KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN HỆ PROTEIN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA THƠM Ở ĐỒNG BẲNG SÔNG CỬU LONG BẰNG KỸ THUẬT ĐIỆN DI LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  B GIÁO DỤ C VÀ ĐÀO ĐÀO TẠ O  TRƯ Ờ NG ĐẠ I HỌ C CẦ N THƠ VIỆỆ N NGHIÊ VI GHIÊN N CỨ CỨ U VÀ PHÁT PHÁT TRI TRIỂ N CÔNG CÔNG NGHỆ NGHỆ SIN SINH HỌ C L U Ậ N V Ă N T Ố T N G H IỆ P Đ Ạ I H Ọ C   N GÀ G À NH NH CÔ C Ô NG NG N GH GH Ệ S IN H H Ọ C K HẢ O SÁT S Ự BIỂ U H IỆ N HỆ PR O T EIN CỦ A M T SỐ   GIỐ NG LÚA T H Ơ M Ở ĐỒ NG BẰ NG SÔ SÔNG CỬ U LONG BẰ NG KĨ THUẬ T ĐIỆ N DI CÁN CÁ N BỘ HƯ Ớ NG DẪ N TS TRẦ TRẦ N NHÂN NHÂN DŨ NG SI SINH NH VI VIÊN ÊN THỰ THỰ C HI HIỆỆ N NHÂM NHÂM THỊ THỊ THU THỦ THỦ Y MSSV: 3064419 LỚ P: CNSH CNSH TIÊN TIÊN TIÉN K32 Cần Thơ, tháng 11/2010   PHẦ N KÝ DUYỆ T CÁN B HƯ Ớ NG DẪ N SINH VIÊN THỰ C HIỆ N Trần Nhân Dũng Nhâm Thị Thu Thủy DUYỆ T CỦ A H I ĐỒ NG BẢ O VỆ LUẬ N VĂN C n Thơ Thơ , ngày tháng 11 năm 2010  CHỦ TỊ CH CH H I ĐỒ NG TS TR TRƯ Ơ NG TRỌ NG NGÔN   LỜ I CẢ M T Luận văn tốt nghiệp khơng phải cơng trình q lớn lao đánh dấu kết kết trình học tậ tậpp suốt mư ời sáu nă năm m Đ ể hoàn thành thàn h tốt luận văn em nhận giúp đỡ từ nhiều người Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: TS Trần Nhân Dũng tận tình tình dạy bảo, hướ hướng ng dẫ dẫn, n, thăm hỏi động viên Th.S Trần ThịXuân Mai giúp đỡ, hỗ trợ chỉbảo CN Nguyễn ThịXuân Dung theo sát, chia sẻ kinh nghiệm quý báu suốt thời gian làm luận văn CN Nguyễn Vũ Linh hỗ trợ q trình hồn thành luận văn Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học thầy cô Viện quan tâm, hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học Tiên Tiến K32 giúp đỡ, chia sẻ học tập sống Con xin dành lời tri ân sâu sắc đến ông bà, cha mẹ nuôi nấng, dạy bảo nên người Ơng bà, cha mẹ ln chỗ dựa vững   TÓM L Ợ C    Nhằ m thiế t lậ p quy trình trích ly protein prot ein từ hạ t lúa nghiên ng hiên u biể u hiệ n hệ    protein  prote in củ a mộ t số giố ng lúa thơ m ĐBSCL, thí nghiệ m đư ợ c tiế n hành 5  giố ng lú lúa a thơ thơ m giố ng lúa lúa không không thơ m theo theo các bư c: kh khảả o sát quy trìn trình h trích trích  ly, điệ điệ n di SDS điệ điệ n di hai chi chiềề u Kế t quả qu quyy trìn trình h trích trích ly ly protein protein từ hạ t sử dụ ng  dung dịch dịch trích trích ly bao bao gồ m 125mmol/l Tris Tris HCl, HCl, p H 6,8 có có a 4mol/l urea; urea; 4% SDS   5% 22-Me Merc rcap apto toet etha hano noll kế t hợ p vớ i phư ng pháp thẩ thẩ m tíc tích h đố đố i chứ ng nư c cch ho  lư ợ ngprotein ngprotein cao cao tin tinh h sạ sạ ch ch Qua Qua phổ điệ điệ n di hai ch chiề iề u, chúng xác đ định ịnh đư ợ c  nhữ ng protein protein tư ng qu quan an vớ vớ i mùi mùi th thơơ m củ củ a thành nh ph n globul globulin in có có điể điể m đẳ đẳ ng điệệ n  nằ m tron g khoả khoả ng 6,4 - 7,0, trọ ng lư ợ ng phân tử đư ợ c tìm tìm thấ thấ y trê n gel điệệ n di di h hai ai  chiề u 11,5kDa, 11,5kDa, 30,7kDa, 33,9kDa, 34,0kDa 34, 0kDa 66,8kDa 66,8kDa   Từ khóa hóa : điệ n di hai chi chiềề u, globul globulin, in, hệ protein, lúa thơ m, mùi mùi thơ m trên lúa lúa,, SDSPAGE   MỤ C LỤ C KÍ TÊ TÊN N H I ĐỒ NG  LỜ I CẢ M TẠ TÓM LƯ Ợ C C i MỤ C LỤ C C i iii DANH SÁCH BẢ NG NG v v DANH SÁCH HÌNH .vi CÁC TỪ VIÉT TẮ T T vi .viii CHƯ Ơ NG I: G GIỚ IỚ I TH THIỆ IỆ U U 11 CHƯ Ơ NG II: II: L LƯƯ Ợ C KH KHẢẢ O TÀ TÀII LIỆ U U I SƠ LƯ Ợ C VỀ CÁC GIÓNG LÚA THƠ M HIỆ N NAY NAY Các giố ng lúa thơ m giớ i i 2 Các Các giố giố ng lúa lúa th thơơ m tr tron ongg nư c Prot Protei einn ddựự trữ trữ tr tron ongg hạ t lúa 3.1 Protein dự trữ hạt .3 3.2 Các thành phần vịtrí protein hạt lúa 4 Mùi thơ m lúa lúa 66 Nhữ ng yế u tố ả nh hư ng đế n mùi mùi th thơơ m ttrê rênn lúa lú a 66 Nh Nhữữ ng nghi nghiên ên u ccơơ bả n lúa lúa th thơơ m trên thế giớ giớ i Vi Việệ t Nam 6.1 Những nghiên cứu lúa thơm giới 6.2 Nhữ 6.2 Những ng nghiên cứu v ề lúa thơm Việt N am 10 II II KĨ THUẬ T ĐIỆ N HAI CHIỀ U T TRO RONG NG PHÂ PHÂN NT TÍC ÍCH H PROT PROTEIN EIN 111 Điệ n di mộ t ch chiềiề u (SDS-PAGE) (SDS-PAGE) .11 11 Điệ n di dự a vào đđiêm iêm đăng điệ n n 13 13 Điệ n di hai chiề u u 14 CHƯ Ơ NG III: P PH HƯ Ơ NG TIỆ N VÀ PHƯ Ơ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U 15 I ĐỊ ĐỊA A ĐIỂ M VÀ THỜ I GIA GIAN N NGHI NGHIÊN ÊN CỨ U U .15 15 Địa điêm điêm nghi nghiên ên u ii 15   Thờ i gia giann ngh nghiên iên u u 15 II II PHƯ Ơ NG P PHÁP HÁP N NGHIÊN GHIÊN CỨ U U .1 155 Dụ ng cụ hó hóaa chấ t t .155 1.1 D Dụng ụng c ụ 15 1.2 Hóa chấ chất t 15 Nguyên liliệệ u 16 16 III PHƯ Ơ NG PH ÁP ÁP 17 Quy trình thí ng nghi hiệệ m m 17 17 Ti Tiếế n hàn hànhh thí nghiệ m 17 2.1 Thí nghiệm 1: Ly trích protein   17 2.2 Thí nghiệm 2: SDS-PAGE 18 2.3 Thí nghiệ 2.3 nghiệm m 3: Đ iệ iện n di hai chiề chiều u (2(2-DE DE))   19 CHƯ Ơ NG IV IV:: KÉ KÉT T QU QUẢẢ VÀ TH THẢẢ O LUẬ N N .21 21 Ly trích pr prote otein in 21 SDS-P SD S-PAG AGE E 23 Điệ n di hai chiề u u 25 25 CHƯ Ơ NG V: K KÉ ÉT LUẬ N VÀ ĐỀ NGH NGHỊỊ 32 I KÉT LUẬ N N 32 II ĐỀ NGHỊ 33 TÀI LIỆ U THAM KH Ả O O 34 34 PHẦ N PH L C Phụụ lụ c 1: Ph 1: H Hìn ìnhh ge gell củ củ a đđiệ iệ n ddii hhai ch chiề iề u Phụụ lụ c 22:: X Ph Xác ác đđịn ịnhh hhàm àm lư ợ ng ppro rote tein in bbằằ ng phư phư ng ph pháp áp Brad Bradfo ford rd Ngu Nguyên yên tắc Tiến hành thí nghiệm Phụụ lụ c 33:: Đ Ph Điệ iệ n ddii SSD DS Ngu Nguyên yên tắc Tiến hành iii   Phụ lụ c 4: 4: Điệ Điệ n di di cchi hiềề u thứ thứ nhấ nhấ t ((Iso Isoele electr ctric ic focus focusing ing)) Phụụ lụ c 5: Ph 5: Điệ Điệ n di di chi chiềề u thứ thứ hai hai SDS SDS - PAGE PAGE cho cho 2-D 2-D Chuẩn bịgel bị gel Cân IPG S Strip trip Loa Loading ding gel Tiến hành điệ điện n di Nhuộ Nhuộm m gel Biosafe Coomsi Coomsiee Blue Rử Rửaa gel Đ ọc kết kết Phụụ lụ c 6: Ph 6: Phư Phư ng ph pháp tín tính h trọ trọ ng lư ợ ng phân phân tử tr ên gel SDS  Phụ lụ c 7: 7: Ma trậ n nhị nhị phân phân thôn thông g qua 2-DE Phụụ lụ c 8: Ph 8: So So sán sánh h độ độ khác khác biệ biệ t giữ giữ a các gi ng lú lúa a thơ thơ m điệệ n di di hai hai ch chiề iề u iv   DANH SÁCH B NG Bả ng Tênn B Tê Bảả ng Trang Tổ hợp lai tạo đặc điểm số giống lúa sử dụng 16 Kết ly trích protein phương pháp khảo sát 21 Tóm tắt protein khác biệt giống lúa thơm 33 v   D A N H S Á C H H ÌN ÌN H Tên Hình [ình  Ngun lí điện di SDS 13  Nguyên lí điện di hai chiề chiều u 14 Sơ đồ bố trí bước tiến hành thí nghiệm 17 Quy trình trích ly protein từ hạt lúa 17 Phổ điện di SDS phương pháp ly trích khảo sát 22 Phổ điện di SDS giống lúa 23 So sánh đối chứng âm lúa thơm 25 So sánh giống lúa MTL513 đối chứng âm 26 So sánh giống lúa MTL495 đối chứng âm 27 10 So sánh giống lúa MTL578 đối chứng âm 28 11 So sánh giống lúa MTL579 đối chứng âm 29 12 So sánh giống lúa MTL549 đối chứng âm 30 13 Giản đồ tương quan giống lúa thơm thông qua 2DE 31 vi   CÁC CÁ CT VIÉT VIÉT TẮ T KDM Khao Dawk Mali kDa Kilo Dalton PMSF Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride fgr  Fragrance RNA Ribonucleic Acid  DNA Deoxyribonucleic Acid   cM Centi Morgan ESP External Sense Primer   INSP Internal Non-fragrant Sense Primer   IFAP Internal Fragrant Anti-sense Primer  EAP External Anti-sense Primer  SSR Simple Sequence Repeat Đ BSCL Đ ồng Bằng Sông Cửu Long PC R Polymerase Chain Reaction 2DE 2-Dimensional Electrophoresis SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS Sodium Dodecyl Sulphate IEF Isoelectric focusing I PG Immobilized pH Gradient DD Dung dịch vii    Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010 Trư ng ĐHC T  Widjaja, R., J.D Craske, and M Wootton (1996) Comparative studies on volatile components of non-fragrant and fragrant rices  J Sci Food F ood Agric.  70, 151-161 Yajima,, I., T Yanai, M Nakamur Yajima Nak amura, a, H H Sakakibara, Saka kibara, and T T Habu 1978 1978 Volatile flavor flav or Chem.  42: 122-123 components o f cooked rice rice. Agric Biol Chem Yamagata, H., T Sugimoto, K Tanaka, Z Kasai Kasai 1982 1982 Biosynthe Biosy nthesisof sisof storage  proteins in developing rice seeds seeds Plant Physiol 70:  1094-1100 Yoshihashi, T 2002 Quantitative analysis on 2-acetyl-1-pyrroline of an aromatic rice  by stable isotope dilution method and model studies on its formation during cooking. JFS.  67 (2) Yoshihashi, T., N.T.T Huong, and N Kabaki 2004 Area dependency of 2-acetyl1pyrroline content in an aromatic rice variety, Khao Dawk Mali 105  JAR  JARQ Q 38(2): 105-109 Zhu, X.Z, Y Shimoni, H Levanony, G Segal, and G Galili 1995 Purification, characterization, and intracellular localization of glycosylated protein disulfide isomerase from wheat grains Plant Physiol Physiol.  108 (1): 327-335 Trang web http://vneconomy.vn/20090511112747952P0C19/lua-thom-ma-va http://vneconomy.vn/20090511112747952P0C19/luathom-ma-van-thua.ht n-thua.htm m  (ngày  25/4/2010) www.molecularstation.com/images/protein-gel-electr www.molecularstation.com/images/protei n-gel-electrophoresis.i ophoresis.ipg pg   25/4/2010) (ngày http://www.hcmbiotech.com.vn/technology http://www.hcmbiotech.com.vn/technol ogy detail.php?cateid=4&i detail.php?cateid=4&id=85 d=85   26/4/2010) (ngày www.molecularstation.com/images/protein-gel-electr www.molecularstation.com/images/protei n-gel-electrophoresis.i ophoresis.ipg pg   (ngày  25/4/2010) Chuyên Chuy ên ngà ngành nh Công N Nghệ ghệ Sinh Họ c Việ Việ n NC & PT Công Nghệ Sinh Họ c 40   PH Ầ N PH L C PH L C 1: HÌN HÌNH H GE GEL L ĐIỆ N DI HAI CHIỀ CHIỀ U Hìnhh 14 Hìn 14:: Hình ggel el điệệ n di hhai cchiề hiề u củ a giố ng llúa úa   PH L C XÁC ĐỊ NH HÀM LƯ Ợ NG PROTEIN BẰ NG PHƯ Ơ NG PHÁP  BRADFORD Nguy Nguyên ên tắ c Phương pháp Bradford dựa liên kết chất nhuộm Coomassie Brilliant Blue G250 protein Trong mơi trư trường ờng m mang ang tính acid dung dịch, ch chưa ưa gắn với protein thuốc nhuộm dạng màu đỏ có bước sóng hấp thụ cực đại 465 nm kết hợp với protein protei n thuốc nhuộm chuyể chuyển n sang dạng màu xanh dương v vàà hấp thụ cực đại bước bư ớc sóng 595 nm Vì lượ lượng ng protei protein n bi biết ết cách xác đị định nh lượng thuốc nhuộm dạng tích điện âm màu xanh dương đo độ hấp thụ dung dịch bư bước ớc sóng 595 nm Tiế n hành thí ng nghiệ hiệ m • Ch Chuẩ uẩ n bị th thuố uố c thử Br Brad adfo ford rd Hòaa tan 100mg Coomassie Brilli Hò Brilliant ant Blue G250 50 ml ethanol 95% 95% Sau cho thêm 100 ml acid phosphoric 85% khuấy Bổ sung thêm nước cất 1L Sau lọc bằng giấy lọc Whatm Whatman an No No.1 trữ tro ng chai tối nh nhiệt iệt độ phịng Có thể giữ để sử dụng tuần tuần thời gian chất màu bị tủa nên sử dụng cần phải lọc lại • Dung dịch pro protei teinn chuẩ chuẩ n nồ ng độ 3mg/ 3mg/ml ml - Cân 3mg BSA, hòa tan ml nướ nướcc cấ cất, t, bảo quản -200 -200C C - Xây dựng đường chuẩ chuẩn n BSA - Chuẩn bị dãy protei protein n BSA chuẩ chuẩn n với nồng độ tăng dần từ 0, 30 30,, 60, 120 120,, 180, 240, 30 300 g/ml Thí ngh nghiệm iệm lặ lặp p lạ lạii lầ lần n Chuẩn bịcác ống nghiệm thêm vào chất theo Bảng sau:   Bả ng 4: Dự Dự ng đư ng ch chuâ uân n BSA BSA Ố ng [BSA](|ig/ml) 30 60 120 180 240 300 V 10 Vdd đệ m (pl) 100 99 98 96 94 92 90 V thuố thuố c thử thử Brad Bradfor ford d (ml) (ml) 2 2 2  b s a   (Pl) Lắ c đề u các ố ng bằ bằ ng máy vortex, trán tránh h để có bọ bọ t Sau Sau 10 phút phút tiế n hành hành đo OD OD Chuẩ huẩ n máy máy đo qu quang ang phổ phổ vớ i dung dung dịch ch chỉỉ chứ a dung dung dịch đệ m (ố (ố ng 1) bư c  sóng 595nm 595nm Chỉnh Chỉnh giá tr trị 0, Tiế n hành hành đo các ố ng lạ i Mẫ u prot otei ein n cũ ng đư ợ c ti tiếế n hành đo đồ đồ ng thờ thờ i vớ i việ c dự dự ng đư ng ch chuẩ n, mẫ mẫ u  pha ph a loãn loãng g mứ c: khơng khơng pha pha lỗng lỗng,, pha pha lỗng lỗng 2, 2, 5, 10 lầ n (đo (đo lặlặ p lạ i lầlầ n) n) Cũ ng  lấ y 100pl cho vào vào 2ml dung dung dịch thuố thuố c thử thử Brad Bradfo ford rd Ghii nhậ Gh nhậ n kế kế t quả , lấ y giá tr trịị trung trung bình bình Từ phư phư ng tr trìn ình h đư ng ch chu uẩ n ta suy suy đư ợ c hàm hàm lư ợ ng prot protei ein n tr tron ong g mẫ u PH L C ĐIỆ N DI SDS Nguyên Nguyên tắ c Kỹ th thuậ uậ t điệ điệ n di di dự a tr trêên nguy nguyên ên tắ c tron g mộ mộ t điệ điệ n trư trư ng các ph phân tử tử tí tích ch điệ điệ n  âm di cch huyể n cự c dư ng củ a điệ n trư ng ngư ợ c llạạ i Tố c độ di cch huyể n củ a các  phân tử tử này tùy tùy th thuộ uộ c vào vào kíc kích h th thư c, Hìn Hình h dạ ng, ng, điệ n tíc tích, h, và lự c điệ điệ n tr trư ng Tiế n hành hành Chuẩ Ch uẩ n b ho hố chấ chấ t   •   Dung dịch Acrylamide 30% Dung dịch dịch đệ đệ m   1,5 M Tris-HCl, pH=8,8 - 1.0 M Tris-HCl, pH=6,8 • Amonium persulphat (APS) 10 10% % • SDS 10% (Sodium dodecyl sulfat) • Dung dịch Tetramethyl-ethylenediam Tetramethyl-ethylenediamine ine (TEMED) • lít dung dịch chạ chạy y điện di có chứa: • - 3g Tris - 14,4g Glycerin - 1g SDS 100ml dung dịch nhuộm ggel: el: - 0,1 g Coomass Coomassie ie R-250 - 50 ml methano methanoll - 40 ml nước nư ớc cất - 10 ml acid acetic 1100% 00% • lít dung dịch rửa ggel: el: - 100 ml methan methanol ol - 70 ml acid acetic 1100% 00% - 830 ml nước nư ớc cấ cấtt Các bư c ch y điệệ n di  Chuẩ Chuẩ n bị bị mẫ u - Mẫu có nồng độ protei proteinn 1mg/ml, pha theo tỷ lệ 11:1 :1 Cho vào ống eppend eppendorf orf 20pll mẫu protein 20 |i|ill dung dịch đệ 20p đệm m pha mẫu (Glycine samp sample le buffer)   - Lắc đề u đun cách thủy 950 950C, C, phút Đ ể nguội Ch Chuẩ uẩ n bị hộ p điệệ n di Khn kính để đổ gel, lược cài hộp điện di phải rửa lau khơ cồn Sau ráp thành khn để chuẩn bịđổ gel Chu Chuẩẩ n bị ge lphân lph ân tích tích polyarcrylamide polyarcrylamide 10 % Chuẩn bịgel bị gel ccó ó tổng thể tích: 10ml/ gel - Nư Nước ớc ccấ ất: 4,0 ml (4000 |il) - Dung dịch Acryla Acrylamide mide 30 30%: %: 33,3 ,3 ml (3300 |il) - 1,5M Tris-HC Tris-HCll (pH=8,8): 2,5 ml (2500 |il) - SDS 10% 10%:: 0,1 ml (100 |il) - APS: 0,1 ml (100 |il) - TEMED: 0,004ml (4|il) Dungg dịch đượ Dun đượcc trộn lẫn bằ ng máy khuấy từ Sau cho pl TEM TEMED ED vào dung dịch, khuấy nhan nhanhh chóng dùng pip pipette ette 100 10000 pl cho vào khun khungg kính đổ gel Gel bơm đến vạch cách lượt 0,5 cm Chú ý không bơm nhanh tạo bọt gel Cẩn thận bơm tiếp lớp nướ nướcc cất lên  phẳng Gel đông lạ  phẳng lạii sau 20-30 phút Đổ gel t p trung trung Gel tập trung có thành phần sau: - Nư Nước ớc cấ cất: t: 2,7 ml (2700pl) - Acryl Acrylamide amide 30%: 0,67 ml (670pl) - 1,0M Tris-HC Tris-HCll pH 6,8: 0,5 ml (500 (500|il) |il) SDS 10%: 0,04 ml (40|il) bề mặt gel để tạo cho bề mặt   APS 10%: 0,04 ml (40|il) - TEMED: 0,004ml (4|il) Khuấy dung dịch dịch má máyy khuấy từ Trư Trước ớc đổ gel tập trung phải đổ bỏ  phầnn nướ  phầ nướcc phí phíaa gel phân tích cách nghiên dùng giấy thấ thấm m Tương Tươ ng tự gel phân tích, sau cho 4pl TE TEMED MED vào, dung dịch dịch phả phảii đượ đượcc đưa nhanh vào khung đổ gel Dùng giấy thấm để loại bề mặt gel phân tích Cho gel tập trung vào, đưa lược vào lớp gel Chú ý, lược đưa vào cẩn thận để tránh tạo lớp bọt phía chân lược Gel tập trung đông tụ lại khoảng sau 20 phút Đ ánh dấu lạ lạii vịtrí lỗ giế giếng ng Đư Đư a mẫ u vào vào ccác ác gi ng - Sau gel tập trung đông, lắ lắpp khung đổ gel vào khung chạy điện di di - Đ ổ đầy dung dịch chạ chạyy điệ điệnn di vào phía bên bên chạy điện di - Cẩn thận lấy lượ lượcc cho mẫu vào ggiế iếng ng - Đ a 10 pl mẫ mẫu u vào lỗ giế giếng ng Chú ý không để mẫu tràn qua giếng bên cạnh - Ghi chép lại lại vịtrí vị trí mẫu đưa vào giế giếng ng Chạ y điệ điệ n di di Sau hoàn tất việc đư đưaa mẫ mẫuu vào, đậy nắp hộp điện di lạ lạii cho dòng điện đđii qua Dòng điện chạy điện di 25mA/40V Thông thường, thời gian để chạy điện di vào khoảng 2-3 Ta quan sát q trình dịch dịch cchuyể huyểnn prote protein in nhờ vào dãy băng màu xanh Bromophenol Blue R-250,   Nhuộ m gel Gel đư ợc lấy khỏi hộp gel cẩn thận cho vào dung dị dịch ch nhuộm pha Đ ể làm nhanh trình nhuộm màu, hệ thống đặt máy lắc Thơng thường, thời gian nhuộm vịng 1giờ Tẩ y màu Tẩy gel dung dịch dịch tẩ tẩy y Ngâ Ngâm m gel tro ng dun dung g dịch tẩy đặt m máy áy lắc từ 2-3 Kết thúc trình tẩy gel nhận thấy gel lớp màu băng  protein rõ gel gel  Ngoài gel đư ợc tấ tấy y sạ ch lớp màu nề n bằ ng cách cho gel vào nước cất đun lị vi sóng thời gian 15 phút Sấ y gel Đ ể giữ gel lâu, người ta sấ sấy y ge gel l Gel sấ sấy y bằ ng thiết b bị ị sấ sấy y hút chân không nhiệt độ 550C, thời gian khoảng 10 10 Đọ c k t Scan phổ diện điện di phần mềm Quantity One PH L C ĐIỆ ĐIỆ N DI CHIỀ CHIỀ U THỨ NHẤ NHẤ T IEF IEF (ISO (ISOEL ELEC ECTR TRIC IC FOCU FOCUSI SING NG)) • Đ ưa đ điệ iện n di IEF (IPG Str Strip) ip) có gradient pH từ - 10 nhiệt độ phịn phịng g • Hút 125pl ((~100pg ~100pg protein) mẫ mẫu u protein protein tách chiết cho vào rãnh khay điện di cách hai đầu rãnh 1cm, tránh để bọt khí • Dùng kẹ kẹp p tách cẩ cẩn n tthậ hận n lớp nhự nhựaa p plastic lastic bao IPG từ đầ đầu u có ghi pH - 10, Hìn ình h 15 15: Các Các bư bư c tiế tiế n hàn hành h điệ điệ n di di c chi hiềề u thứ nhấ nhấ t   • Nhẹ nhàng đặ đặtt than h IPG Strip lên dung dịch protein Dấu “+” “pH - 10” 0” nằm phía tên trái khay Tránh khơng để mẫu dính lên bề mặt lớp nhựa IPG Strip mẫu khơng hấp thụ lên gel Chắc chắn khơng có c ó bọt khí nằm Strip Nếu có, cẩn thận dùng kẹ kẹp p nhấc Strip lên xuống - lần cho bọt khí khỏi Str Strip ip • Phủ lên IPG Strip dầ dầu u kho khoáng nhằ nhằm m ngă ngăn n chặ chặn n bay h trình điện di Thêm dầu khoáng chầm chậm cách di chuyển pipet dọc theo chiều dài Strip Chú ý: Hyrat hóa IP IPG G Strip bước quan trọng trình chạy điện điện di 2D  Nếu mẫu phân bố không đề u theo Strip Strip,, cẩ cẩn n thận giữ nhàng đặt đầu lại dọc theo khe khay • Chương trình PROTE PROTEAN AN IE IEF F sử dụng thích hợp đ đối ối v với ới tấ tấtt chiề chiều u dài IPG Strip, sử dụng nhiệt độ mặc định 200 200C C , với cư cường ờng độ tối đa 50pA/S 50pA/Strip trip - Chọn Ne New w Metho Method d hình bằ ng cách nhấn phím màu xanh - Ở hình kế tiế tiếp, p, nhấ nhấn n vào Name Đ ặt tên phím ký tự - Ở hình Rehydration, nhấ nhấn n v vào phím đ để ể chuyể chuyển n sang hình có chữ Yes - Dò Dòng ng Focu Focuss Temp nhi nhiệt ệt độ mặc định 200 200C C - Nhấn phím Nex Nextt đ để ể chuyển sang hình k kế ế tiế tiếp p - Ở hình kế tiế tiếp, p, chọn Rehydration Step Passive - Ở dòng Enter Temp nhiệt độ mặc định 200 200C C không cần thay đổi đổi - Nhấn phím Nex Nextt đ để ể chuyển sang hình kế tiế tiếp p - Dòn Dòng g Enter Time mặc định 12 không cầ cần n tha thay yđ đổi ổi - Ở dòng The Insert pause after Rehydration, chọ chọn n No No - Nhấn phím Nex Nextt đ để ể chuyển sang hình k kế ế tiế tiếp p - Nhập vào nhữ ng tham số cách nhấn nhữ ng phím dướ dướii đây Cài đặt chương trình chạy 200C sau: đầ đầu u Strip   Bả ng 5: 5: Giá tr trịị dòng dòng điệ điệ n thờ thờ i gian gian Bư c > H iệ u đ iệ n t h ế T h i g ia ia n   (V ) (phút) 250 20 L in e a r   4000 L in e a r   4000 8000 Rapi d  00 8000 Rapi d  V o l t - H o u rrss V o lta g gee S tto op e Nhấ Nhấ n nút Start Start để bắ bắ t đầ u Điệ n thế cuố cuố i cùng cho cho mỗ mỗ i dãy dãy pH thể khơn khơng g đạ đạ t tớ i, như ng tổ ng volt ho hour urss  gh ghii tr trêên cũ cũ ng đủ cho mẫ mẫ u tậ p tr trung vớ vớ i điệ điệ n th thấ thấ p ccỡỡ 30 3000 00V V Sa Sau u khi điệ điệ n di di xong, lấ y các Stri Strip p loạ i bỏ dầ u khoá khống ng như tr ên,, sau đặ đặ t ccác ác  Strip trip vào khay khay sạ ch mặ mặ t gel quay quay lên tr ên (giữ (giữ nguyên nguyên vị vị trí trí mẫ mẫ u) u) Nế u chư a điệ điệ n di di  SDS-PA SDS -PAGE, GE, Str Strip ip nên nên đư đư ợ c bao bao phủ phủ bở i plas plastic tic giữ giữ -70 0C PH L C ĐIỆ ĐIỆ N DI CHIỀ CHIỀ U THỨ HAI HAI SDSSDS-PA PAGE GE CHO CHO 2D Chuẩ n bị ge gell Đổ gel phân phân tích 10% 10% acrylamid acrylamidee để để chạ y điệ điệ n di di SDS-PAGE cho điệ n d dii hai hai chiề u  khơng khơng cầ n gel tậ p trun trung g Cân bằ ng IPG Strip Strip Đặ t miế miế ng giấ giấ y lọ c lên lên mặ t phẳ ng khô sạ ch, làm làm ẩ m 1m 1miế ng gi giấấ y lọ c bằ bằ ng nư c  cấ t lầ n, đặ đặ t th than anh h IPF Str Strip ip lên lên miế ng giấ y lọ c khô khô (bề (bề có lớ p nhự a úp xu xuốố ng dư i)  úp úp miế ng giấ y lọ c khơ khơ lên, lên, q q tr trìn ình h nhằ nhằ m loạ loạ i bỏ dầ u khốn khống g cịn dư Cân Cân  bằ ng IPG Strip Strip dung dịch I II II Loading gel • Làm tan agarose agarose trong microwave khoả khoả ng 25-30 25-3 giây chuẩ chuẩ n bị load gel • Đặ t Str Strip ip lên mặ t củ a phiế phiế n kí kính nh điệ n di lớ n bề mặ t Str Strip ip hư ng lên (hay (hay   phía phí a phiế phiế n kính kính nhỏ nhỏ )   Dùng pipet cho lên gel • Đ ưa Strip v vào bên phần lược IPG sát với bề mặt gel (bước làm trước cho) • Đ ể thẳng đứng cho agarose đôn đông g • Đ ặt vào hộp điệ điện n di đứng Ti Ti n hành điệ n di di • Cho dung dịch đệm điện d dii 1x Tris/gl Tris/glycine/ ycine/SDS SDS bắt đầu điệ điện n di di Sự di chuyển Bromophenol Blue, diện gel agarose, dùng để thịq trình điện di • Đ iều kiện điện di: di: 100 100V, V, thời gian chạ chạy y khoảng 90 phút Nhuộ Nhuộ m gel bằ bằ ng BioSafe BioSafe Coomass Coomassie ie Blue Blue • Cho nước cấ cấtt ti tinh nh khiế khiếtt vào vào khay nhuộm (150 - 200ml cho gel ri riêng êng biệ biệt) t) • Mở ge gell điệ điện n di cho vào kh khay ay nướ nướcc • Rử Rửaa nướ nướcc lầ lần, n, lầ lần n phút • Đ ổ vừa đủ thuốc nhuộc BioSaf BioSafee Coomas Coomassie sie Blue n ngậ gập pg gel el • Lắc khoảng giờ, gel ccó ó thể nhuộm qua đêm cầ cần n Rử Rử a gel Bỏ dung du ng dịch nhuộm rử rửaa gel dung dịch tẩy (acide aacetic cetic:meta :metanol:nư nol:nước) ớc) lần  Ngồi gel đư ợc tấy lớp màu cách cho gel vào nước cất đun lị vi sóng thời gian 15 phút Đọ c k t quả Scan gel (sử dụng thiết bị Scan Gel-Doc Bio-Rad) v vàà dùng phần mề mềm m PDQuest để  phân tích kết quả   PH L C PHƯ Ơ NG PHÁP TÍNH TRỌ NG LƯ Ợ NG PHÂN TỬ TRÊN  GEL SDS Bả ng 6: SSốố liệ u vẽ đư ng logM ogM củ a pr protei oteinn cchu huẩẩ n R p (c m ) R B (cm ) 1,5 9,5 2,5 Rf   M (kDa) logM ,1 116 ,0 ,5 ,2 6 ,2 ,8 21 4,45 9,5 ,4 45 ,653 ,3 ,5 ,5 ,5 ,5 7,1 9,5 ,7 25 ,3 8,65 9,5 ,9 1 ,4 ,265 ,5 ,5 1 ,4 ,1 Trong đó: Rp: Khoảng cách từ gel phân tích đế đến n protein chuẩn chuẩn RB: Khoảng cách từ gel phân tích đế đến n protein chuẩn cuối cùng R f = Rp/R Rp/RB B M: Trọng lượng phân tử protein chuẩn Hình 16: 16: Đồ thị bi biếế u ddiễiễ n llogM ogM củ a pr prote otein in cchuẩ huẩ n Từ phương trình đường chuẩn y= -0,986x + 2,124 tính logM  protein cần cần xác định   PH L C 7: MA TRẬ N NHỊ P PHÂN HÂN THÔ THÔNG NG QUA 2-D 2-DE E Peak MTL495 MTL513 MTL578 M T L 57 M T L 549 SSP 0001 1 1 SSP 0102 1 1 SSP 0301 1 1 SSP 0302 1 1 SSP 0401 1 1 SSP 0402 SSP 0403 1 1 1 1 1 SSP 0404 1 1 SSP 0501 1 1 SSP 0801 1 1 SSP 0903 1 1 SSP 0904 1 1 SSP 0905 1 1 SSP 0906 1 1 SSP 0907 0 SSP 0909 0 0 SSP 0912 0 1 SSP 0913 0 0 SSP 1001 1 SSP 1101 1 1 SSP 1201 1 1 SSP 1204 1 0 SSP 1606 1 1 SSP 1607 0 1 SSP 1703 0 0 SSP 1704 1 1 SSP 1804 1 1 SSP 1901 1 1 SSP 1902 0 SSP 2201 1 1 SSP 2501 1 1 SSP 2502 0 SSP 2503 0 SSP 2704 0 SSP 2801 0 1 SSP 2802 0 SSP 2907 1 1 SSP 2908 1 1 SSP 2910 1 1 SSP 2911 1 1 SSP 2912 1 1 SSP 3002 0 0 SSP 3003 0 0 SSP 3201 1 1 SSP 3401 1 1 SSP 3604 1 SSP 3607 0 SSP 3608 0 0 SSP 3701 0 1 SSP 3901 1 1 SSP 3903 1 1   SSP 3904 0 1 SSP 4001 0 0 SSP 4601 1 1 SSP 4901 1 1 SSP 4903 1 1 SSP 1 0 SSP 4905 0 1 SSP 1 1 SSP 0 1 SSP 5902 0 1 SSP 6201 1 1 SSP 6203 0 0 SSP 6401 1 1 SSP 6 1 1 SSP 6701 0 SSP 1 1 SSP 1 1 SSP 6903 0 SSP 0 1 SSP 1 1 SSP 7201 1 1 SSP 0 SSP 7503 1 1 SSP 1 0 SSP 7 0 0 SSP 7901 0 1 SSP 8001 1 SSP 8301 0 0 SSP 8402 1 1 SSP 8404 1 1 SSP 8406 0 SSP 8408 1 0 SSP 8501 1 1 SSP 8601 0 SSP 9102 1 1 SSP 9201 1 0 SSP 9301 0 0 SSP 9403 0 0 SSP 9501 1 0 SSP 9503 1 1 SSP 9504 0 SSP 9901 1 1 SSP 9902 1 1 SSP 9903 1 1 SSP 9904 1 1 SSP 9905 1 1 SSP 9907 1 1 SSP 9908 1 1 SSP 9909 1 0 SSP 9915 1 1 SSP 9916 1 1 SSP 9917 1 1 SSP 9919 1 1 SSP 9921 0 0   SSP 9924 1 1 SSP 9925 1 1 SSP 9926 1 1 SSP 9927 1 1 SSP 9930 1 1 SSP 9931 1 1 SSP 9932 1 1 SSP 9933 1 1 SSP 9937 0 0 PHỤỤ LỤ C 8: SO SÁN PH SÁNH Đ KH KHÁC ÁC BI BIỆỆ T GIỮ GIỮ A CÁC GI GIÓN ÓNG G LÚ LÚA A THƠ THƠ M  Ở ĐIỆ N DI HAI C CH H IỀ U Bả ng 77:: So sánh sánh đđộộ kh khác ác bbiệ iệ t giữ giữ a cá cácc giố ng lúa lúa tthơ hơ m điệ điệ n di di hhai chiề chiề u M T L 495 M T L 513 M T L 549 M T L578 MTL495 1,00 MTL513 ,6 ,0 MTL549 ,6 ,5 ,0 MTL578 ,6 ,5 ,8 1,00 MTL579 ,7 ,6 ,8 0,8 M T L 579 1,00 ... giống lúa thơm Đ ồng Bằng Sông Cửu Long kĩthuậ kĩthuậtt điện di? ?? thực hiệ n  Mụ  M ụ c tiêu củ a đề tài: tài:  (i) Khả Khảo o sát hệ protein số giống lúa thơm Đ BSCL nay, từ tuyển chọn giống lúa tốt... Xây dựng quy trình chuẩn để khảo sát hệ protein giống lúa thơm Chuyên Chuy ên ngà ngành nh Công N Nghệ ghệ Sinh Họ c Vi Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin Sinh h Họ c    Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ... ly protein từ hạt lúa 17 Phổ điện di SDS phương pháp ly trích khảo sát 22 Phổ điện di SDS giống lúa 23 So sánh đối chứng âm lúa thơm 25 So sánh giống lúa MTL513 đối chứng âm 26 So sánh giống lúa