lượng phân tử thấp (LMW) 50 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm nhân bản của hai cặp mồi cho gene 18S rRNA (A) và ech42 (B) trên gel agarose 3% với L: thang DNA 100bp, c: mẫu chứng, 0: ngày 0, ch: mẫu cảm ứng với chitin 1,0%, sr: mẫu cảm ứng với vách tế bào nấm S.rolfsii 0,5% 52 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm nhân bản của hai cặp mồi cho gene 18S rRNA (S) và ech42 (C) trên gel agarose 3% với S1-3, và C1-3 là mẫu cDNA, S4 và C4 là mẫu RNA tổng số 53 Hình 3.6. Kết quả BLAST trình tự sản phẩm PCR của gene ech42 54 Hình 3.7. Kết quả BLAST trình tự sản phẩm PCR của gene 18S rRNA 54 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra thực hiện real-time PCR cho gene 18S rRNA 57 Hình 3.9. Kết quả kiểm tra hệ thống real-time PCR cho gene ech42 57 [...]... 72 Chitin 96 24 ech42 Vách t bào n m S rolfsii 48 72 96 18S ech42 Hình 6.1 Giá tr Ct c a gene 18S rRNA ( ư ng xanh) và ech42 ( ư ng c am u th i i m 0 gi Hình 6.2 Giá tr Ct c a gene 18S rRNA và ech42 c a m u c m ng trên chitin 1,0% th i i m 24 gi ) Hình 6.3 Giá tr Ct c a gene 18S rRNA và ech42 c a m u c m ng trên chitin 1,0% th i i m 48 gi Hình 6.4 Giá tr Ct c a gene 18S rRNA và ech42 c a m u c m... kh o sát in vitro Nh ng i u ki n nuôi c y này t o i u ki n thu n l i cho vi c xác nh các enzyme phân gi i c a Trichoderma ư c c m ng th y phân các polymer c u thành nên vách t bào n m Elad, Y và cs (1999) ã nghiên c u và phát hi n m c bi u hi n c a gene mã hóa protease (prb1) c a Trichoderma harzianum tăng cao khi tương tác v i R solani [13] Carsolio C và cs (1999) nghiên c u s bi u hi n c a gene ech42. .. 58 th 3.5 M c bi u hi n mRNA ech42 và H C endochitinase theo th i gian nuôi c y trong d ch canh trư ng SM 62 CHƯƠNG 1 T NG QUAN TÀI LI U 1 1.1 Vi n m Trichoderma 1.1.1 Phân lo i Trong nh ng th p k g n ây, s lư ng loài Trichoderma spp ư c phát hi n ã tăng lên n c trăm loài [41] cùng v i các v n chưa ư c tìm hi u và phân tích y c i m c n thi t cho vi c phân lo i Do ó Trichoderma là m t trong nh... tích trình t c a m t s gene c trưng như ITS, tef, rpb hay ech42, Druzhinina S.I và cs (2006) ã phân lo i Trichoderma như sau: [12],[41] Gi i Fungi Ngành Ascomycota L p Euascomycetes B Hypocreales H Hypocreaceae Chi Trichoderma b a Hình 1.1 Khu n ty (a) và cơ quan sinh bào t (b) c a Trichoderma harzianum [49] 1.1.2 c i m hình thái, sinh lí, sinh hóa Trichoderma là m t lo i n m s i, s ng t do, ho i sinh,... t r ng các enzyme phân gi i ư c Trichoderma ti t ra gi i vách t bào c a R solani và S rolfsii t i nh ng v trí này (hình 1.2b) phân 4 a b Hình 1.2 Quá trình kí sinh c a Trichoderma trên n m gây b nh R solani [49] a Trichoderma cu n quanh n m gây b nh R solani b Vách t bào R solani b ăn mòn và có nh ng l xuyên vào s i n m do h enzyme ti t ra t Trichoderma H u h t các nghiên c u v s bi u hi n và i u hòa... ech42 c a m u c m ng trên chitin 1,0% th i i m 96 gi Hình 6.6 Giá tr Ct c a gene 18S rRNA và ech42 c a m u c m ng trên vách t bào n m 0,5% th i i m 24 gi Hình 6.7 Giá tr Ct c a gene 18S rRNA và ech42 c a m u c m ng trên vách t bào n m 0,5% th i i m 48 gi Hình 6.8 Giá tr Ct c a gene 18S rRNA và ech42 c a m u c m ng trên vách t bào n m 0,5% th i i m 72 gi Hình 6.9 Giá tr Ct c a gene 18S rRNA và ech42. .. chitinase và peptaibol t Trichoderma sp lên vách t bào n m [47] 1.1.3.3 Tính kháng n m Trong t nhiên, các loài sinh v t luôn có xu hư ng t o ra và ti t vào môi trư ng các ch t bi n dư ng kìm hãm s sinh trư ng và phát tri n c a các loài khác Trichoderma có kh năng ch u ư c tác ng c a nh ng ch t bi n dư ng này và s ng sót trong nh ng i u ki n c nh tranh kh c nghi t Bên c nh ó, m t s ch ng Trichoderma tăng trư... ng enzyme khác trong h chitinase cũng ư c quan tâm [9], [34], [42] B ng 1.3 M t s gen mã hóa và enzyme tương ng trong h chitinase Trichoderma sp ư c nghiên c u chi ti t [32], [42] Dòng Trichoderma Gen Protein Tham kh o Haryes và cs, 1994 T atroviride P1 ThEn-42 IMI206040 ech42 endochitinase Ingunn A.H và cs, 2005 42 kDa T atroviride Ana S P và cs, 2007 endochitinase Carsolio và cs, 1994 42 kDa T harzianum... tăng cư ng kh năng h tr tăng trư ng cho cây tr ng c a Trichoderma Ngoài ra, các ch ng Trichoderma acid hóa môi trư ng s ng chung quanh chúng b ng cách ti t ra các acid h u cơ, như acid gluconic, citric hay fumaric giúp hòa tan các g c phosphate, các nguyên t vi lư ng và các cation khoáng bao g m s t, manganese và magnesium [47], [49] Do ó, vi c b sung Trichoderma vào t có ít các cation trên s giúp hòa... qu i v i t, rau di p và cà chua khi có s hi n di n c a Trichoderma spp so v i không có (control) [47] 1.1.4.2 Kích thích tính kháng và các cơ ch phòng v c a cây Sau khi xâm nh p vào cây tr ng thông qua quá trình t o khu n l c, các ch ng Trichoderma t o ra hay phóng thích các h p ch t có tác d ng c m ng các cơ ch kháng như HR (hypersensitive response), SAR (systemic acquired resistance), và ISR (induced . ech42 trong sự đối kháng của Trichoderma với nhiều loài nấm gây bệnh cây trồng. Tuy nhiên, những nghiên cứu về sự cảm ứng endochitinase 42 kDa và sự biểu hiện ech42 ở các chủng Trichoderma. THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  THẠCH THÀNH TRUNG KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA ech42 Ở TRICHODERMA SP. Chuyên ngành: HÓA SINH Mã số: 60 42 30 . Đề tài này được thực hiện với mục tiêu xác định sự hiện diện của endochitinase 42 kDa và khảo sát sự biểu hiện gene ech42 ở chủng Trichoderma sp. được phân lập tại Việt Nam khi được nuôi cấy