Để phương pháp tính toán dựa trên ∆∆Ct có hiệu lực, các hệ số của quá trình nhân bản gene mục tiêu và gene chứng nội phải xấp xỉ bằng nhau hay hiệu suất nhân bảng tương đương nhau. Một phương pháp có tính nhạy dùng đểđánh giá liệu hai quá trình nhân bản có cùng hệ số hay không là dựa vào việc xác định giá trị ∆Ct thay đổi như thế nào so với sự pha loãng mẫu. Nếu hệ số góc của mối tương quan
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra hệ thống real-time PCR cho gene ech42
Cycle
giữa ∆Ct và độ pha loãng nằm trong khoảng từ 0 - 0,1, tương ứng với hiệu xuất nhân bản của 2 gene là như nhau, lúc này có thể áp dụng được phương pháp 2-∆∆Ct [31].
Dung dịch cDNA được pha loãng bậc 10 và tiến hành phản ứng real-time PCR định lượng. Kết quảđược trình bày trong bảng 3.4 và đồ thị 3.4.
Bảng 3.4. Giá trị QCt của hai gene tại các độ pha loãng khác nhau
(-): không xác định được
Đồ thị 3.4. Mối tương quan giữa độ pha loãng và giá trị∆Ct
Độ pha
loãng (X) Lg (X) Ct (ech42) Ct (18S rRNA)
∆ ∆∆ ∆Ct (ech42-18S rRNA) 100 0 25,33 16,86 8,47 101 1 27,02 19,52 7,5 102 2 30,56 23,96 6,6 103 3 35,62 26,7 8,92 104 4 - 30,49 - 105 5 - 35,18 - ∆∆∆∆ C t Lg (X)
Dựa vào kết quả thu nhận được, chúng tôi nhận thấy giá trị hệ số góc của phương trình tương quan giữa giá trị ∆Ct và độ pha loãng khá thấp (0,045) nằm trong khoảng cho phép 0 - 0,1. Như vậy phương pháp 2-∆∆Ct có thể được áp dụng cho các phân tích về sau.
Chúng tôi tiến hành khảo sát sự biểu hiện ở mức mRNA của gene ech42 trong các điều kiện cảm ứng khác nhau bằng phương pháp này.