Để phân tích mức độ biểu hiện tương đối của ech42 trong môi trường SM có bổ sung cơ chất chitin 1,0% hay vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% như nguồn carbon duy nhất, chúng tôi tiến hành real-time PCR với 3 lô mẫu độc lập cho từng thời điểm 0, 24, 48, 72, và 96 giờ. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.5 và 3.6.
Bảng 3.5. Mức độ biểu hiện tương đối của ech42khi chủng T. longibrachiatum
TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa chitin 1,0%
Mẫu ∆∆∆∆Ct*( Ctech42-Ct18S rRNA) ∆∆∆∆∆∆∆∆Ct 2-∆∆∆∆∆∆∆Ct **∆ 0 giờ 12,48 ± 0,44 0 1,0 24 giờ 11,18 ± 0,38 -1,3 2,5 48 giờ 10,78 ± 1,45 -1,7 3,2 72 giờ 10,18 ± 2,5 -2,3 4,9 96 giờ 11,38 ± 0,51 -1,1 2,1
Bảng 3.6. Mức độ biểu hiện tương đối của ech42 khi chủng T. longibrachiatum TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa vách tế bào nấm S.rolfsii 0,5%
Mẫu ∆∆∆∆Ct*( Ctech42-Ct18S rRNA) ∆∆∆∆∆∆∆∆Ct 2-∆∆∆∆∆∆∆Ct **∆ 0 giờ 12,48 ± 0,44 0 1,0 24 giờ 10,98 ± 0,63 -1,5 3,0 48 giờ 10,08 ± 0,43 -2,4 5,3 72 giờ 10,58 ± 0,49 -1,9 3,7 96 giờ 11,08 ± 1,17 -1,4 2,6 *giá trị trung bình
Dựa vào bảng số liệu 3.5 và 3.6 chúng tôi nhận thấy
Tại thời điểm 0 giờ, mức độ biểu hiện của gene ech42 là mức độ biểu hiện trong môi trường SM bổ sung glycerol 1,0%. Bản thân glycerol không phải là cơ chất cảm ứng của chitinase, nó là một nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được một cách tương đối dễ dàng (tuy không tốt như các loại đường khác như glucose hay sucrose). Có thể cho rằng mức độ biểu hiện tại thời điểm 0 giờ là mức độ biểu hiện ở trạng thái sinh lý bình thường của gene ech42, HđC endochitinase không được ghi nhận tại thời điểm này (bảng 3.7, đồ thị 3.5). Chúng tôi dùng mức độ biểu hiện ở thời điểm này như là một giá trị gốc để so sánh một cách tương đối mức độ biểu hiện ở các thời điểm khác thay đổi như thế nào (tăng bao nhiêu lần). Mức biểu hiện ở thời điểm này được quy ước là 1,0.
Sau khi được chuyển sang môi trường SM có bổ sung chitin 1,0% hoặc vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% như nguồn carbon duy nhất, điều kiện biến dưỡng đã thay đổi. Bản thân chitin hay vách tế bào nấm là một nguồn carbon khó sử dụng. Do vậy, chủng T. longibrachiatum TD16 phải tăng cường biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme có thể phân hủy cơ chất thành dạng đơn giản để có thể sử dụng như nguồn dinh dưỡng. Một trong những gene được quan tâm là ech42, gene mã hóa cho endochitinase 42 kDa. Điều đó có thể giúp giải thích tại sao mức độ biểu hiện của ech42 tăng cao sau 24 giờ nuôi cấy, gấp 2,5 lần đối với chitin và 3,0 lần đối với vách tế bào nấm S. rolfsii. Đó cũng là thời điểm mà HđC endochitinase bắt đầu được ghi nhận, giá trị HđC endochitinase ở thời điểm 24 giờđối với chitin là 1,25 ± 0,13 đvht/ml, đối với vách tế bào nấm S. rolfsii là 1,24 ± 0,20 đvht/ml (bảng 3.7, đồ thị 3.5).
Đối với chitin, sau thời điểm 24 giờ, mức độ biểu hiện ech42 tiếp tục tăng và đạt cực đại ở thời điểm 72 giờ (tăng khoảng 5 lần), tương ứng với giá trị HđC endochitinase cao nhất (1,76 ± 0,13 đvht/ml). Sau đó mức độ biểu hiện bắt đầu giảm dần vì lượng cơ chất trong môi trường đã dần cạn kiệt, cùng với đó là sinh khối nấm bắt đầu bước vào pha suy tàn (môi trường trở nên đục, nhớt, sợi nấm chuyển màu vàng). Khuynh hướng tăng của sự biểu hiện mRNA ech42 và HđC
endochitinase là như nhau, chúng tỏ vai trò quyết định của endochitinase 42 kDa trong nhóm endochitinase được cảm ứng khi T. longibrachiatum TD16 được nuôi trong môi trường SM chứa chitin 1%. Sự biểu hiện ech42 ở mức mRNA cao dẫn đến HĐC endochitinase cao.
Đối với vách tế bào nấm S. rolfsii, sau 24 giờ nuôi cấy mức độ biểu hiện ech42 tiếp tục tăng và đạt cực đại ở thời điểm 48 giờ (tăng hơn 5 lần), tương ứng với HđC endochitinase ghi nhận được vào lúc này là 2,34 ± 0,21 đvhl/ml. HđC endochitinase cao nhất sau 72 giờ nuôi cấy (3,77 ± 0,15 đvht/ml), tương ứng với mức biểu hiện
ech42 giảm xuống còn gần 4 lần. Sự biểu hiện mRNA ech42 đạt giá trị cao nhất khi
T. longibrachiatum TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% sớm hơn 24 giờ so với giá trị cực đại HđC endochitianse. Như vậy, HđC endochitinase tăng lên cực đại từ 48 giờ đến 72 giờ không do endochitinase 42 kDa quyết định mà có thể do một hay nhiều endochitinase khác được sinh tổng hợp trong giai đoạn này. Điều này cho thấy sự phức tạp trong cơ chế cảm ứng biểu hiện ech42 từ mRNA đến protein khi cơ chất cảm ứng là vách tế bào nấm S. rolfsii.
Đặc biệt hơn, Trong khi đó HđC endochitinase chỉ giảm khoảng 2 lần sau khi đạt cực đại đối với chitin 1% thì giảm 4 lần đối với vách S. rolfsii 0,5%. Tất cảđiều trên có thểđược giải thích như sau:
- Bản thân chitin là các cơ chất khá tinh (98%), nên sự biển hiện của ech42 biến thiên phụ thuộc hàm lượng cơ chất cảm ứng có trong môi trường nuôi cấy theo cơ chế “bật – tắt”, hay nói cách khác là có hay không có cơ chất cảm ứng, nên sự biểu hiện của ech42 từ mRNA đến protein (enzyme) tương đối đồng thời. - Đối với vách tế bào nấm, một cơ chất thô, thành phần trong vách tế bào nấm đa dạng. Do vậy, theo chúng tôi, sự biểu hiện của ech42 được điều hòa bởi một cơ chế phức tạp hơn nhiều, không chỉ đơn thuần là do sự có mặt hay thiếu hụt của chất cảm ứng, mà là sự tác động đa chiều lên sự cảm ứng biểu hiện từ mức độ mRNA đến protein.
Bảng 3.7. Mức biểu hiện mRNA ech42và HđC endochitinase theo thời gian nuôi cấy trong dịch canh trường SM
chitin 1,0% (C) vách tế bào nấm S.rolfsii 0,5% (SR) Mẫu mức biểu hiện mRNA ech42 HĐC endochitinase (đvht/ml) mức biểu hiện mRNA ech42 HĐC endochitinase (đvht/ml) 0 giờ 1,0 0 1,0 0 24 giờ 2,5 1,25 ± 0,13 3,0 1,24 ± 0,20 48 giờ 3,2 1,48 ± 0,20 5,3 2,34 ± 0,21 72 giờ 4,9 1,76 ± 0,13 3,7 3,77 ± 0,15 96 giờ 2,1 0,89 ± 0,10 2,6 0,87 ± 0,19
Đồ thị 3.5. Mức biểu hiện mRNA ech42 và HđC endochitinase theo thời gian nuôi cấy trong dịch canh trường SM
Từ những kết quả trên chứng tỏ rằng endochitinase 42 kDa đóng một vai trò nhất định trong giai đoạn sớm của quá trình phân hủy vách tế bào nấm S. rolfsii ởT. longibrachiatum TD16. M ứ c b i ể u h i ệ n m R N A e c h 4 2
Thời gian nuôi cấy (giờ)
H Đ C e n d o ch it in as e ( đ v h t/ m l)
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN
VÀ
KẾT LUẬN
Dựa vào những kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Chúng tôi đã chọn lọc được chủng Trichoderma longibrachiatum TD16 từ
bộ giống 73 chủng Trichoderma sp. phân lập tại Việt Nam với khả năng sinh tổng hợp chitinase có hoạt độ cao hơn các chủng còn lại.
HđC endochitinase và HđC chitinase ở chủng T. longibrachiatum TD16 trong dịch canh trường TSM bổ sung 1,0% chitin đạt giá trị cao nhất (18,23 ± 1,31
đvht/ml và 6,035 ± 0,348 đvht/ml) tương ứng với thời gian nuôi cấy là 5 ngày. Cũng sau 5 ngày nuôi cấy trong môi trường TSM chứa 0,5% cơ chất vách tế bào nấm S. rolfsii, hoạt tính enzyme đo được cao nhất, HđC endochitinase 16,38 ± 0,32
đvht/ml, HđC chitinase 3,448 ± 0,868 đvht/ml.
2. Hai isozyme endochitinase được thu nhận khi nuôi cảm ứng chủng T. longibrachitatum TD16 trong môi trường TSM chứa chitin 1,0% có trọng lượng phân tử lần lượt là 52 kDa và 42 kDa, chứa vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% là 42 kDa và 36 kDa. Endochitinase 42 kDa được cảm ứng tổng hợp ở các hai loại cơ
chất.
3. Chúng tôi đã thiết kế mồi và mẫu dò TaqMan chuyên biệt cho gene ech42 của chủng T. longibrachiatum TD16 để định lượng tương đối sự biểu hiện của gene này bằng phương pháp 2-∆∆Ct sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR với gene 18S rRNA làm chứng nội. Gene ech42 được cảm ứng và biểu hiện ở những mức độ
khác nhau khi nuôi cảm ứng T. longibrachiatum TD16 trên các cơ chất khác nhau theo thời gian 0, 24, 48, 72 và 96 giờ. Gene nàybiểu hiện mạnh trên cơ chất vách tế
bào nấm Sclerotium rolfsii 0,5% tại thời điểm 48 giờ (tăng 5,3 lần) và trên chitin 1,0% lúc 72 giờ (tăng 4,9 lần).
Sự biểu hiện ech42 ở mức mRNA cao dẫn đến HđC endochitinase cao khi T. longibrachiatum TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa chitin. Đối với vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% thì sự biểu hiện cao nhất ở mức mRNA ech42 sớm hơn 24 giờ so với giá trị cực đại HđC endochitianse.
KIẾN NGHỊ
1. Tiến hành khảo sát đầy đủ các thông số tối ưu cho phản ứng PCR multiplex (dùng 2 cặp mồi và 2 mẫu dò cho 2 gene ech42 và 18S rRNA).
2. Khảo sát mức độ biểu hiện của ech42 ở mô hình in vivo.
3. Tiếp tục tìm hiểu và áp dụng qui trình này để khảo sát sự biểu hiện của một số
Tài liệu tiếng Việt
1. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kĩ Thuật sinh hoá, Nxb ĐHQG, HCM, trang
73-76
2. Thạch Thành Trung, Đặng Hoàng Quyên, Đinh Minh Hiệp (2009), Sự tổng hợp chitinase trên cơ chất chitin huyền phù và vách tế bào nấm sclerotium rolfsii từTrichoderma, Hội nghị khoa học và công nghệ lần thứ XI, ĐH Bách
Khoa,Tp. HCM, Nxb ĐHQG Tp. HCM, tr83-88.
Tài liệu tiếng Anh
3. Ada V., Ramot O., Chernin L., Chet I. (2002), Significance of lytic enzyms
from Trichoderma spp. In the biocontrol of fungal plant pathogens, Antonie
van Leeuwenhoek, 81, pp.549-556.
4. Baek M.J, Howell R.C., Kenerly M.C. (1998), the role of an extralcellular chitinase from Trichoderma virens Gv29-8 in the biocontrol of Rhizoctonia solani. Curr Gnett 35, pp. 41-50.
5. Carsolio C., Benhamou N., Haran S., Cortés C., Gutiérrez A., et al. (1998),
Role of the Trichoderma harzianum endochitinase gene, ech42, in
mycoparasitism, Appl. Environ. Microbiol., 65(3), pp. 929-935.
6. Chet I., Benhamou N., Haran S. (1998), Mycoparasitism and lytic enzymes
in Trichoderma & Gliocladium. Enzymes,biological control and commercial
applications (Harman, G. E. & Kubicek, C. P., eds) pp. 153-172, Taylor & Francis Ltd, UK.
7. Chomczynski P, Sacchi N. (1990), Single-step RNA isolation from cultured
cells or tissues. In: Ausubel F.M. Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. & Struhl K. eds. Current protocols in molecular
9. Dong-jin K., Jong-Min B., Pedro U., Charles M.K., Doiglas R.cook (2002) Cloning and characterization of multiple glycosyl hydrolase genes from
Trichoderma Virens. Curr Gnett, 40, pp. 374-384.
10.Donzelli B.G., Siebert K.J., Harman G.E. (2005), Response surface modeling
of factors influencing the production of chitinolytic and β-1,3-glucanolytic enzym in Trichoderma atroviride strain P1. Enzyme & Microb. Technol, 37 (1), pp. 82-92.
11.Dorak T.M. (2006), Real-time PCR, Taylor & Francis Group, UK. Pp.126- 137.
12.Druzhinina S.I., Kopchinskiy G.A., Kubicek P.C. (2006), The first 100
Trichoderma species characterized by molecular data, Mycoscience, 47, pp. 55- 64.
13.Elad Y., Kapat A. (1999), The role of Trichoderma harzianum protease in the biocontrol of Botrytis cinerea, Eur J Plant Pathol., 105, pp.177-189.
14.El-Katatny M.H., Gudelj M., Robra K.H., Elnaghy M.A., Guxbitz G.M.
(2001), Characterization of a chitinase and an endo β-1,3-glucanase from
Trichoderma harzianum Rifai T24 involed in control of the phytopathogen
Sclerotium rolfsii. Appl. Microbiol Biotechnol, 56, pp.137-143.
15.Esposito E., Silva M.D. (1998), Syntematics and environmental Application
of the genus Trichoderma. Critical Reviews in Microbiology, 24 (2), pp.89 – 98.
16.Estrella A. H., Chet I. (1993), Biocontrol of Bacteria and Phytopathogenic fungi, Agricutural Biotechnol., 269, pp.263-282.
17.Federica S., Claudia M.O.L., Ilaria P., Cesare G. (2008), Real-time PCR for
detection and quantification of the biocontrol agent Trichoderma atroviride
the mycoparasitic fungus Trichoderma harzianum. Curr Gnett, 27, pp. 83- 89.
19. Giuliano B., Donzelli G., Harman E.G. (2001), Interaction of Amonium, Glucose, and Chitin Regulates the Expression of Cell Wall-Degrading Enzymes in Trichoderma atroviride Strain P1, Environmental Microbiol, pp. 5643–5647.
20.Gohel V., Vyas P., Chhatpar S.H. (2004), Activity staining method of
chitinase on chitin agar plate through polyacrylamide gel electrophoresis,
African Journal of Biotechnology, 4 (1), pp. 87-90.
21.Gokul V., Lee J.H., Song K.B., Rhee S.K., Kim S.K., Panda T. (2000), Characterization and application of chitinase from Trichoderma harzianum,
A review, Bioprocess Engineering, 23, pp. 691-694.
22.Good T.A. và Beesman S.P. (1964), Determination of glucosamine and
galactosamine using borate buffers for modification of the Elson-Morgan and
Morgan-Elson reactions, Anal. Biochem. 9, pp. 253-262.
23.Harman G.E. (1992), Purified chitinase and use thereof. US. Patent
5.173.419.
24.Harman G.E., Hayes C.K., Lorito M., Broadway R.M. (1992), Chitinolytic
enzyme of Trichoderma harzianum: Purification of Chitobiosidase and
Endochitinase, Curr Gnett, 25, pp. 313-318.
25.Harman G.E., Howell R.C., Viterbo A., Chet I., Lorito M. (2004),
Trichoderma species-opportunitic, Avirulent plant symbionts, pP. 43-56.
26.Haran S., Schickler H., Oppenheim A., Chet I. (1996), Differential
expression of Trichoderma harzianum chitinase during mycoparasitism.
Molecular Plant Pathogeny, pp. 980-985.
27.Hirano S. (1988), Water soluble glycol chitin and carboxylmethylchitin.
Escherichia coli, Microbiol Biotechnol, 73, pp.294-303.
29.Inbar, J. & Chet, I. (1995), the role of recognition in the induction of specific
chitinases during mycoparasitism by Trichoderma harzianum, Microbiol.
141 (11), pp. 2823-2829.
30.Jolles P., Muzzarelli R.A.A. (1999), Chitin and Chitinase, Birhäuser-Verlag,
Basel, Switzerland, pp. 125-133.
31.Kenneth J.L., Thomas D.S. (2001), Analysis of relative gene expression data
using real-time quantitative PCR and the 2-Ct method, Methods 21, pp. 402- 408.
32.Kubicek C.P., Mach R.L., Peterbauer C.K., Lorito M. (2001), Trichoderma:
From genes to biocontrol. Journal of Plant Pathology, 83, pp.11-23.
33.Lima L.H.C., De Marco J.L., Cirano J.U., Felix C.R. (1999), Synthesis of a
Trichoderma chitinase which affects the Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani cell walls, Folia Microbiol, 44, pp.45-49.
34. Lorito M. (1998), Chitinolytic enzymes and their genes. In: Harman G.E.
and Kubicek C.P. Trichoderma andGliocladium. Vol.2. Enzymes, biological
control and commercial applications. Taylor and Francis Ltd. London, UK, pp.73-142.
35.Mach R.L., Peterbauer C.K., Payer K., Jaksits S., Woo S.L. (1999),
Expression of two major chitinase genes of Trichoderma atroviride (T. harzianum P1) is triggered by different regulatory signals, Appl. Environ. Microbiol. 65 (5), pp. 1858-1863.
36.Moreno C.A., Castillo F., Gonza´ lez A., Bernal D., Jaimes Y. (2009), Biological and molecular characterization of the response of tomato plants treated with Trichoderma koningiopsis, Physiological and Molecular Plant Pathology, pp.1–10.
polyacrylamide gel electrophoresis or isoelectrofocusing. Phytophthology, pp. 43-50.
38.Patil R.S., Ghormade V., Deshpande M.V. (2000), Chitinolytic enzymes: an
exploration, Enzyme and Microbial Technology, 26, pp. 473-483.
39.Perez-leblic M.I., Reyes F., Laboz R., Archer S.A. (1982), Autolysis of
Penicillium oxalicum with special reference to its cell walls. Canadian
Journal of Microbiology, 28, pp. 1289-1295.
40.Philippovich Y.B., Egorova T.A., Sevastyanova, G.A. (1975) Practical work
on common biochemistry. Prosveschenie Press, Moscow, Russia.
41.Samuels G.J. (2006), Trichoderma: systematic, the sexual state, and ecology.
Phytopathology 96, pp.195-206.
42.Shubakov A.A., Kucheryavykh P.S. (2004), Chitinolytic activity of
filamentous fungi, Appl. Biochem. Microbiol., 40(5), pp. 445-447.
43.Sonija S.K, Jihong L.C., Ingunn A.H., Vincent G.H.E., May-Bente B.
(2006), Molecular cloning, characterization, and expression studies of a
novel chitinase gene (ech30) from the mycoparasite Trichoderma atroviride
strain P1, FEMS Microbiol let, 256, pp. 282-289.
44.Tharanathan R.N., Kittur F.S. (2003) Chitin- The Undisputed Biomolecule of
Great Potential, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43(1), pp. 61-87.
45.Trudel J., Asselin A. (1988), Detection of Chitinase acitivity after
polyacrylamide gel electrophoresis, Biochemistry, 178, pp. 362-368.
46.Verena S. (2008), Chitinases of filamentous fungi: a large group of diverse proteins with multiple physiological functions, fungal biology reviews, 22, pp. 36-42.
48.Zaldívar M., Velquez C.J., Contreras I., Pérez M.L. (2001), Trichoderma
aureoviride 7-121, a mutant with enhanced production of lytic enzymes: its
potential use in waste cellulose degradation and/or biocontrol, Electronic Journal of Biotechnol, 4(3), pp. 160-168.
Tài liệu internet
49.http://www.agrobiological.com/glossary/G1719.htm
Bài báo
1. Đinh Minh Hiệp, Thạch Thành Trung, Hồ Thị Thu Linh, nghiên cứu sự cảm
ứng isozyme endochitinase ở Trichoderma longibrachiatum. Tạp chí Khoa học và phát triển công nghệ, ĐHQG Tp.HCM, tr 34-41.
2. Quang-Chung Dao, Thanh-Trung Thach, Minh-Hiep Dinh, Thuy-Duong Ho