longibrachiatum TD16
3.2.1. Khảo sát hoạt độ chung endochitinase và chitinase ở chủng T. longibrachiatum TD16 theo thời gian nuôi cấy trong môi trường TSM với nồng
độ cơ chất cảm ứng khác nhau
Trong môi trường TSM, ngoài thành phần nguồn carbon có sẵn như acid citric, sucrose nhằm duy trì sự phát triển ban đầu thì chitin hay vách tế bào nấm bổ sung là nguồn cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp enzyme.
Nhằm xác định thời điểm thu nhận enzyme có hoạt tính cao nhất trên môi trường nuôi cấy cảm ứng, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự biến đổi HđC endochitinase và chitinase trong dịch chiết môi trường từ ngày 1 đến ngày 8 khi nuôi cấy lắc chủng T. longibrachiatum TD16 trong môi trường TSM bổ sung 0,5, 1,0, 1,5, 2,0% chitin; 0,5, 1,0, 1,5% vách tế bào nấm S. rolfsii hoặc P. capcisi theo mục 2.4.5. Đo HĐC endochitinase và chitinase theo mục 2.4.6.
Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 6.3, 6.4, và đồ thị 3.1, 3.2. Biểu đồ 3.1. HĐC chitinase của năm chủng Trichoderma sp.
Chitin
Đồ thị 3.1. HĐC endochitinase và HđC chitinase theo thời gian nuôi cấy trong môi trường TSM bổ sung các nồng độ chitin (0,5, 1,0, 1,5 và 2,0%)
Từđồ thị 3.1 chúng tôi nhận thấy:
HđC endochitinase và HđC chitinase trong môi trường nuôi cấy ở những thời điểm khác nhau tương ứng với các nồng độ chitin có sự biến đổi khác nhau. Chúng đều được cảm ứng sớm vào ngày nuôi cấy thứ nhất, tăng dần và đạt cực đại vào ngày nuôi cấy thứ 3 đối với chitin 0,5%, ngày nuôi cấy thứ 5 đối với chitin 1,0%, ngày nuôi cấy thứ 6 đối với chitin 1,5% và ngày nuôi cấy thứ 7 đối với chitin 2,0%.
H Đ C c h it in as e ( đ v h t/ m l)
Thời gian nuôi cấy (ngày)
H Đ C e n d o ch it in as e ( đ v h t/ m l)
HđC endochitinase và HĐC chitinase ở chủng T. longibrachiatum TD16 trong dịch nuôi cấy TSM bổ sung 1,0% chitin đạt giá trị cao nhất (18,23 ± 1,31 đvht/ml và 6,035 ± 0,348 đvht/ml) tương ứng với thời gian nuôi cấy là 5 ngày. Do vậy, đối với cơ chất chitin, chúng tôi chọn nồng độ 1,0% và thời gian nuôi cấy 5 ngày để tiến hành các thí nghiệm sau này.
Biện luận
Theo thời gian nuôi cấy, song song với quá trình tăng trưởng của vi nấm có thể nhu cầu dinh dưỡng cũng tăng nên nguồn carbon và nitrogen có sẵn trong môi trường cạn dần. Với môi trường TSM có bổ sung 0,5% chitin, lượng cơ chất không đủ cho sự tăng sinh khối và tiết enzyme tối ưu. Do đó giá trị cực đại HđC endochitinase thấp hơn so với các nồng độ chitin khác. Với môi trường bổ sung 1,5% và 2,0% chitin có thể sẽ kéo dài pha tăng trưởng của vi nấm nên sản phẩm cuối tích tụ ngày càng nhiều. Có thể đây là nguyên nhân làm giảm HđC endochitinase cũng như HđC chitinase. Trong khi đó, nồng độ chitin 1,0% thích hợp nhất cho quá trình tăng trưởng và cảm ứng sinh tổng hợp enzyme. HđC endochitinase và chitinase cao hơn so với các lô thí nghiệm còn lại.
Sau thời điểm hoạt động tối đa, hoạt độ enzyme giảm dần đối với cả 4 nồng độ cơ chất bởi vi nấm bước vào pha suy tàn và quá trình kiềm chế dị hóa của các sản phẩm cuối.
Sự biến đổi HđC endochitinase và HđC chitinase có tính tương đồng, thể hiện vai trò quan trọng của sự cảm ứng endochitinase trong toàn hệ enzyme thủy giải chitin suốt quá trình cảm ứng của T. longibrachiatum TD16. HđC chitinase cao, tương ứng với HđC endochitinase cao và ngược lại [2], [14].
Cơ chất vách tế bào nấm S. rolfsii (S.R) và P. capsici (P.C)
Đồ thị 3.2. HđC endochitinase và HđC chitinase theo thời gian nuôi cấy trong dịch canh trường TSM bổ sung các nồng độ vách tế bào nấm S. rolfsii (0,5, 1,0 và 1,5%)
và P. capsici (0,5, 1,0 và 1,5%)
Tương tự như cơ chất chitin, từ kết quả của đồ thị 3.2 cho thấy, HĐC endochitinase và HđC chitinase biến đổi theo thời gian nuôi cấy. Endochitinase và chitinase đều được cảm ứng sớm vào ngày nuôi cấy thứ nhất, tăng dần và HĐC đạt
H Đ C e n d o ch it in as e ( đ v h t/ m l)
Thời gian nuôi cấy (ngày)
H Đ C c h it in as e ( đ v h t/ m l)
cao nhất ở nồng độ vách tế bào nấm 0,5% sau 5 ngày nuôi cấy. Đối với 0,5% vách tế bào nấm S. rolfsii, giá trị HđC endochitinase là 16,38 ± 0,32 đvht/ml và HđC chitinase là 3,448 ± 0,868 đvht/ml. Trong khi với 0,5% vách tế bào nấm P. capsici
giá trị HđC endochitinase là 15,54 ± 0,64 đvht/ml và HđC chitinase là 3,103 ± 0,310 đvht/ml.
Bên cạnh đó, khi nuôi cấy cảm ứng chủng T. longibrachiatum TD16 trong môi trường TSM chứa vách tế bào nấm S. rolfsii hoặc P. capsici, HđC chitinase chỉ bằng khoảng 50% so với khi cảm ứng bởi chitin, trong khi đó HĐC endochitinase đạt từ 85 - 90%. Điều này chứng tỏ cơ chất vách tế bào nấm cảm ứng một lượng lớn endochitinase trong toàn hệ enzyme thủy giải chitin ở chủng T. longibrachiatum
TD16, cao hơn đối với cơ chất chitin.
Biện luận
Chitin là một trong những thành phần quan trọng cấu tạo nên vách tế bào nấm S. rolfsii (thuộc lớp nấm Đảm Basidiomycetes), nên có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp hệ enzyme thủy phân chitin ở T. longibrachiatum TD16. Tuy nhiên, HđC endochitinase và HĐC chitinase cũng được ghi nhận đối với nấm P. capsici (thuộc lớp nấm Noãn Oomycetes), vách tế bào chủ yếu được cấu tạo từ cellulose và β- glucan. Điều này cho thấy cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp hệ enzyme thủy giải chitin tương đối phức tạp, không đơn thuần là có hay không có cơ chất cảm ứng chitin.
Hơn nữa, ngoài chitin, vách tế bào nấm còn được cấu thành từ một số thành phần quan trọng khác như β-glucan, protein… nên trong thành phần môi trường, chitin không phải là nguồn cơ chất cảm ứng duy nhất. Kết quả là, bên cạnh sự cảm ứng sinh tổng hợp hệ enzyme thủy giải chitin, chủng T. longibrachiatum TD16 có thể còn sinh tổng hợp các hệ enzyme khác như β-glucanase, protease… Quá trình tổng hợp những hệ enzyme này có thể ức chế một phần sự biểu hiện gen mã hoá cho hệ enzyme thủy phân chitin và hoạt độ của chúng, nên HđC đo được thấp hơn so với khi cảm ứng bởi chitin huyền phù. Điều này phù hợp với nhận định của El- Katatny M.H. và cs (2001) đã được nêu ở phần tổng quan [14]: sự cảm ứng sinh tổng hợp hệ enzyme thủy giải chitin với hoạt tính cao đối với những cơ chất có liên
kết polymer N-acetyl- D-glucosamine, và bị ức chế bởi những cơ chất không phải chitin.
Bên cạnh đó, tỉ lệ % HđC endochitinase/ HđC chitinase khi cảm ứng bởi vách tế bào nấm cao hơn hẳn khi cảm ứng bằng chitin huyền phù từ 35-40%. Có thể do trong thành phần vách tế bào nấm, chitin ở trạng thái liên kết với nhiều thành phần khác như petidoglucan, lipoprotein… tạo thành một cấu trúc phức tạp. Cấu trúc này tăng cường sự cảm ứng sinh tổng hợp endochitinase [14]. Điều này phù hợp với một số nghiên cứu trước đây của chúng tôi [2] và một số tác giả [25], [33].
3.2.2. Xác định sự hiện diện của các isozyme endochitinase
Từ kết quả mục 3.2.1, chúng tôi bổ sung chitin 1,0% hoặc vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% vào môi trường TSM để nuôi cấy T. longibrachiatum TD16. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành thu tủa enzyme thô và khảo sát sự hiện diện các dạng isozyme endochitinase của chủng T. longibrachiatum TD16 bằng điện di native- PAGE theo mục 2.4.9.
Kết quả quan sát từ hình 3.1 thể hiện rõ hai băng hoạt độ endochitinase khi nuôi cấy chủng T. longibrachiatum TD16 trong môi trường TSM chứa 0,5% vách tế bào nấm S. rolfsii như là nguồn carbon cảm ứng (hình 3.1B, giếng 2); tương tựđối với cơ chất chitin 1,0%, chủng Trichoderma này cũng cảm ứng biểu hiện hai băng hoạt độ endochitinase sau 5 ngày nuôi cấy (hình 3.1A, giếng 2).
Sự biểu hiện của các băng protein khi nuôi cấy chủng T. longibrachiatum TD16 trên hai cơ chất khác nhau cũng khác nhau (hình 3.1, giếng 1). Điều này có thể lý giải vì ngoài chitin, vách tế bào nấm được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau như β-glucan, protein... nên có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp các hệ enzyme thủy phân khác. Hơn nữa, không phải tất cả các băng protein được quan sát trên gel polyacrylamide đều mang hoạt độ endochitinase. Tương ứng với những băng protein đó, chỉ có hai băng là isozyme endochitinase được biểu hiện bởi chủng T. longibrachiatum TD16 khi nuôi cấy lần lượt trên cơ chất chitin 1,0% hoặc vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5%.
Hình 3.1. Các băng protein trên gel polyacrylamide sau khi chạy native-PAGE nhuộm comassive brilliant blue (giếng 1) và nhuộm cơ chất đặc hiệu endochitinase
trên gel agarose (giếng 2) tương ứng hình A-protein thu nhận khi cảm ứng bởi chitin (chi), hình B-protein thu nhận khi cảm ứng bởi
vách tế bào nấm S. rolfsii (SR).
3.2.3. Xác định trọng lượng phân tử các isozyme endochitinase
Từ các phân đoạn có hoạt độ endochitinase được xác định ở trên, chúng tôi tiến hành rửa giải băng protein có HđC endochitinase từ gel polyacrylamide sau điện di native-PAGE trong đệm Tris-HCl pH 6,8. Xác định trọng lượng phân tử các isozyme đó bằng phương pháp SDS-PAGE. Kết quả thể hiện ở hình 3.2.
A A A B Chi1 Chi2 SR1 SR2
Hình 3.2. Kết quả SDS-PAGE hai isozyme endochitinase. Cơ chất cảm ứng là chitin 1% (Chi1 và Chi2) và vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% (SR1 và SR2) cùng với
mẫu thô tương ứng (Chi và SR)
Đối chiếu kết quả với đường chuẩn thang protein ở bảng 6.8 và đồ thị 6.1 cho thấy khi cơ chất cảm ứng chitin 1,0% thì hai phân đoạn isozyme endochitinase có trọng lượng phân tử lần lượt 52 kDa (Chi1) và 42 kDa (Chi2); khi cơ chất cảm ứng vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% là 42 kDa (SR1) và 36 kDa (SR2). Endochitinase 42 kDa được cảm ứng sinh tổng hợp ở cả hai loại cơ chất. Theo những nghiên cứu của một số tác giả trước đây cũng đã chứng minh, endochitinase 42 kDa ở Trichoderma
được cảm ứng tổng hợp một cách thường xuyên, và trên một phổ rộng cơ chất khác nhau. Đặc biệt sự sinh tổng hợp chitinase được cảm ứng biểu hiện mạnh khi cơ chất cảm ứng là vách một số tế bào nấm gây bệnh thực vật [5], [33].
Từ những kết quả trên, chúng tôi chọn gene ech42, gene mã hóa cho endochitinase 42 kDa làm đối tượng cho việc định lượng tương đối sự biểu hiện gene sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR và phương pháp 2-∆∆Ct. Tuy nhiên để việc định lượng sự biểu hiện ech42 khi cảm ứng với cơ chất một cách chính xác, T. longibrachiatum TD16 cần được nuôi trong môi trường chứa cơ chất cảm ứng như nguồn carbon duy nhất.
3.3. Khảo sát sự biểu hiện của ech42 ở T. longibrachiatum TD16 3.3.1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy trong môi trường SM 3.3.1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy trong môi trường SM
Môi trường SM là môi trường nhân tạo với thành phần chính là nguồn nitrogen và một số khoáng chất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào vi nấm Trichoderma, nhưng không chứa nguồn carbon. Do đó, cơ chất bổ sung vào môi trường SM trở thành nguồn carbon duy nhất cho vi nấm sử dụng. Nguồn carbon này là nhân tố kích thích sự biểu hiện gene mã hóa những hệ enzyme có khả năng chuyển cơ chất thành dạng đơn giản hơn mà vi nấm có thể sử dụng để tồn tại, sinh trưởng và phát triển.
Từ kết quả khảo sát ở môi trường TSM, chúng tôi tiến hành nuôi cảm ứng chủng
T. longibrachiatum TD16 trong môi trường SM chứa cơ chất chitin, vách tế bào nấm S. rolfsii. Các thí nghiệm nhằm xác định nồng độ thích hợp cho các cơ chất này để hiệu quả cảm ứng endochitinase là cao nhất được tiến hành. Đối với cơ chất chitin chúng tôi tiến hành khảo sát trên nồng độ khác nhau là 0,5, 1,0 và 1,5%; nồng độ vách tế bào nấm S. rolfsii là 0,25, 0,5 và 1,0%. Kết quả được trình bày ở bảng 6.5 và đồ thị 3.3.
HđC endochitinase và HđC chitinase thay đổi theo thời gian nuôi cấy. Ở thời điểm 0 giờ, endochitinase và chitinase chưa được cảm ứng tổng hợp hoặc được tổng hợp với một lượng rất nhỏ không thể ghi nhận được. Khi nuôi cấy cảm ứng chủng
T. longibrachiatum TD16 với chitin, ở thời điểm 24 giờ, HđC endochitinase và HđC chitinase được ghi nhận, tăng dần và đạt cực đại ở thời điểm 48 giờ với chitin nồng
Đồ thị 3.3. HĐC endochitinase và HĐC chitinase theo thời gian nuôi cấy trong dịch canh trường SM bổ sung các nồng độ chitin (0,5, 1,0 và 1,5%) hay vách tế bào
nấm S. rolfsii (0,25, 0,5 và 1,0%) theo thờigian nuôi cấy
H Đ C e n d o ch it in as e ( đ v h t/ m l)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
H Đ C c h it in as e ( đ v h t/ m l)
độ 0,5% và 1,5%. HđC endochitinase và HđC chitinase cao nhất ở nồng độ 1,0% (1,760 ± 0,013đvht/ml và 0,875 ± 0,134 đvht/ml) sau 72 giờ nuôi cấy.
Khi nuôi cấy cảm ứng với vách tế bào nấm S. rolfsii, ở thời điểm 24 giờ HđC endochitinase và HđC chitinase cũng được ghi nhận, tăng dần và đạt cực đại ở thời điểm 48 giờ ở 2 nồng độ 0,25%, 1,0%. HđC endochitinase và HđC chitinase cao nhất ở nồng độ 0,5% (3,77 ± 0,15 đvht/ml và 0,750 ± 0.036 đvht/ml) với thời gian nuôi cấy là 72 giờ.
Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng T.longibrachiatum TD16 trong môi trường SM chứa 1,0% chitin hoặc 0,5% vách tế bào nấm S. rolfsii. Sau 72 giờ nuôi cấy chúng tôi tiến hành tủa phân đoạn dịch môi trường với (NH4)2SO4 75% độ bão hòa nhằm thu nhận protein thô để điện di SDS-PAGE. Kết quả từ hình 3.3 chứng tỏ rằng sự hiện diện các băng protein tương ứng với endochitinase khi chủng
T. longibrachiatum TD16 được nuôi cấy lần lượt trên hai cơ chất trên trong môi trường SM tương tự như trong môi trường TSM đã được khảo sát ở trên, riêng ở cơ chất chitin 1,0%, endochitinase 36 kDa được ghi nhận thêm. Chúng tôi cũng nhận thấy, sự cảm ứng của endochitinase 42 kDa có thể ở mức độ khác nhau nhưng isozyme này luôn hiện diện khi chủng T. longibrachiatum TD16 được nuôi cấy trong cả hai môi trường TSM hoặc SM chứa cơ chất cảm ứng là chitin hay vách tế bào nấm S. rolfsii.
Hình 3.3. Kết quả SDS-PAGE hai mẫu tủa protein thu được từ dịch môi trường SM chứa chitin 1% (Chitin) hay vách tế bào nấm S. rolfsii 0,5% (SR) cùng với thang
trọng lượng phân tử thấp (LMW)
3.3.2. Định lượng tương đối sự biểu hiện gene mã hóa endochitinase 42 kDa kDa
Theo kết quả mục 3.2 và 3.3.1, chúng tôi nhận thấy endochitinase 42 kDa được cảm ứng sinh tổng hợp với cả hai cơ chất chitin và vách tế bào nấm S. rolfsii trong hai môi trường TSM và SM. Điều này phù hợp với những nghiên cứu trước đây, cũng cho endochitinase 42 kDa được cảm ứng sinh tổng hợp mạnh trên một phổ rộng vật liệu chitin, đặc biệt là một số vách tế bào nấm chứa chitin [5], [23], [33].
Chúng tôi tiếp tục tiến hành định lượng sự biểu hiện của gene mã hóa endochitinase 42 kDa là ech42 bằng phương pháp 2-∆∆Ctsử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR. Chủng T. longibrachiatum TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa 1,0% chitin hay 0,5% vách tế bào nấm S. rolfsii. Sinh khối được thu nhận
để tách chiết RNA tổng số. HĐC endochitinase trong dịch canh trường SM tương ứng được khảo sát theo thời gian 0, 24, 48, 72, 96 giờ.
Để thực hiện phương pháp 2-∆∆Ct sử dụng kĩ thuật real-time RT-PCR nhằm định lượng tương đối sự biểu hiện gene ech42 ở T. longibrachiatum TD16, trước hết chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho việc nhân bản ech42 từ cDNA ở T. longibrachiatum TD16; sau đó mẫu dò TaqMan được thiết kế và thử khả năng ứng dụng. Cuối cùng, chúng tôi sử dụng hệ thống này để thiết kế chương trình chạy real- time PCR cùng với gene chứng nội 18S rRNA.
3.3.2.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho ech42 ở T. longibrachiatum TD16 Thiết kế mồi Thiết kế mồi
Các cặp mồi được thiết kế dựa vào trình tự bảo tồn sau khi so sánh gióng cột (aglin) một số trình tự gene mã hóa ech42 ở Trichoderma trong Genbank (AJ605116.1, L14614.1, EU499380.1, EU035808.1, DQ377565.1, DQ377563.1, DQ377564.1, DQ377562.1, DQ166035.1, 166036.1, DQ132792.1).
Mồi xuôi ech42f: 5’- TTG GTC ACG TCG GAC ATC AC-3’ Mồi ngược ech42r: 5’- CCA GAG ACA ACA GTG CCG-3’
Cặp mồi của gene 18S rRNA được thiết kế dựa theo trình tự đã công bố của