Nguyên tắc
Khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường thạch có chứa chitin huyền phù, chúng sẽ cảm ứng sinh tổng hợp hệ enzyme phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn hay monomer N-acetyl-D-glucosamine để làm cơ chất dinh dưỡng. Các dạng này không cho phản ứng màu với thuốc thử lugol. Do đó, có thể so sánh sơ bộ hoạt tính của chitinase dựa vào đường kính vòng phân giải chitin sau khi nhuộm màu với thuốc thử lugol. Đường kính vòng phân giải chitin của từng vi sinh vật tỉ lệ thuận với khả năng cảm ứng sinh tổng hợp hệ enzyme này.
Tiến hành
- Chuẩn bị môi trường TSM chứa 1% chitin trong các ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 121oC trong 30 phút. Để nguội đến 45-50oC.
- Chuẩn bị các đĩa Petri vô trùng, kích thước như nhau. Đổ môi trường từ ống nghiệm vào.
- Ứng với mỗi Petri cấy chấm mỗi giống Trichoderma vào giữa đĩa - Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày
- Nhuộm màu với thuốc thử lugol: Lấy 15ml thuốc thử cho vào mỗi đĩa Petri, để yên 5-10 phút, loại thuốc thử, đo đường kính vòng phân giải.
2.4.5. Quy trình nuôi cảm ứng [35] Tiền nuôi cấy
Bổ sung bào tử Trichoderma (1x108 bào tử/ml, đo bằng buồng đếm hồng cầu) vào 50 ml môi trường SM chứa 1% glycerol (v/v).
Tiến hành nuôi cấy trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ 280C, tốc độ lắc 100 vòng/phút.
Nuôi cấy cảm ứng
Ly tâm dịch môi trường ở 5000 vòng/phút trong 15 phút
Loại dịch nổi, bổ sung nước cất vô trùng, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút. Lặp lại 2 lần
Loại bỏ dịch nổi, huyền phù sợi nấm trong 30ml nước cất vô trùng
Hút 3ml dịch sợi nấm huyền phù cho vào các bình bình tam giác chứa môi trường SM lỏng có bổ sung cơ chất cảm ứng. Nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 280C, tốc độ lắc 100 vòng/phút.
Tại các thời điểm 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ sau khi tiến hành cảm ứng, dung dịch nuôi cấy được lọc qua băng gạc, rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng, vắt khô, thu sợi nấm cho vào eppendorf.
Đông lạnh mẫu nấm thu được trong nitơ lỏng.
Tiến hành tách chiết RNA toàn phần từ sinh khối sợi nấm.
Khi nuôi trong môi trường TSM không qua giai đoạn tiền nuôi cấy. Bào tửđược bổ sung trực tiếp vào môi trường chứa cơ chất cảm ứng.
2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 2.4.6.1. Xác định hoạt độ chung chitinase 2.4.6.1. Xác định hoạt độ chung chitinase Nguyên tắc
Hoạt độ chung chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm cuối D-glucosamine của quá trình phân giải chitin, dựa trên sự hình thành dẫn xuất pyrrol khi D-glucosamine được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton. Những pyrrol này cho phản ứng màu với thuốc thử Erlich [1], [22].
Tiến hành
- Pha thuốc thử acetyl aceton: hòa tan 2,5ml acetyl aceton trong 50ml dung dịch đệm carbonat Na2CO3/NaHCO3 1M, pH 9,6
- Pha thuốc thử Erlich: Cân 0,8g p-dimethyllaminobenzadehyde hòa tan trong 30ml dung dịch HCl đậm đặc.
- Dựng dường chuẩn D-glucosamine:
Từ dung dịch trên pha thành các dung dịch có nồng độ khác nhau theo bảng sau: Nồng độ D-glucosamine chuẩn (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 Dung dịch D-glucosamine (200 µg/ml) (ml) 0 5 10 15 20 25 30 35 Nước cất (ml) 100 95 90 85 80 75 70 65 - Chọn các ống nghiệm có nắp cùng kích cỡ, hút 1ml dịch chuẩn từng nồng độ và 1ml thuốc thử acetyl aceton
+ Lắc đều, đun cách thủy ở 100oC, 1 giờ + Làm lạnh ống nghiệm dưới dòng nước
+ Thêm 1ml thuốc thử Erlich, lắc đều, đun cách thủy ở 70oC, 20 phút + Đểống nguội tự nhiên, đo mật độ quang ở bước sóng 512nm
+ Dựng đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa nồng độ N-acetyl- glucosamine và hiệu số mật độ quang (IOD)
- Xác định hoạt độ chung chitinase
+ Thử thật: hỗn hợp phản ứng gồm 2ml chitin huyền phù 1% và 2ml dịch enzyme, đặt ở 30oC trong 20 phút, phản ứng được ngừng bằng cách đun sôi cách thủy 3 phút.
+ Thử không: trong điều kiện đun sôi cách thủy cho lần lượt 2ml dịch chitin huyền phù và 2ml dịch enzyme. Sau 3 phút lấy ra.
+ Lọc mẫu, thu dịch sau phản ứng.
+ Thiết lập phản ứng định lượng D-glucosamine như trên, thay 1ml dịch N- acetyl-glucosamine chuẩn bởi dịch lọc, suy ra hàm lượng D-glucosamine trong dịch lọc.
• Công thức tính
Đơn vị hoạt tính của chitinase được xác định như sau: 1 đơn vị hoạt tính (đvht) tương ứng với 1 µg D-glucosamine tạo ra trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ phản ứng. HTC (đvht/ml) = t v V a . . Với:
a: nồng độ D-glucosamine (µg/ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng V: thể tích dịch phản ứng (4 ml)
v: thể tích dịch enzyme thí nghiệm (2 ml) t: thời gian phản ứng (20 phút)
2.4.6.2. Phương pháp xác định hoạt độ chung endochitinase Nguyên tắc Nguyên tắc
Xác định hoạt tính chung endochitinase dựa vào sự giảm độ đục dịch chitin huyền phù 1% sau phản ứng, được đo ở bước sóng 510nm [23].
Tiến hành
- Hòa tan 1g chitin huyền phù thành 100ml bằng dung dịch đệm phosphat 0,05M pH 6,7.
- Cho vào ống nghiệm: 1ml dịch huyền phù chitin trên và 1ml dịch chứa enzyme. - Ủở 37oC trong 24 giờ.
- Pha loãng với nước cất thành 20 ml, đo độ truyền suốt ở bước sóng 510nm.
Công thức tính
Đơn vị hoạt tính endochitinase được xác định như sau: một đơn vị hoạt tính endochitinase tương ứng với sự giảm 5% độđục của dung dịch sau phản ứng.
HTC (đvht/ml)=
5 ) (b−a
Với:
b: độ truyền suốt ở bước sóng 510 nm ở lô thử thật a: độ truyền suốt ở bước sóng 510 nm ở lô thử không
2.4.7. Phương pháp điện di SDS-PAGE Nguyên tắc Nguyên tắc
SDS-PAGE là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide với mercaptoethanol hoặc DDT có tác dụng khử các cầu nối disulfit làm các cấu trúc bậc 2, 3, 4 của protein bị biến đổi thành bậc 1, SDS có vai trò tích điện âm cho phân tử protein. Do đó, khi điện di các phân tử protein, tốc độ di chuyển của các phân tử trong gel chỉ phụ thuộc vào kích thước. Những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ [23].
Tiến hành
Chuẩn bị gel phân tách (Resloving gel) ở cực dương (10%) Thành phần Thể tích (µl) H2O 2050 Dung dịch acrylamide 30% 1650 Đệm Tris-HCl pH 8,8 1250 SDS 10% 50 APS 10% 50
Chuẩn bị gel gom (Stacking gel) ở cực âm (5%)
Thành phần Thể tích (µl) H2O 630 Dung dịch acrylamide 30% 190 Đệm Tris-HCl pH 6,8 280 SDS 10% 10 APS 10% 50
Chạy điện di
Tiến hành điện di với 15 - 20 µl dung dịch mẫu được bổ sung vào giếng theo thứ tự trong điện thế 100V, cường độ 30mA.
Nhuộm gel sau điện di SDS-PAGE
Sau khi chạy điện di xong, cẩn thận lấy gel ra ngâm trong dung dịch nhuộm màu protein (Coomassive Brilliant Blue R250 (CBB) 0,2% hòa tan trong 45:45:10% methanol : nước : acetic acid), lay động nhẹ trong thời gian 2 - 3 giờ.
Chuyển gel sang dung dịch rửa mẫu (25:65:10% methanol : nước : acid acetic), thay dung dịch rửa mẫu khoảng vài lần cho đến khi thấy gel có màu trong suốt là được. Những vạch màu xanh trên nền trắng là những băng protein.
2.4.8. Phương pháp xác định trọng lượng phân tử protein sau điện di SDS PAGE PAGE
Nguyên tắc
Trong kĩ thuật điện di sử dụng gel polyacrylamide làm mạng rây phân tử và có SDS làm chất hoạt động bề mặt. Tốc độ di chuyển của phân tử protein tỉ lệ nghịch với trọng lượng phân tử. Dựa vào vận tốc di chuyển của các phân tử chuẩn đã biết phân tử lượng ta sẽ tính được trọng lượng của các phân tử protein có trong mẫu.
Trọng lượng của một phân tử protein cần nghiên cứu sẽ được xác định khi cho phân tử protein này tiến hành điện di đồng thời với một thang protein chuẩn (Marker) gồm những protein có trọng lượng phân tửđã biết [3].
Tiến hành
Sau khi tiến hành điện di, các protein chuẩn sẽ nằm tại vị trí xác định trên bảng gel.
Đo khoảng dịch chuyển của các protein chuẩn so với điểm xuất phát là điểm đầu ngay khi các protein tiến vào gel phân tách: X1, X2, X3,…Tính được các giá trị LgX1, LgX2, LgX3,…
Với trọng lượng của các protein chuẩn tương ứng (M1, M2, M3,…). Tính các LgM1, LgM2, LgM3,…
Xác định phương trình tuyến tính của đường chuẩn: phương trình tuyến tính của đường chuẩn biểu thị sự tương quan của các giá trị LogX thu được và các giá trị Log M của các protein chuẩn.
Sử dụng chương trình Excel với hàm nội suy Forecast suy ra trọng lượng phân tử protein đích.
2.4.9. Phương pháp điện di native-PAGE
Thao tác tương tự như điện di SDS-PAGE nhưng toàn bộ quá trình được thực hiện trong điều kiện lạnh từ 4-100C, mẫu còn giữ hoạt tính enzyme cao và loại tất cả thành phần gây biến tính protein (SDS, mercaptoethanol) trong dung dịch nạp mẫu, đệm và gel điện di [37], [45].
Chạy điện di native-PAGE
Chạy native - PAGE ở nhiệt độ 4-10o C với điện thế 80V, khi nhận thấy băng chạy đến gel phân tách thì tăng lên 90V.
Sau khi chạy xong, lấy gel ra và tiến hành chuyển thẩm lên gel agarose, nhuộm hoạt tính.
Nhuộm băng hoạt tính endochitinase sau native- PAGE [20], [48]
- Chuẩn bị gel agarose chứa cơ chất đặc hiệu CM-chitin:
+ Hoà tan hoàn toàn 0,04 g CM-chitin trong 100 ml đệm acetat 0,05 M, pH 5,2. + Bổ sung 0,5% (g/l) agar, đun sôi và đổ vào khuôn sao cho gel dày khoảng 1,5mm.
- Quan sát băng hoạt tính endochitinase trên gel agarose
+ Gel agorose chứa CM-chitin được đặt tiếp xúc với gel polyacrylamide sau khi điện di xong được ủở 40oC trong 90 phút
+ Sau đó gel agarose được nhúng chìm trong dung dịch 0,01% fluorescent brightener 28 trong đệm tris HCl 0,5M, pH 8,9 khoảng 5 phút.
+ Rửa sạch gel với nước cất và ủ ở nhiệt độ phòng trong tối khoảng 2 giờ.
+ Gel được quan sát với tia UV, hoạt tính endochitinase được thể hiện bằng một băng tối tương phản với nền sáng của gel.
2.4.10. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Nguyên tắc
Sử dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân, đồng thời dùng các chất khử cũng như tác nhân biến tính protein mạnh nhằm ức chế hoạt động của RNase nội bào và phân tách các protein liên kết với RNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước).
Qui trình tách chiết theo phương pháp của Schomczyski và Sachii (1990) [7]
Tiến hành
- Nghiền mẫu nấm trong nitơ lỏng bằng cối và chày, thêm 1ml dung dịch Trizol pH 4, trộn đều.
- Hút 50 µl dịch huyền phù vào eppendorf vô trùng (biopure).
- Thêm 950 µl dung dịch Trizol vào mỗi eppendorf, vortex 5 giây, để trong đá trong 10 phút.
- Thêm 200 µl dung dịch Phenol-Chloroform, trộn kỹ (lắc mạnh trong 15 giây) - Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, 40C. Hút 600 µl dịch nổi chuyển sang eppendorf mới.
- Bổ sung 600 µl dung dịch isopropanol, trộn đều, để trong đá trong 10 phút, sau đó li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, 40C, cẩn thận loại dịch nổi, thu tủa.
- Rửa tủa bằng 1 ml dung dịch ethanol 70%, li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, 40C, loại dịch nổi,
- Ly tâm nhanh để loại hết ethanol thừa, để khô tủa trong vòng 3 - 5 phút.
- Hòa cặn với 150 µl dung dịch nước đã được xử lí DPEC (diethylene pyrocarbonate), trộn đều mẫu.
2.4.11.Thiết lập phản ứng RT-PCR
Sử dụng khả năng phiên mã ngược của reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA nhờ mồi là random hexamer.
Chúng tôi dùng mix cho phản ứng RT-PCR do Công ty TNHH CNSH Khoa Thương cung cấp.
Thiết lập phản ứng RT- PCR
Reverse transcriptase 1 µl Mix RT-PCR 4 µl RNA trong nước xử lý DEPC 15 µl
Chương trình phản ứng RT- PCR
Bước 1: 250C trong 5 phút Bước 2: 420C trong 30 phút Bước 3: 850C trong 5 phút
2.4.12. Thiết lập phản ứng PCR
Thiết lập phản ứng PCR với hai cặp mồi của 18S rRNA và ech42sử dụng với cDNA làm bản mẫu [19], [43].
Thành phần cDNA Chứng (-)
Nước (đã xử lý DEPC) 21,5 µl 24 µl Master mix 2X (Promega) 25 µl 25 µl Hỗn hợp mồi xuôi và ngược
(25 µM : 25 µM) 1 µl 1 µl
cDNA 2,5 µl -
Tổng thể tích 50 µl 50 µl
Chương trình PCR
Đối với cả 2 cặp mồi, chương trình PCR bao gồm các thông số sau: Bước 1: 95oC trong 5 phút
Bước 2: thực hiện lặp lại trong 40 chu kì gồm: 94oC trong 30 giây
54oC trong 30 giây 72oC trong 30 giây Bước 3: 72oC trong 6 phút
2.4.13. Điện di sản phẩm PCR trên gel agaroseNguyên tắc Nguyên tắc
Các phân tử acid nucleic tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Sự di chuyển này phụ thuộc vào kích thước của phân tử. Phân tử có kích thước càng lớn sẽ di chuyển trên gel càng chậm. Sau thời gian điện di, các phân tử acide nucleic trong hỗn hợp sẽđược phân tách theo kích thước [7].
Cách tiến hành
- Đổ gel: Cân 3g agarose, thêm 100 ml TAE 1X, đun cho tan hoàn toàn, để nguội đến 60oC, thêm 7,5 µl Ethidium bromide, lắc đều, đổ vào khuôn có lắp sẵn lược, chờ gel đông, đặt vào bồn điện di có chứa dung dịch TAE 1X.
- Điện di: thành phần điện di
Sản phẩm PCR 10 µl Dung dịch nạp mẫu (6X) 1 µl Chạy điện di trong 30 phút ở điện thế 60V.
2.4.14. Thiết lập phản ứng real-time PCR
Chúng tôi dùng mix cho phản ứng real-time PCR do Công ty TNHH CNSH Khoa Thương cung cấp và mẫu dò TaqMan do Công Ty IDT Inc. (Integrated DNA Technologies Incorporation) cung cấp.
Thành phần Thể tích (µl) Buffer Itaq 10X 2,5 MgCl2 50 mM 3,0 dNTP 10 mM 0,5 Itaq 5unit 0,125 Primer 25 µM 0,5 Probe 10 µM 0,5 Nước (đã xử lý DEPC) 12,875 cDNA 5,0
Chương trình của phản ứng real-time PCR [11]:
Bước 1: 95,0ºC trong 3,5 phút
Bước 2: thực hiện lặp lại trong 40 chu kỳ gồm
95,0ºC trong 15 giây
60,0ºC trong 1 phút
2.4.15. Phương pháp 2-∆∆∆∆∆∆∆∆Ct
Ct, Giá trị chu kỳ ngưỡng cho biết số chu kỳ mà tại đó số lượng phân tử mục tiêu được nhân bản đạt đến một giá trị ngưỡng cốđịnh.
ICt: sự chênh lệch giữa chu kì ngưỡng của phân tử mục tiêu (gene đích) và phân tử qui chiếu (gene chứng nội).
IICt: sự chênh lệch giữa các giá trị ICt.
Đối với phản ứng real-time PCR sử dụng các mẫu dò TaqMan, các giá trị chính xác của chu kì ngưỡng của gene đích và chu kì ngưỡng của gene chứng nội phụ thuộc vào rất nhiều các tác nhân bao gồm loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang được sử dụng trong mẫu dò, những ảnh hưởng của trình tự lên đặc tính phát huỳnh quang của mẫu dò, hiệu quả của quá trình phân cắt mẫu dò, độ tinh sạch của mẫu dò và tín hiệu huỳnh quang nền.
Đối với các amplicon được thiết kế ít hơn 150 bp và các thông số về nồng độ Mg2+ và mồi đã được tối ưu hóa, hiệu suất của phản ứng real-time PCR xấp xỉ bằng 1. Do vậy, hàm lượng của gene đích được chuẩn hóa với một gene chứng nội và tương quan với một giá trị chuẩn, được tính bởi công thức: 2 -∆∆Ct [31], [43].
Để tiến hành định lượng tương đối sự biểu hiện của ech42, chúng tôi sử dụng phương pháp 2-∆∆Ct với 18S rRNA là chứng nội. Mức độ biểu hiện theo thời gian của ech42 được tính toán dựa trên sự khác biệt x lần so với thông số chuẩn (thời điểm 0 giờ).
2.4.16. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập
Sử dụng phép phân tích phương sai một yếu tố trong Data Analysis (Ms-Excel, 2003) giúp so sánh các giá trị trung bình của hai hay nhiều mẫu trong khoảng tin cậy cho phép (p<0,05).
KẾT QUẢ
VÀ
Chúng tôi xin trình bày phần kết quả và thảo luận theo 3 nhóm kết quả như sau: