3.3.1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy trong môi trường SM
Môi trường SM là môi trường nhân tạo với thành phần chính là nguồn nitrogen và một số khoáng chất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào vi nấm Trichoderma, nhưng không chứa nguồn carbon. Do đó, cơ chất bổ sung vào môi trường SM trở thành nguồn carbon duy nhất cho vi nấm sử dụng. Nguồn carbon này là nhân tố kích thích sự biểu hiện gene mã hóa những hệ enzyme có khả năng chuyển cơ chất thành dạng đơn giản hơn mà vi nấm có thể sử dụng để tồn tại, sinh trưởng và phát triển.
Từ kết quả khảo sát ở môi trường TSM, chúng tôi tiến hành nuôi cảm ứng chủng
T. longibrachiatum TD16 trong môi trường SM chứa cơ chất chitin, vách tế bào nấm S. rolfsii. Các thí nghiệm nhằm xác định nồng độ thích hợp cho các cơ chất này để hiệu quả cảm ứng endochitinase là cao nhất được tiến hành. Đối với cơ chất chitin chúng tôi tiến hành khảo sát trên nồng độ khác nhau là 0,5, 1,0 và 1,5%; nồng độ vách tế bào nấm S. rolfsii là 0,25, 0,5 và 1,0%. Kết quả được trình bày ở bảng 6.5 và đồ thị 3.3.
HđC endochitinase và HđC chitinase thay đổi theo thời gian nuôi cấy. Ở thời điểm 0 giờ, endochitinase và chitinase chưa được cảm ứng tổng hợp hoặc được tổng hợp với một lượng rất nhỏ không thể ghi nhận được. Khi nuôi cấy cảm ứng chủng
T. longibrachiatum TD16 với chitin, ở thời điểm 24 giờ, HđC endochitinase và HđC chitinase được ghi nhận, tăng dần và đạt cực đại ở thời điểm 48 giờ với chitin nồng
Đồ thị 3.3. HĐC endochitinase và HĐC chitinase theo thời gian nuôi cấy trong dịch canh trường SM bổ sung các nồng độ chitin (0,5, 1,0 và 1,5%) hay vách tế bào
nấm S. rolfsii (0,25, 0,5 và 1,0%) theo thờigian nuôi cấy
H Đ C e n d o ch it in as e ( đ v h t/ m l)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
H Đ C c h it in as e ( đ v h t/ m l)
độ 0,5% và 1,5%. HđC endochitinase và HđC chitinase cao nhất ở nồng độ 1,0% (1,760 ± 0,013đvht/ml và 0,875 ± 0,134 đvht/ml) sau 72 giờ nuôi cấy.
Khi nuôi cấy cảm ứng với vách tế bào nấm S. rolfsii, ở thời điểm 24 giờ HđC endochitinase và HđC chitinase cũng được ghi nhận, tăng dần và đạt cực đại ở thời điểm 48 giờ ở 2 nồng độ 0,25%, 1,0%. HđC endochitinase và HđC chitinase cao nhất ở nồng độ 0,5% (3,77 ± 0,15 đvht/ml và 0,750 ± 0.036 đvht/ml) với thời gian nuôi cấy là 72 giờ.
Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng T.longibrachiatum TD16 trong môi trường SM chứa 1,0% chitin hoặc 0,5% vách tế bào nấm S. rolfsii. Sau 72 giờ nuôi cấy chúng tôi tiến hành tủa phân đoạn dịch môi trường với (NH4)2SO4 75% độ bão hòa nhằm thu nhận protein thô để điện di SDS-PAGE. Kết quả từ hình 3.3 chứng tỏ rằng sự hiện diện các băng protein tương ứng với endochitinase khi chủng
T. longibrachiatum TD16 được nuôi cấy lần lượt trên hai cơ chất trên trong môi trường SM tương tự như trong môi trường TSM đã được khảo sát ở trên, riêng ở cơ chất chitin 1,0%, endochitinase 36 kDa được ghi nhận thêm. Chúng tôi cũng nhận thấy, sự cảm ứng của endochitinase 42 kDa có thể ở mức độ khác nhau nhưng isozyme này luôn hiện diện khi chủng T. longibrachiatum TD16 được nuôi cấy trong cả hai môi trường TSM hoặc SM chứa cơ chất cảm ứng là chitin hay vách tế bào nấm S. rolfsii.
Hình 3.3. Kết quả SDS-PAGE hai mẫu tủa protein thu được từ dịch môi trường SM chứa chitin 1% (Chitin) hay vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% (SR) cùng với thang
trọng lượng phân tử thấp (LMW)
3.3.2. Định lượng tương đối sự biểu hiện gene mã hóa endochitinase 42 kDa kDa
Theo kết quả mục 3.2 và 3.3.1, chúng tôi nhận thấy endochitinase 42 kDa được cảm ứng sinh tổng hợp với cả hai cơ chất chitin và vách tế bào nấm S. rolfsii trong hai môi trường TSM và SM. Điều này phù hợp với những nghiên cứu trước đây, cũng cho endochitinase 42 kDa được cảm ứng sinh tổng hợp mạnh trên một phổ rộng vật liệu chitin, đặc biệt là một số vách tế bào nấm chứa chitin [5], [23], [33].
Chúng tôi tiếp tục tiến hành định lượng sự biểu hiện của gene mã hóa endochitinase 42 kDa là ech42 bằng phương pháp 2-∆∆Ctsử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR. Chủng T. longibrachiatum TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa 1,0% chitin hay 0,5% vách tế bào nấm S. rolfsii. Sinh khối được thu nhận
để tách chiết RNA tổng số. HĐC endochitinase trong dịch canh trường SM tương ứng được khảo sát theo thời gian 0, 24, 48, 72, 96 giờ.
Để thực hiện phương pháp 2-∆∆Ct sử dụng kĩ thuật real-time RT-PCR nhằm định lượng tương đối sự biểu hiện gene ech42 ở T. longibrachiatum TD16, trước hết chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho việc nhân bản ech42 từ cDNA ở T. longibrachiatum TD16; sau đó mẫu dò TaqMan được thiết kế và thử khả năng ứng dụng. Cuối cùng, chúng tôi sử dụng hệ thống này để thiết kế chương trình chạy real- time PCR cùng với gene chứng nội 18S rRNA.
3.3.2.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho ech42 ở T. longibrachiatum TD16 Thiết kế mồi Thiết kế mồi
Các cặp mồi được thiết kế dựa vào trình tự bảo tồn sau khi so sánh gióng cột (aglin) một số trình tự gene mã hóa ech42 ở Trichoderma trong Genbank (AJ605116.1, L14614.1, EU499380.1, EU035808.1, DQ377565.1, DQ377563.1, DQ377564.1, DQ377562.1, DQ166035.1, 166036.1, DQ132792.1).
Mồi xuôi ech42f: 5’- TTG GTC ACG TCG GAC ATC AC-3’ Mồi ngược ech42r: 5’- CCA GAG ACA ACA GTG CCG-3’
Cặp mồi của gene 18S rRNA được thiết kế dựa theo trình tự đã công bố của Sonja S.K.và cs (2006)[43]
Mồi xuôi 18Sf: 5’- GAA CCA GCG GAG GGA TCA T -3’ Mồi ngược 18Sr: 5’- CGA GGC AAC AGA TTG GTA ACG -3’
Sau khi thiết kế, các cặp mồi được kiểm tra các thông số lý thuyết bằng phần mềm Oligo Analyser (idtdna) (bảng 3.2).
Bảng 3.2. Các thông số lí thuyết của 2 cặp mồi
Các thông số mồi 18Sf 18Sr ech42f ech42r
Chiều dài (nucleotide) 19 21 20 18
Tm (oC) 65,4 64,8 65,9 64,1 %GC 57,9 52.4 55,0 61,1 Giá trị∆G nhỏ nhất của cấu trúc "kẹp tóc"(kcal/mol) 1,04 1,18 1,64 2,02 Giá trị ∆G nhỏ nhất của cấu trúc self-dimer (kcal/mol) -4,62 -3,9 -6,3 -3,61 Giá trị ∆G nhỏ nhất của cấu trúc heterodimer (kcal/mol) -6,37 -6.68
Theo khuyến cáo của IDT, nếu các cấu trúc thứ cấp của mồi có giá trị ∆G lớn hơn -9,0 kcal/mol thì các cấu trúc này không ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp chuyên biệt của mồi. Do khi sử dụng nhiệt độ bắt cặp cao trong phản ứng PCR, các cấu trúc này sẽ bị phá vỡ. Như vậy, có thể sử dụng các cặp mồi này cho mục đích khuếch đại gene đích.
Nhân bản gene đích
RNA tổng số được tách chiết từ sinh khối T. longibrachiatum TD16 theo mục 2.4.10 và chuyển thành cDNA bằng RT-PCR theo mục 2.4.11. Sau đó chúng tôi tiến hành nhân bản một đoạn của gene 18S rRNA (dài 74bp) và của gene ech42 (dài 74 bp) từ cDNA bằng phản ứng PCR với hai cặp mồi (18Sf, 18Sr) và (ech42f, ech42r). Kết quảđược trình bày ở hình 3.4.
Bên cạnh đó chúng tôi cũng thực hiện phản ứng PCR khuếch đại hai gene 18S rRNA và ech42 với mẫu RNA tổng số chưa được chuyển thành cDNA.
Kết quảở hình 3.5 chứng tỏ rằng mẫu RNA tổng số chúng tôi tách chiết được, nếu bị nhiễm bẩn bởi DNA bộ gene thì vẫn không được nhân bản nên không ảnh hưởng đến kết quả real-time PCR sau này.
Hình 3.4. Kết quảđiện di sản phẩm nhân bản của hai cặp mồi cho gene 18S rRNA (A) và ech42 (B)trên gel agarose 3% với L: thang DNA 100bp, c: mẫu chứng, 0: ngày 0, ch: mẫu cảm ứng với chitin 1,0%, sr: mẫu cảm ứng với vách
tế bào nấm S. rolfsii 0,5%
Hình 3.5. Kết quảđiện di sản phẩm nhân bản của hai cặp mồi cho gene 18S rRNA (S) và ech42 (C) trên gel agarose 3% với S1-2, và C1-2 là mẫu cDNA, S0 và C0 là
mẫu RNA tổng số
Khảo sát tính đặc hiệu của mồi
Để khẳng định chính xác sản phẩm được nhân bản là trình tự mong muốn, sản phẩm PCR được gửi giải trình tự hai chiều tại công ty TNHH Nam khoa.
Trình tự sản phẩm PCR của gene ech42gồm 74bp
5’-TTGGTCACGTCGGACATCACTCATGTCATCTACTCGTTCATGAACCTCCAAGCAGACGGCACTGTTGTCTCTGG-3’
Trình tự sản phẩm PCR của gene 18S rRNA gồm 74bp
5’-GAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCGTTACCAATCTGTTGCCTCG-3’
Sau khi đã có kết quả giải trình tự, chúng tôi sử dụng phần mềm BLAST (NCBI) để so sánh trình tự vừa giải được với toàn bộ các trình tự trên GenBank. Theo nguyên tắc của phần mềm BLAST, trình tự nhập vào để so sánh và trình tự kết quả càng tương đồng thì giá trị E của chúng sẽ càng nhỏ hoặc chỉ số score càng lớn.
Hình 3.6. Kết quả BLAST trình tự sản phẩm PCR của gene ech42
Dựa trên bảng kết quả BLAST (hình 3.6 và 3.7), chúng tôi nhận thấy trình tự sản phẩm PCR của chúng tôi có độ tương đồng cao với các trình tự có trên Genbank (chỉ số score lớn tương ứng bằng 118 với gene ech42 và 126 với gene 18S rRNA, và giá trị E rất nhỏ tương ứng bằng 3e-24 và e-26).
Như vậy, hai cặp mồi ech42 và 18S rRNA có tính đặc hiệu cao và dùng cho việc nhân bản hai gene này ởT. longibrachiatum TD16.
3.3.2.2. Thiết kế mẫu dò
Sau khi đã khảo sát các đặc tính của hai cặp mồi và khẳng định chúng có thể dùng được trong thí nghiệm này, mẫu dò TaqMan được thiết kế dựa trên trình tựđã giải, bắt được trong vùng nhân bản của gene ech42 và 18S rRNA.
ech42p: 5’FAM- CTGCTTGGAGGTTCATGAACGAGTAGATGACATGA-TAMRA3’
5’-TTGGTCACGTCGGACATCACTCATGTCATCTACTCGTTCATGAACCTCCAAGCAGACGGCACTGTTGTCTCTGG-3’
18Sp: 5’FAM- ACC GAG TTT ACA ACT CCC AAA CCC AAT GTG-TAMRA3’ 5’-GAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCGTTACCAATCTGTTGCCTCG-3’
Tương tự như đối với hai cặp mồi, chúng tôi tiến hành kiểm tra các thông số lý thuyết của hai mẫu dò (bảng 3.3).
Bảng 3.3. Thông số của hai mẫu dò được thiết kế
Các thông số Mẫu dò ech42p Mẫu dò 18Sp
Chiều dài (nucleotide) 35 30
Tm (oC) 72,0 71,1 %GC 45,7 46,7 Giá trị ∆G nhỏ nhất của cấu trúc "kẹp tóc"(kcal/mol) 1,6 0,65 Giá trị ∆G nhỏ nhất của cấu trúc self-dimer (kcal/mol) -15,1 -6,46 Giá trị ∆G nhỏ nhất của cấu trúc heterodimer (kcal/mol) -5,19 -7,71
với mồi xuôi tương ứng.
Giá trị ∆G nhỏ nhất của cấu trúc heterodimer (kcal/mol) với mồi ngược tương ứng.
-5,02 -8,44
Căn cứ vào các thông số tối ưu khi thiết kế mẫu dò [11], chúng tôi nhận thấy đặc tính của hai mẫu dò trên là khá tốt và có thể dùng được trong thí nghiệm này. Mặc dù cấu trúc self-dimer của ech42p có ∆G = -15,1(kcal/mol). Tuy nhiên đoạn mạch kép này có nhiệt độ nóng chảy (Tm) khoảng 20-30oC. Nên không bền ở nhiệt độ lai từ 54-60oC.
3.3.2.3. Kiểm tra hệ thống real-time PCR
Dựa vào các thông số của mồi và mẫu dò ở kết quả mục 3.3.2.1 và 3.3.2.2 chúng tôi thiết kế chương trình real-time PCR với nhiệt độ lai là 60oC cho hai gene ech42 và 18S rRNA, mục 2.4.14.
Chúng tôi quan sát hiệu quả hoạt động của hệ thống vừa được thiết lập: 2 cặp mồi, 2 mẫu dò và chương trình real-time PCR trên cDNA đã được giải trình tự của
ech42 và 18S rRNA.
Kết quả hình 3.8 cho thấy hệ thống real-time PCR cho gene 18S rRNA hoạt động tốt. Mẫu dò bắt cặp được trên cDNA bản mẫu trong vùng nhân bản của gene. Tín hiệu lên rõ cho thấy phản ứng thủy giải mẫu dò và tín hiệu huỳnh quang phát ra trong quá trình tiến hành phản ứng real-time PCR là tốt.
Tương tự như thế, kết quả hình 3.9 cũng cho thấy hệ thống real-time PCR cho gene ech42 hoạt động tốt.
Như vậy, hai hệ thống mồi, mẫu dò và chương trình real-time PCR mà chúng tôi đã thiết kếđược sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2.4. Khảo sát khả năng ứng dụng của phương pháp 2-∆∆∆∆∆∆∆∆Ct
Để phương pháp tính toán dựa trên ∆∆Ct có hiệu lực, các hệ số của quá trình nhân bản gene mục tiêu và gene chứng nội phải xấp xỉ bằng nhau hay hiệu suất nhân bảng tương đương nhau. Một phương pháp có tính nhạy dùng đểđánh giá liệu hai quá trình nhân bản có cùng hệ số hay không là dựa vào việc xác định giá trị ∆Ct thay đổi như thế nào so với sự pha loãng mẫu. Nếu hệ số góc của mối tương quan
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra hệ thống real-time PCR cho gene ech42
Cycle
giữa ∆Ct và độ pha loãng nằm trong khoảng từ 0 - 0,1, tương ứng với hiệu xuất nhân bản của 2 gene là như nhau, lúc này có thể áp dụng được phương pháp 2-∆∆Ct [31].
Dung dịch cDNA được pha loãng bậc 10 và tiến hành phản ứng real-time PCR định lượng. Kết quảđược trình bày trong bảng 3.4 và đồ thị 3.4.
Bảng 3.4. Giá trị QCt của hai gene tại các độ pha loãng khác nhau
(-): không xác định được
Đồ thị 3.4. Mối tương quan giữa độ pha loãng và giá trị∆Ct
Độ pha
loãng (X) Lg (X) Ct (ech42) Ct (18S rRNA)
∆ ∆∆ ∆Ct (ech42-18S rRNA) 100 0 25,33 16,86 8,47 101 1 27,02 19,52 7,5 102 2 30,56 23,96 6,6 103 3 35,62 26,7 8,92 104 4 - 30,49 - 105 5 - 35,18 - ∆∆∆∆ C t Lg (X)
Dựa vào kết quả thu nhận được, chúng tôi nhận thấy giá trị hệ số góc của phương trình tương quan giữa giá trị ∆Ct và độ pha loãng khá thấp (0,045) nằm trong khoảng cho phép 0 - 0,1. Như vậy phương pháp 2-∆∆Ct có thể được áp dụng cho các phân tích về sau.
Chúng tôi tiến hành khảo sát sự biểu hiện ở mức mRNA của gene ech42 trong các điều kiện cảm ứng khác nhau bằng phương pháp này.
3.3.2.5. Định lượng tương đối sự biểu hiện của ech42
Để phân tích mức độ biểu hiện tương đối của ech42 trong môi trường SM có bổ sung cơ chất chitin 1,0% hay vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% như nguồn carbon duy nhất, chúng tôi tiến hành real-time PCR với 3 lô mẫu độc lập cho từng thời điểm 0, 24, 48, 72, và 96 giờ. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.5 và 3.6.
Bảng 3.5. Mức độ biểu hiện tương đối của ech42khi chủng T. longibrachiatum
TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa chitin 1,0%
Mẫu ∆∆∆∆Ct*( Ctech42-Ct18S rRNA) ∆∆∆∆∆∆∆∆Ct 2-∆∆∆∆∆∆∆Ct **∆ 0 giờ 12,48 ± 0,44 0 1,0 24 giờ 11,18 ± 0,38 -1,3 2,5 48 giờ 10,78 ± 1,45 -1,7 3,2 72 giờ 10,18 ± 2,5 -2,3 4,9 96 giờ 11,38 ± 0,51 -1,1 2,1
Bảng 3.6. Mức độ biểu hiện tương đối của ech42 khi chủng T. longibrachiatum TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa vách tế bào nấm S.rolfsii 0,5%
Mẫu ∆∆∆∆Ct*( Ctech42-Ct18S rRNA) ∆∆∆∆∆∆∆∆Ct 2-∆∆∆∆∆∆∆Ct **∆ 0 giờ 12,48 ± 0,44 0 1,0 24 giờ 10,98 ± 0,63 -1,5 3,0 48 giờ 10,08 ± 0,43 -2,4 5,3 72 giờ 10,58 ± 0,49 -1,9 3,7 96 giờ 11,08 ± 1,17 -1,4 2,6 *giá trị trung bình
Dựa vào bảng số liệu 3.5 và 3.6 chúng tôi nhận thấy
Tại thời điểm 0 giờ, mức độ biểu hiện của gene ech42 là mức độ biểu hiện trong môi trường SM bổ sung glycerol 1,0%. Bản thân glycerol không phải là cơ chất cảm ứng của chitinase, nó là một nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được một cách tương đối dễ dàng (tuy không tốt như các loại đường khác như glucose hay sucrose). Có thể cho rằng mức độ biểu hiện tại thời điểm 0 giờ là mức độ biểu hiện ở trạng thái sinh lý bình thường của gene ech42, HđC endochitinase không được ghi nhận tại thời điểm này (bảng 3.7, đồ thị 3.5). Chúng tôi dùng mức độ biểu hiện ở thời điểm này như là một giá trị gốc để so sánh một cách tương đối mức độ biểu hiện ở các thời điểm khác thay đổi như thế nào (tăng bao nhiêu lần). Mức biểu hiện ở thời điểm này được quy ước là 1,0.
Sau khi được chuyển sang môi trường SM có bổ sung chitin 1,0% hoặc vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% như nguồn carbon duy nhất, điều kiện biến dưỡng đã thay đổi. Bản thân chitin hay vách tế bào nấm là một nguồn carbon khó sử dụng. Do vậy,