Nghiên cứu sử dụng Chitosan phòng trừ bệnh thán thư hại Xoài sau thu hoạch

Cây xoài (Mangifera indica L.) là một trong những loại cây ăn quả điển hình cho vấn đề này. Do có khả năng thích ứng rộng nên hiện nay cây xoài đã được trồng ở nhiều nước và vùng lãnh thổ có điều kiện khí hậu á nhiệt đới. Theo tổ chức FAO, hiện có hơn 95 quốc gia trên toàn thế giới đang trồng và canh tác loại cây này (FAOSTAT 2010). Là loại cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao và có tầm quan trọng về kinh tế, tuy nhiên ở xoài gặp một số bệnh ảnh hưởng tới năng suất và phẩm chất của quả sau thu hoạch, trong đó bệnh thán thư là một bệnh thường gặp và gây hại nghiêm trọng nhất đối với xoài, làm mất giá trị thẩm mỹ đồng thời làm giảm phẩm chất của quả xoài gây tổn thất cho người trồng, ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng.Bệnh thán thư gây hại trên xoài sau thu hoạch chủ yếu do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra. Bệnh gây hại phổ biến ở tất cả các vùng trồng xoài trên thế giới, nấm gây hại trên hoa, lá, quả khi còn trên cây và sau thu hoạch. Sự phát triển của bệnh trên quả, bệnh nhiễm từ lúc trái non đến thu hoạch, vết bệnh lúc đầu trên trái có những đốm nhỏ hình tròn có màu nâu hoặc nâu đen sau lan ra, nhiều đốm kết hợp với nhau thành những đốm lớn hơn lõm vào phần thịt trái và có thể lan ra bao quanh trái, làm cho thịt trái bị thối. Để hạn chế bệnh thán thư phát triển trên xoài sau thu hoạch, ngoài việc hạn chế tổn thương trên quả thì các loại thuốc hóa học như Benomyl và Thiabendazole (TBZ) thường được áp dụng 7, 24.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ

Khoa Cơ khí - Công nghệ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu sử dụng chitosan phòng trừ bệnh thán thư hại xoài sau thu hoạch

NĂM 2012

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của xoài chín 5

Bảng 1.2 Sản lượng xoài trên thế giới từ 2000 - 2005 6

Bảng 1.3 Diện tích và sản lượng xoài ở Việt Nam (2005 – 2010) 8

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của chitosan 14

Bảng 2.1 Các chỉ tiêu lý hóa 25

Bảng 2.2 Các chỉ tiêu vi sinh vật 25

Hình 2.1 Mẫu xoài bệnh tại nơi được thu thập 27

Hình 2.2 Quy trình phân lập và giám định nấm từ mẫu bệnh 28

Hình 2.3 Giữ ẩm mẫu để phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides gây hại trên xoài 29

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh Colletotrichum gloeosporioides trên quả xoài 30

Hình 3.1 Hình ảnh đại thể và vi thể của chủng nấm T2 36

Hình 3.2 Kết quả giải trình tự gen 28S của chủng nấm T2 36

Hình 3.3 Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng định danh T2 trong ngân hàng gen 37

Hình 3.4 Bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 37

Bảng 3.1 Tỷ lệ bệnh ở các nồng độ bào tử khác nhau trên xoài 39

Hình 3.5 Các ngưỡng gây bệnh của nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 trên xoài bằng lây bệnh nhân tạo sau 96h 40

Bảng 3.2 Sự phát triển của vết bệnh trên xoài ở các mức bào tử khác nhau 40

Hình 3.6 Ảnh hưởng của chitosan đến sinh khối sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 sau 96h nuôi cấy 42

Hình 3.7 Nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 nuôi cấy trên môi trường ½ PDA lỏng với các nồng độ chitosan khác nhau sau 96h nuôi cấy 42

Hình 3.8 Ảnh hưởng của chitosan với các nồng độ khác nhau đến tốc độ phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 sau 240h nuôi cấy 44

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chitosan đến đường kính tản nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 44

Hình 3.9 Ảnh hưởng của oligochitosan với các nồng độ khác nhau đến tốc độ phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 ở thí nghiệm 1 sau 120h nuôi cấy 47 Hình 3.10 Ảnh hưởng của oligochitosan với các nồng độ khác nhau đến tốc độ phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 sau 192h nuôi cấy 48 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của oligochitosan đến đường kính tản nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 48 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ bệnh ở các công thức khác nhau trên xoài 51 Hình 3.11 Ảnh hưởng của chitosan đến sự hình thành vết bệnh trên xoài bằng lây bệnh nhân tạo ở điều kiện in vivo sau 96h 52 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của chitosan đến sự hình thành vết bệnh trên xoài 52

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của chitosan Error: Reference source not found

Hình 2.1 Mẫu xoài bệnh tại nơi được thu thập Error: Reference source notfound

Hình 2.2 Quy trình phân lập và giám định nấm từ mẫu bệnh Error:Reference source not found

Hình 2.3 Giữ ẩm mẫu để phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides gây hại

trên xoài Error: Reference source not found

Hình 3.1 Hình ảnh đại thể và vi thể của chủng nấm T2 Error: Referencesource not found

Hình 3.2 Kết quả giải trình tự gen 28S của chủng nấm T2 Error: Referencesource not found

Hình 3.3 Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng định danh T2 trong ngân hàng gen Error: Reference source not found

Hình 3.4 Bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 Error: Referencesource not found

Hình 3.5 Các ngưỡng gây bệnh của nấm Colletotrichum gloeosporioides T2

trên xoài bằng lây bệnh nhân tạo sau 96h Error: Reference source not found

Hình 3.6 Ảnh hưởng của chitosan đến sinh khối sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 sau 96h nuôi cấy Error: Reference source not found

Hình 3.7 Nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 nuôi cấy trên môi trường

½ PDA lỏng với các nồng độ chitosan khác nhau sau 96h nuôi cấy Error:Reference source not found

Hình 3.8 Ảnh hưởng của chitosan với các nồng độ khác nhau đến tốc độ

phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 sau 240h nuôi cấy

Error: Reference source not found

Hình 3.9 Ảnh hưởng của oligochitosan với các nồng độ khác nhau đến tốc

độ phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 ở thí nghiệm 1 sau

120h nuôi cấy Error: Reference source not found

Hình 3.10 Ảnh hưởng của oligochitosan với các nồng độ khác nhau đến tốc độ

phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 sau 192h nuôi cấy Error:

Reference source not found

Hình 3.11 Ảnh hưởng của chitosan đến sự hình thành vết bệnh trên xoài bằng lây bệnh nhân tạo ở điều kiện in vivo sau 96h Error: Reference sourcenot found

MỤC LỤC

Trang

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 Cây xoài 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 3

1.1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.1.2 Phân loại 4

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng 5

1.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ xoài trên thế giới 5

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ xoài ở trong nước 7

1.1.5 Các loại bệnh sau thu hoạch thường gặp ở xoài và biện pháp xử lý 8

1.1.5.1 Các bệnh sau thu hoạch thường gặp ở xoài 8

1.1.5.2 Một số phương pháp xử lý nấm bệnh sau thu hoạch 9

1.2 Đặc điểm của bệnh thán thư do nấm Collectotrichum gloeosporioides gây hại 11

1.3 Tổng quan về chitosan và oligochitosan 13

1.3.1 Chitosan 13

1.3.1.1 Cấu trúc của chitosan 13

1.3.1.2 Tính chất của chitosan 14

1.3.1.3 Phương pháp sản xuất chitosan 15

1.3.2 Tổng quan về oligochitosan 16

1.3.2.1 Cấu trúc của oligochitosan 16

1.3.2.2 Tính chất của oligochitosan 16

1.3.2.3 Phương pháp sản xuất oligochitosan 17

1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan và oligochitosan 18

1.3.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan 18

1.3.3.2 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của oligochitosan 20

1.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài 20

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 20

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 22

Chương 2 25

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.1 Chitosan 25

2.1.2 Oligochitosan 25

2.1.3 Nguyên liệu quả 26

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Phương pháp thu mẫu nấm bệnh 26

2.3.2 Phương pháp phân lập và giám định nấm Colletotrichum gloeosporioides27 2.3.3 Bố trí thí nghiệm 30

2.3.3.1 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian nảy mầm của bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides trong phòng thí nghiệm 30

2.3.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh của Colletotrichum gloeosporioides bằng lây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm 30

2.3.3.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở điều kiện in vitro 31

2.3.3.4 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của oligochitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở điều kiện in vitro 33

2.3.3.5 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở điều kiện in vivo 33

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

Chương 3 35

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Phân lập, tuyển chọn và giám định nấm thán thư hại xoài 35

3.1.1 Kết quả phân lập, tuyển chọn và giám định bằng hình thái 35

3.2 Xác định thời gian nảy mầm của bào tử Colletotrichum gloeosporioides 37

3.3 Xác định ngưỡng gây bệnh của Colletotrichum gloeosporioides bằng lây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm 39

40

3.4 Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 của chitosan và oligochitosan ở điều kiện in vitro 41

3.4.1 Ảnh hưởng của chitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở điều kiện in vitro 41

3.4.1.1 Kết quả thí nghiệm trên môi trường lỏng ½ PDA 41

3.4.1.2 Kết quả thí nghiệm trên môi trường đặc 1/5 PDA 43

3.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của oligochitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở điều kiện in vitro 47

3.5 Đánh giá ảnh hưởng của chitosan đến bệnh thán thư hại xoài bằng lây bệnh nhân tạo ở điều kiện in vivo 51

Chương 4 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

4.1 Kết luận 55

4.2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 58

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam là một trongnhững nước có các sản phẩm rau quả phong phú và đa dạng trên thế giới Cácsản phẩm rau quả của nước ta không chỉ phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước

mà còn trở thành mặt hàng xuất khẩu được nhiều nước ưa chuộng Hằng năm,xuất khẩu rau quả đã góp phần không nhỏ vào việc nâng cao nguồn ngân sáchcho nước ta Theo thống kê của Tổng cục Hải quan tính đến hết tháng 11/2011kim ngạch xuất khẩu rau quả của nước ta đạt khoảng 515 triệu USD, tăng 40,6%

so với cùng kỳ năm 2010 và đạt khoảng 109,5% so với kế hoạch xuất khẩu rauquả năm 2011 Tuy nhiên, việc xuất khẩu rau quả vẫn còn nhiều hạn chế,nguyên nhân chủ yếu là do tình trạng hư hỏng của rau quả sau khi thu hoạch cònrất cao, chiếm tới hơn 20% tổng sản lượng

Cây xoài (Mangifera indica L.) là một trong những loại cây ăn quả điển

hình cho vấn đề này Do có khả năng thích ứng rộng nên hiện nay cây xoài đãđược trồng ở nhiều nước và vùng lãnh thổ có điều kiện khí hậu á nhiệt đới Theo

tổ chức FAO, hiện có hơn 95 quốc gia trên toàn thế giới đang trồng và canh tácloại cây này (FAOSTAT 2010) Là loại cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao và

có tầm quan trọng về kinh tế, tuy nhiên ở xoài gặp một số bệnh ảnh hưởng tớinăng suất và phẩm chất của quả sau thu hoạch, trong đó bệnh thán thư là mộtbệnh thường gặp và gây hại nghiêm trọng nhất đối với xoài, làm mất giá trị thẩm

mỹ đồng thời làm giảm phẩm chất của quả xoài gây tổn thất cho người trồng,ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng

Bệnh thán thư gây hại trên xoài sau thu hoạch chủ yếu do nấm Colletotrichum

gloeosporioides gây ra Bệnh gây hại phổ biến ở tất cả các vùng trồng xoài trên

thế giới, nấm gây hại trên hoa, lá, quả khi còn trên cây và sau thu hoạch Sựphát triển của bệnh trên quả, bệnh nhiễm từ lúc trái non đến thu hoạch, vếtbệnh lúc đầu trên trái có những đốm nhỏ hình tròn có màu nâu hoặc nâu đensau lan ra, nhiều đốm kết hợp với nhau thành những đốm lớn hơn lõm vàophần thịt trái và có thể lan ra bao quanh trái, làm cho thịt trái bị thối Để hạnchế bệnh thán thư phát triển trên xoài sau thu hoạch, ngoài việc hạn chế tổnthương trên quả thì các loại thuốc hóa học như Benomyl và Thiabendazole(TBZ) thường được áp dụng ,

Cùng với sự phát triển ngày càng hiện đại thì xu thế của con người hướngđến với các hợp chất tự nhiên, hạn chế tối đa việc đưa các nguồn độc hại vào cơ

thể qua đường ăn uống càng thể hiện rõ Các loại sản phẩm được bảo quản bằngcác chế phẩm sinh học thật sự an toàn hơn, lành tính hơn đối với người tiêu dùng

vì quá trình bảo quản dựa trên các chế phẩm có nguồn gốc hoàn toàn tự nhiên.Chitosan, sản phẩm deacetyl của chitin, là một polymer tự nhiên không độchại với nhiều đặc tính sinh học quan trọng (kháng khuẩn, kháng nấm, ) từ lâu

đã được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống (thực phẩm, y dược,nông nghiệp, bảo vệ môi trường…) Tuy nhiên, do khả năng hòa tan kém (chỉ tantrong môi trường acid) đồng thời khi tan tạo ra dung dịch có độ nhớt cao nênchitosan khó sử dụng trong thực tế Khác với chitosan, oligochitosan có thể hòa

có trong các mắt xích D-glucosamine Chính đặc điểm khác biệt này đã tạo ranhiều hướng ứng dụng chitosan ở dạng oligochitosan, đặc biệt trong lĩnh vựcnông nghiệp (kích thích sinh trưởng, bảo vệ cây trồng), trở thành mối quan tâmnghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước , Sử dụng chitosanphòng trừ nấm gây bệnh thán thư trên một số loại quả sau thu hoạch đã đượcnhiều tác giả nghiên cứu và cho ra kết quả rất khả quan , Tuy vậy, việc ứng dụngchitosan ở dạng hòa tan trong nước như oligochitosan trong phòng trừ bệnh thánthư chưa được nghiên cứu và công bố rộng rãi

Nghiên cứu sử dụng chitosan hay oligochitosan trong phòng trị bệnh thánthư hại xoài nhằm thay thế phương pháp phòng trị bệnh bằng thuốc hóa học làkhá mới, hứa hẹn sẽ tạo ra chế phẩm có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm hiệuquả đối với các bệnh sau thu hoạch trên rau quả nói chung và bệnh thán thư trênxoài nói riêng

Xuất phát từ những yêu cầu đó và được sự đồng ý của bộ môn Cơ sở côngnghệ, khoa Cơ khí công nghệ, trường Đại học Nông Lâm Huế cùng với sự hướng

dẫn của thầy giáo ThS Lê Thanh Long, tôi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu sử

dụng chitosan phòng trừ bệnh thán thư hại xoài sau thu hoạch” với mục tiêu:

- Phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên

xoài

- Ứng dụng chế phẩm chitosan và oligochitosan kháng nấm Colletotrichum

gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài sau thu hoạch.

Chương 1 TỔNG QUAN

Xoài cùng họ với sấu, muỗm, cóc, đào lộn hột…

Cây xoài (Mangifera indica L.) thuộc chi Mangifera, là cây ăn quả có giá

trị kinh tế cao được trồng rộng rãi ở nhiều nơi và trở thành sản phẩm hàng hoá

quan trọng trên thế giới Chi Mangifera thuộc họ Anacardiaceae (đào lộn hột),

trong họ này có khoảng 100 chi và gần 1200 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệtđới và một số ở vùng ôn đới Ở nước ta có 18 chi, 56 loài, phần lớn là câyhoang dại, trong đó một số cây đã được trồng và có ý nghĩa kinh tế lớn như:sơn, xoài, trám, cóc, sấu, đào lộn hột, xoan nhừ, dâu da xoan… TheoMukherjee (1958) vùng phân bố chủ yếu của chi này là từ Ấn Độ - Malaysiakéo dài cho đến Philippines và phía đông New Guinea Căn cứ vào kết quảnghiên cứu về sinh thái, địa lý thực vật, tế bào học, giải phẫu học và hạt phấn

của chi Mangifera cho thấy trung tâm nguồn gốc của xoài là ở Myanmar, Thái

Lan, Đông Dương; bán đảo Malaysia cũng là trung tâm chủ chốt của các giốngxoài, còn các đảo của Indonesia (Java, Sumatra), Philippines thuộc trung tâmnguồn gốc thứ hai của quá trình phát triển

Theo số liệu của FAO, năm 2010 trên thế giới có 95 nước trồng xoài với

xoài có tiềm năng của thế giới với sản lượng năm 2010 là 574000 tấn trêndiện tích khoảng 71100 ha

- Nhóm giống xoài hạt đa phôi: bao gồm các giống trồng nhiều ở Đông

nhiều phôi, khi mọc có nhiều mầm cùng mọc trong đó chỉ có 1 mầm là mọc từphôi hữu tính, còn các mầm khác mọc từ phôi vô tính Mặt khác, mầm mọc từphôi hữu tính thường yếu hơn các mầm mọc từ phôi vô tính nên cây mọc lênthường là những cây giữ được các đặc tính tốt từ cây mẹ

Các giống xoài chính ở Việt Nam:

- Xoài cát Hoà Lộc: Trồng nhiều ở huyện Cái Bè (Tiền Giang) và huyện Cái

Mơn (Bến Tre) Quả có khối lượng lớn: 350 – 500 gam, quả chín màu vàngchanh, thịt quả có màu vàng tươi, ăn ngọt và thơm, năng suất cao và được nhândân vùng đồng bằng sông Cửu Long rất ưa trồng Thời gian từ khi ra hoa đến quảchín khoảng 100 – 105 ngày

- Xoài Bưởi: Đây là giống cũng được trồng nhiều ở huyện Cái Bè (Tiền

Giang) Quả có vỏ dày, khối lượng quả trung bình 250 – 350 gam nên chịu đượcvận chuyển Phẩm chất quả kém hơn xoài cát, thịt quả nhão, ngọt vừa phải và cómùi nhựa thông

- Xoài Tượng: Đây là giống xoài có quả rất lớn: có quả nặng 700 – 800

gam, cây ra hoa sớm nên tháng 3 đã cho thu hoạch Quả chín màu vàng nhạt ửngxanh, vỏ quả trơn bóng, thịt quả màu vàng nhạt, ít xơ, vị chua, thường dùng sửdụng ăn xanh

- Xoài Thanh Ca: Trồng nhiều ở Nha Trang (Khánh Hoà), Bình Định Đây

là giống xoài ngon, ra hoa và quả chín nhiều đợt trong năm Quả hình trứngnặng trung bình 350 – 580 gam, vỏ bóng, có màu vàng tươi, thịt quả ít xơ, nhiềunước, nhiều bột, ăn ngon, thơm

- Xoài Thơm: Trồng nhiều ở Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ Khối lượng

quả 250 – 300 gam, thịt quả vàng, thơm dày, thơm, ngọt Vỏ quả xanh đậm(giống Thơm đen) hoặc xanh nhạt (giống Thơm trắng) So với xoài cát, giốngnày cho năng suất cao và ổn định qua các năm Xoài Thơm cho trung bình 150 –

200 kg quả/cây, quả cho năng suất cao

- Xoài trứng Yên Châu: Được trồng nhiều ở Yên Châu và Mai Sơn (Sơn

La) Quả tròn, bé, quả nặng trung bình 150 – 220 gam, chín vào cuối tháng 5đầu tháng 6, khi chín vỏ quả có màu xanh vàng, vỏ dày nên chịu được vậnchuyển Thịt quả màu vàng đậm, nhiều nước, ngọt đậm và thơm ngon Nhượcđiểm là quả bé, hạt lớn nên tỷ lệ ăn được thấp

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng

Xoài là loại quả quý của vùng nhiệt đới, quả xoài giàu chất dinh dưỡng, đặcbiệt hàm lượng Vitamin A vượt xa các loại quả khác, theo kết quả nghiên cứucủa các nhà khoa học Trung Quốc thì hàm lượng Vitamin A trong 100 gam thịtquả giống xoài Hoa tím (Trung Quốc) tương đương với 200g sữa bò, hoặc 250g

cá diếc, hoặc 50g thịt lợn hay thịt bò

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của xoài chín

1.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ xoài trên thế giới

Hiện nay cây xoài được trồng ở 95 nước trên thế giới và được coi là mộttrong những cây ăn quả quan trọng, do nhu cầu về xoài quả trên thế giới ngày

càng tăng nên diện tích sản xuất xoài ngày càng được mở rộng và sản lượng xoàitrên thế giới liên tục tăng, năm 1990 (15,75 triệu tấn), năm 2000 (24,70 triệutấn), năm 2005 (27,97 triệu tấn) và năm 2010 (38,67 triệu tấn) với diện tích trên5,2 triệu ha

Bảng 1.2 Sản lượng xoài trên thế giới từ 2000 - 2005

(ĐVT: 1000 tấn)

Tên nước Sản lượng Tên nước Sản lượng

Đến năm 2005, sản lượng xoài trên thế giới ước lượng khoảng 28 triệutấn Trong thời kỳ 1996 đến 2005, tốc độ tăng trưởng sản lượng hàng năm củaxoài là 2,6% Mười nước đứng đầu chiếm 85% sản lượng xoài trên thế giới.Trong đó Ấn Độ chiếm 38,6% từ năm 2003 đến 2005 với sản lượng 10,8 triệutấn

Xoài xuất khẩu trên thị trường chủ yếu dưới dạng quả tươi, chịu vậnchuyển kém, khó bảo quản, vì vậy số lượng xoài trao đổi trên thị trường thế giớicòn hẹp Mặc dù lượng xoài lưu thông trên thế giới chỉ bằng 3% sản lượng sảnxuất ra, nhưng số lượng tăng đáng kể so với 20 năm trước Về mặt phân phối,Mexico, Brazil, Peru, Ecuador và Haiti là những nước cung cấp chính cho thịtrường các nước Bắc Mỹ Ấn Độ và Pakistan lại chiếm lĩnh thị trường Tây Á.Các nước vùng Đông Nam Á nhập khẩu xoài từ Philippines và Thái Lan Liênminh Châu Âu nhập khẩu xoài từ các nước Nam Mỹ và Châu Á

Năm 2005, xuất khẩu xoài trên thế giới đạt 912853 tấn, trị giá 543,10 triệuUSD Trong 10 nước xuất khẩu xoài hàng đầu thế giới, Ấn Độ thay thế Mexico

để trở thành nước xuất khẩu xoài hàng đầu năm 2005 Từ 2003 cho đến 2005,

Ấn Độ và Mexico chiếm lần lượt là 22,6% và 20,3% thị trường xuất khẩu, tiếptheo đó là Brazil (13,2%) và Pakistan (6,9%) Những nước xuất khẩu khác baogồm Hà Lan, Peru, Ecuador, Philippines, Thái Lan và Trung Quốc

Nhập khẩu xoài trên thế giới tăng từ 397623 tấn vào năm 1996 lên 826584 tấnvào năm 2005 Đứng đầu về nhập khẩu trong suốt thời gian từ 2003 cho đến 2005

là Mỹ với số lượng 271848 tấn và chiếm 1/3 lượng xoài nhập khẩu của thế giới Theo thống kê của tổ chức FAOSTAT 2007, mặc dù phần lớn các giốngxoài nổi tiếng trên thế giới đều từ bang Florida (Mỹ), nhưng Mỹ không phải lànước xuất khẩu xoài chính mà là nước nhập khẩu xoài hàng đầu thế giới, chiếmđến 32,7% trong suốt thời kỳ từ 2003 đến 2005

Vùng nhập khẩu xoài lớn nhất vẫn là Châu Âu, Bắc Mỹ chiếm 66% nhậpkhẩu của thế giới Nhật Bản duy trì ở mức 3% Chính vì lẽ đó mà việc sản xuấtxoài thương mại phục vụ cho xuất khẩu đã và đang được nhiều nước quan tâm

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ xoài ở trong nước

Ở nước ta, mặc dù cây xoài được trồng ở nhiều địa phương trong cả nướcnhưng những vùng sản xuất xoài chủ yếu tập trung ở các tỉnh Miền Nam Ngoài

ra, một số tỉnh ở Miền Bắc, đặc biệt là Yên Châu (Sơn La) cũng góp phần đáng

kể vào việc nâng cao sản lượng xoài cho cả nước Theo số liệu của Tổng cụcThống kê năm 2007, sản lượng xoài trên cả nước đạt 409300 tấn, trong đó ởTiền Giang chiếm 79000 tấn, Vĩnh Long 46200 tấn, Đồng Nai 43400 tấn, KhánhHòa 28400 tấn, Trà Vinh 21400 tấn, Hậu Giang 20500 tấn, Bến Tre 15400 tấn,Tây Ninh 15000 tấn, Kiên Giang 14700 tấn, Bình Thuận 13400 tấn, Thành phố

Hồ Chí Minh 13300 tấn, Sơn La 11200 tấn

Bảng 1.3 Diện tích và sản lượng xoài ở Việt Nam (2005 – 2010)

Diện tích và sản lượng xoài trong cả nước trong những năm gần đây tăng từ

51600 ha với sản lượng 367800 tấn (năm 2005) lên 71100 ha (năm 2010) tăng1,4 lần diện tích và sản lượng đạt 574000 tấn (tăng 1,6 lần)

Nhìn chung đồng bằng sông Cửu Long là nơi sản xuất xoài hàng hóa lớnnhất nước ta Từ đây, xoài được mang đi tiêu thụ khắp cả nước Do sản lượngxoài nước ta chưa nhiều nên chỉ đáp ứng một phần nhu cầu nội địa, trong đó cáctỉnh miền Bắc là một thị trường lớn, phần lớn xoài tiêu thụ ở đây từ các tỉnhmiền Nam đưa ra

Trung tâm đầu tư chương trình hợp tác của FAO và Ngân Hàng phát triểnchâu Á (ADB) thống kê năm 1998, mức tiêu thụ sản phẩm cây ăn quả ở ViệtNam khoảng 38 kg/người, ngang bằng với một số nước trong khu vực nhưngthấp hơn các nước châu Á và Mỹ La tinh Trong cơ cấu tiêu thụ, xoài được xếpvào loại chủ yếu cùng với chuối, dứa, cam Đây là một mức tiêu thụ sản phẩmkhá lớn của người dân Việt Nam

1.1.5 Các loại bệnh sau thu hoạch thường gặp ở xoài và biện pháp xử lý

1.1.5.1 Các bệnh sau thu hoạch thường gặp ở xoài

Trên xoài thường xuất hiện một số loại bệnh, trong đó, bệnh thán thư do

nấm Colletotrichum gloeosporioides là bệnh gây hại quan trọng nhất đối với

xoài sau thu hoạch Quả bị bệnh lúc đầu chỉ xuất hiện các chấm nâu nhỏ, sau đóphát triển thành các đốm thối đen lõm trên mặt vỏ quả, quả bị chín ép hoặc thối

khi bảo quản.

Bệnh thối quả do nấm Diplodia natalensis là bệnh gây hại phổ biến trong điều

kiện nóng ẩm của mùa mưa Bệnh hại quả trong thời kỳ bảo quản và vận chuyểnlàm thối phần thịt quả chỗ gần cuống hoặc ở chỗ vỏ bị xây xát hay bầm dập

Ngoài ra bệnh thối Alternaria do nấm Alternaria alternate và bệnh thối

Aspergillus (còn gọi là bệnh thối đen) do nấm Aspergillus spp gây ra khi quả

tiếp xúc với các sản phẩm bị bệnh hay các dụng cụ chứa đã bị nhiễm

1.1.5.2 Một số phương pháp xử lý nấm bệnh sau thu hoạch

Xử lý, bảo quản rau quả sau thu hoạch là khâu quan trọng trong quy trình sảnxuất, có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm bệnh và làm giảm triệu chứng tổnthương của quả trong suốt quá trình bảo quản nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm,phục vụ xuất khẩu Hiện nay, trên thế giới và trong nước có nhiều phương pháp xử

lý, bảo quản xoài, dưới đây là một số phương pháp được sử dụng phổ biến

- Phương pháp bảo quản lạnh

Bảo quản lạnh là biện pháp có hiệu quả nhất trong việc hạn chế quá trình

hô hấp, hạn chế sự chín của quả và ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật Đây làphương pháp được sử dụng rất phổ biến trên thế giới

Kết quả nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu cây ăn quả miền Nam cho thấy

hơn 20% sau khoảng 1 tháng, chất lượng không ngon, màu sắc phát triển không

nhưng thời gian bảo quản bị rút ngắn, quả chín nhanh hơn và tỉ lệ thối cao hơn.Quả xoài bảo quản ở 12oC bị tổn thương lạnh rất ít, giảm tỉ lệ thối, quá trình chínchậm và vẫn giữ được chất lượng tốt

phương pháp bảo quản hiệu quả nhất, thời gian bảo quản có thể kéo dài đến 30ngày, tỷ lệ hao hụt dưới 10%, có thể vận chuyển đi xa và xuất khẩu Tuy nhiên,

màu, thịt mềm, mùi vị không đặc trưng như chín bình thường

- Phương pháp xử lý bằng nước nóng

Xử lý nhiệt là một biện pháp vật lý được ứng dụng ngày càng rộng rãi vì nó

có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh và làm giảm ảnh hưởng của tổn

thương lạnh trên quả xoài Tuy nhiên, phương pháp xử lý bằng nhiệt sẽ ít nhiều

có ảnh hưởng đến sinh lý quả xoài được xử lý Nếu nhiệt độ và thời gian xử lýkhông thích hợp có thể gây ra hiện tượng rộp hay phồng vỏ quả và có thể ảnhhưởng đến chất lượng bên trong của quả

Ở Philippines người ta đã xử lý nước nóng 55oC trong 10 phút đối với xoài, cóthể hạn chế nấm thán thư Theo Quimio và Seggell (1963), đối với xoài xử lý nước

nóng có hiệu qủa nhất ở nhiệt độ 53 – 55oC trong 5 phút hay 50oC trong 10 – 15phút, sẽ làm giảm mức độ hư hỏng rõ rệt trên xoài

Có thể kết hợp phương pháp xử lý nước nóng với hóa chất ở nồng độ chophép đối với xoài sau thu hoạch để đạt hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật cao KhoaNông nghiệp trường Đại học Cần Thơ đưa ra khuyến cáo sử dụng nước nóng

khả năng hạn chế sự phát triển của nấm gây bệnh thán thư và bệnh thối gốccuống trái Tuy nhiên, nếu xử lý ở nhiệt độ 55 oC có thể làm màu sắc bề mặt quả

bị biến đổi

- Phương pháp xử lý hoá chất

Hiện nay, trong thực tế để bảo quản rau quả người ta vẫn thường sử dụng một

số loại hóa chất cho phép ở những liều lượng khác nhau nhằm kéo dài thời hạn bảoquản quả

được bệnh thán thư, thối cuống và đốm đen nhưng vỏ bị gây hại Trong một thờigian dài Benomyl (Benlate, Bavistin hay Carbendazim) được phép sử dụng ở một

số nước trong xử lý sau thu hoạch Tuy nhiên gần đây tổ chức FAO đã khuyến cáokhông nên sử dụng chất này cho mục đích bảo quản

Tác giả Thái Thị Hòa và Đỗ Minh Hiền – Viện nghiên cứu rau quả miềnNam xử lý xoài cát Hòa Lộc sau thu hoạch bằng cách ngâm xoài 2 h trong

thương phẩm của trái sau khi chín

+ Phương pháp bảo quản trong môi trường khí quyển điều chỉnh CA

(Controled Atmosphere): Phương pháp bảo quản rau quả tươi trong môi trườngkhí quyển điều chỉnh bằng khí O2, CO2 khác với khí quyển bình thường Khí O2,

CO2 có tác dụng trực tiếp lên quá trình sinh lý, sinh hóa của rau quả và từ đó ảnhhưởng đến thời hạn bảo quản của chúng

+ Phương pháp bảo quản trong môi trường không khí cải biến MA(Modified Atmosphere): Phương pháp này được thực hiện trong môi trường

đựng trong túi màng mỏng PE có tính thẩm thấu chọn lọc Trong thời gian bảo

dần do đó sẽ ức chế được quá trình hô hấp, quá trình sinh tổng hợp ethylen vàcác quá trình sinh hóa khác, nhờ đó kéo dài được thời hạn tồn trữ

1.2 Đặc điểm của bệnh thán thư do nấm Collectotrichum gloeosporioides gây

hại

Bệnh thán thư xoài là do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc Thuộc họ Melanconiaceae, bộ Menaconiales, lớp nấm bất toàn Giai đoạn hữu tính là Colletotrichum cingulata thuộc lớp nấm túi

Nấm C gloeosporioides là loài nấm gây bệnh thán thư trên rất nhiều cây

trồng khắp thế giới, đặc biệt ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới

Là một trong các bệnh nghiêm trọng nhất trên cây xoài, đặc biệt trên quả.Triệu chứng và dấu hiệu của bệnh thán thư có thể thay đổi theo cây ký chủ,

bộ phận cây bị tấn công và điều kiện ngoại cảnh nhưng nhìn chung đều là cácvết đốm chết hoại, trên vết đốm có các ổ bào tử (đĩa cành nấm) màu gạch nonhoặc đen

Trên cây xoài, bệnh xuất hiện và gây hại ở tất cả các bộ phận trên mặt đấtcủa cây, nhưng xâm nhập và gây hại phổ biến ở trên lá, hoa, quả, làm ảnh hưởnglớn tới năng suất, phẩm chất quả

- Trên lá: Vết bệnh lúc đầu xuất hiện là những đốm chết hoại nhỏ trên bề

mặt, về sau các đốm loang rộng thành vết riêng biệt có dạng hình tròn hoặc cógóc cạnh Khi gặp điều kiện ẩm ướt, chúng liên kết lại tạo thành các vết bệnhlớn, hình dạng không đều đặn, giữa vết bệnh có tâm màu nâu sáng hoặc nâuxám, bao quanh có viền màu đen hay nâu sẫm, xung quanh vết bệnh có màuxanh sáng đến xanh vàng nhạt Trong điều kiện ẩm độ cao và nhiệt độ thích

hợp thì trên vết bệnh hình thành các đĩa cành xếp theo hình vòng nhẫn đồngtâm, còn nếu trong điều kiện khô thì vết bệnh có thể bị khô và để lại những vếtrạn, rách và thủng lá.

- Trên hoa: Vết bệnh là những đốm nhỏ, hình góc cạnh, màu đen Các vết

bệnh mở rộng, liên kết lại với nhau gây hiện tượng rụng và chết khô hoa, bệnhgây hại trên hoa, cuống và nhánh hoa

- Trên thân cành: Bệnh hại chủ yếu trên các cành non mới ra Ban đầu xuất

hiện các vết đốm màu nâu vàng, nhỏ, sau liên kết với nhau tạo thành vết bệnh cómàu nâu tối Khi gặp điều kiện ẩm ướt, các vết bệnh mở rộng ra, khi gặp thờitiết khô vết bệnh bao bọc quanh thân cành làm cành khô héo

- Trên quả: Vết bệnh trên quả lúc đầu là những chấm nhỏ, màu đen sau lan

rộng thành vết bệnh có màu đen nâu, hình góc cạnh hơi lõm xuống có màu nâu tớimàu đen Giai đoạn quả non thì triệu chứng thường ở cuống quả, còn ở quả sauthu hoạch thường vết bệnh lớn, bệnh xuất hiện nhiều ở má quả và đáy của quả

Nấm Collectotrichum gloeosporioide có phạm vi ký chủ rất rộng gây hại

chủ yếu trên xoài, bơ, hành, chanh, cam, bưởi, quýt, đu đủ, cà phê, ớt, cà chua,

… Ngoài ra, C gloeosporioides còn tồn tại trên các cây ký chủ thiết yếu như cây

thích, cây muông, cây cúc, cây khoai sọ, cây bạch đàn, cây chuối, cây hồng, câylong não, cây sầu riêng, cây vải và cây cà rốt

Cành bào tử hình thành trên vết bệnh, các lông gai tròn, hơi dài hoặc khôngđều, kích thước lớn có thể lên tới 500μm có 1 - 4 vách ngăn, màu nâu thườngnhẹ ở góc và thon nhọn nhẹ ở đỉnh Bào tử đôi khi cũng sinh ra trên lông gai.Bào tử phân sinh hình trụ với các đầu hơi tù, đôi khi hơi nhọn, đỉnh tròn, cuốnghẹp trong suốt, không có vách ngăn, kích thước 9 - 24 x 3 - 6μm hình thành trêncác bào tử phân sinh hình trụ trong, khối bào tử có màu hồng nhạt

Tản nấm trên môi trường PDA có màu trắng xám đến xám đậm Quả thể

mở hình thành riêng lẻ hoặc tập trung thành đám, hình cầu hoặc hình quả lê vớikích thước 85 - 350μm lỗ mở hơi nhú lên hình tròn, các túi (có 8 bào tử túi)hình chùy tới đáy trụ dày lên ở đỉnh túi và có kích thước 35 - 80 x 8 - 14 μmcác túi nằm rải rác với các sợi nấm vô tính nằm ở đáy quả thể, các bào tử túithường cong hình con nhộng hơi cong nhẹ, đơn bào

Colletotrichum gloeosporioides là loại nấm hoại sinh phổ biến và xâm nhập

chủ yếu trên các mô chết và mô bị thương Bào tử nảy mầm đòi hỏi độ ẩm gần100% Tuy nhiên, bệnh vẫn có thể xuất hiện ở điều kiện khô hơn khi bào tử hoặc

sợi nấm tiềm sinh xâm nhập trên mô bị thương và mô đã già Đây là một trongnhững đặc điểm quan trọng của nhiều vụ dịch bệnh, đặc biệt trên quả.

Bệnh phát triển mạnh khi có ẩm độ và nhiệt độ cao Nấm có thể sinhtrưởng ở nhiệt độ tới 4oC, nhưng tối thích là 25 – 29oC

Bề mặt mô bệnh ẩm ướt kéo dài có ảnh hưởng đến sự nảy mầm, xâm nhiễm

và sinh trưởng của C gloeosporioides.

Bệnh thán thư xuất hiện ở hầu hết các tháng trong năm Bệnh hại mạnhnhất vào tháng 3 và tháng 7 trong năm do điều kiện ẩm độ không khí cao thuậnlợi cho sự phát triển của bệnh

1.3 Tổng quan về chitosan và oligochitosan

1.3.1 Chitosan

1.3.1.1 Cấu trúc của chitosan

Chitosan là một dẫn xuất của chitin Trong tự nhiên chitosan được tìm thấy

trong thành tế bào của nấm thuộc lớp Zygomycetes, trong chất Chlorophycean của tảo Chlorella sp và trong lớp biểu bì các loài côn trùng Ngoài ra nó có nhiều

trong vỏ động vật giáp xác tôm, cua, ghẹ và mai mực Vì vậy vỏ tôm cua ghẹ lànguồn nguyên liệu tốt để sản xuất chitin – chitosan và dẫn xuất của chúng

Cấu tạo hoá học của chitosan tương tự với cellulose, chỉ khác một nhóm

bằng nhóm amino ở chitosan), nhưng tính chất của chúng lại rất khác nhau… Chitosan là một polysaccharide cao phân tử, mạch thẳng, cấu tạo từ cácmắt xích D – glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-1- 4-glycoside Ngoài

ra, chitosan cũng được tạo ra từ quá trình deacetyl hóa chitin

Chitosan là một polymer hữu cơ có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-1- 4-glycoside

β-D-Tên hoá học của chitosan là: Poly-β-(1,4)-D-glucosamine, hay còn gọi làpoly- β-(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của chitosan

Công thức phân tử: [C6H11O4N]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Độ deacetyl hóa – DD (Degree of deacetylation) của chitosan: Là tỷ lệ thay

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, dung dịch kiềm và axítđậm đặc nhưng tan trong axít loãng (pH = 6), tạo dung dịch keo nhớt trong suốt,

có khả năng tạo màng tốt

Khi hoà tan chitosan trong dung dịch acid acetic loãng sẽ tạo thành dungdịch keo dương, nhờ đó mà keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một sốion kim loại nặng như: Pb3+, Hg+,…

Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo muối khó tan

tím Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan

Chitosan nóng chảy ở nhiệt độ 309 – 311oC

Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là mộtpolycationic (pH<6,5), có khả năng bám dính trên những bề mặt có điện tích

âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid

Chitosan thương mại ít nhất phải có mức DD (degree of deacetylation)

hơn 70%.

Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷsinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể và có khả năng tự phân huỷ sinhhọc cao

1.3.1.3 Phương pháp sản xuất chitosan

Trong phế thải thủy sản (vỏ tôm, đầu tôm, mai mực,vỏ cua…) có chứachủ yếu là: protein, chitin và chất khoáng trong đó chitin chiếm khoảng 14 –35% Như vậy muốn thu được chitin ta cần loại bỏ protein và khoáng chất sau

đó deaxetyl hóa chitin thu được chitosan

Để sản xuất chitin từ phế thải thủy sản, hiện nay có ba phương pháp chủ yếu:

+ Đây là một phương pháp sản xuất sạch và có chi phí thấp

+ Tạo những chất thải hữu cơ dễ phân hủy

+ Tạo ra nhiều chất thải khó xử lý, tốn năng lượng

+ Không ổn định và làm thay đổi khối lượng phân tử chitin do mạch bị cắtngẫu nhiên dẫn đến thay đổi độ nhớt

+ Tuy nhiên, trong công nghiệp hiện nay phương pháp hóa học vẫn được

sử dụng rộng rãi và phổ biến hơn cả

1.3.2.1 Cấu trúc của oligochitosan

Oligosaccharide là những polymer của các monosaccharide như glucose,fructose, galactose có mức độ polymer hóa khoảng từ 2~30

Oligosaccharide có hơn 100 loại và chúng chiếm hơn 50% trong hơn 223loại thực phẩm chức năng đã được thương mại hóa Chúng tồn tại trong thiênnhiên hay được tạo ra từ polysaccharide bởi quá trình thủy phân, như fructo-oligosaccharide từ fructose, xylo-oligosaccharide từ xylose, galacto-oligosaccharide từ lactose, chitosan-oligosaccharide từ chitosan… Trong đó,chitosan oligosaccharide là loại oligosaccharide có nhiều đặc tính sinh học đặcbiệt, là đối tượng được nhiều nhà nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm.Oligochitosan hòa tan trong nước do mạch phân tử ngắn và sự có mặt của cácnhóm NH2 tự do có trong các mắt xích D-glucosamine Nó được tạo ra từ chitosanchủ yếu bằng phương pháp thủy phân Tùy thuộc vào mức độ polymer hóa (degree

of polymerization – DP) của quá trình thủy phân chitosan có thể chia sản phẩmthủy phân làm hai loại: chitosan có khối lượng phân tử thấp (low molecular weightchitosan – LMWC) và chitosan oligosaccharide (COS) COS có khả năng hòa tantốt hơn LMWC do độ DP thấp hơn tuy nhiên việc phân biệt LMWC và COS thôngqua DP không rõ ràng

1.3.2.2 Tính chất của oligochitosan

Oligochitosan là chất rắn màu vàng nhạt, có vị đắng đặc trưng

Chitosan và oligochitosan là các polycation có khả năng kết hợp mạnh mẽvới các bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid

các acetyl từ các gốc D-glucosamine Chính đặc điểm lý hóa đặc biệt này kếthợp với khả năng hòa tan tốt trong nước ở pH trung tính tạo dung dịch có độnhớt thấp khiến cho oligochitosan có rất nhiều đặc tính sinh học như: khángkhuẩn, kháng nấm, hoạt tính chống ung thư , giảm đau, chống oxy hóa, tác độngbảo vệ chống xâm nhiễm

Những đặc tính sinh học kể trên phụ thuộc đáng kể vào các yếu tố lý hóanhư DD, khối lượng phân tử hay mức độ polymer hóa DP phân bố điện tích vàbiến đổi hóa học của phân tử oligochitosan Trong đó, khối lượng phân tử đượcxem là yếu tố cơ bản ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính sinh học củaoligochitosan

Trong số các đặc điểm đặc trưng của nó hiện đang được biết đến là mộtsaccharide không bị phân hủy bởi các enzyme trong cơ quan tiêu hóa và là mộtchất có tính chất kháng khuẩn và cải thiện chức năng gan Ngoài raoligochitosan có tác dụng giải phóng các protein có độc tính trong các loài thựcvật bậc cao

1.3.2.3 Phương pháp sản xuất oligochitosan

Để sản xuất oligochitosan người ta tiến hành thủy phân chitosan bằng các tácnhân hóa học và enzyme, trong đó phương pháp hóa học được sử dụng phổ biếnhơn ở quy mô công nghiệp Tuy nhiên, do tạo ra nhiều chất độc hại có nguy cơ làm

ô nhiễm môi trường cao, ít nhiều làm thay đổi cấu trúc sản phẩm và hiệu suất thấpnên phương pháp hóa học gặp bất lợi khi áp dụng vào thực tế sản xuất Quá trìnhthủy phân chitosan bằng enzyme sẽ giảm thiểu những thay đổi về hóa học của sảnphẩm, dễ dàng trong điều chỉnh sản phẩm và hạn chế những ảnh hưởng bất lợi đếnnhững đặc tính sinh học của chúng

Cellulase với khả năng thủy phân không đặc hiệu chitosan đã được một sốtác giả sử dụng để thủy phân chitosan tạo ra oligochitosan , thay thế chochitosanase đặc hiệu có chi phí rất cao

Nguyên liệu chính để tạo dẫn xuất oligochitosan là chitosan với các mức độ

DD khác nhau

Tương tự các polysaccharide khác, do tồn tại các liên kết β-1,4 glycosidekhông bền trong mạch phân tử nên chitosan cũng có thể bị thủy phân bởi các tácnhân thủy phân khác nhau Kết quả sẽ tạo ra sản phẩm oligochitosan khác nhau

về mức độ polymer cũng như số lượng và phân bố các đơn phân D-glucosamine(GlcN), N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) trong mạch phân tử

Trong phương pháp thủy phân chitosan bằng tác nhân hóa học thì việc sử

khả năng cắt mạch thân thiện và không để lại tạp chất trong sản phẩmoligochitosan Tuy nhiên, mức độ loại bỏ gốc NH2 trong các mắt xích D-glucosamine cần phải được khống chế thích hợp dựa vào các điều kiện của quátrình cắt mạch Do đó, sản phẩm oligochitosan là an toàn khi sử dụng để phòngbệnh hại đối với rau quả ,

1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan và oligochitosan

1.3.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan

Chitosan là hợp chất tự nhiên có khả năng phân huỷ sinh học cao, khôngđộc hại và được ứng dụng đa dạng trong nông nghiệp, trong đó vấn đề đượcquan tâm nhất là khả năng kiểm soát các bệnh gây ra bởi nấm ở cây trồng, đây làmột vấn đề được chú trọng hàng đầu trong ngành sản xuất nông nghiệp

Chitosan và oligochitosan không những ức chế các vi khuẩn gram dương,gram âm mà cả nấm men và nấm mốc Khả năng kháng khuẩn của chúng phụthuộc vào một vài yếu tố như loại chitosan sử dụng (độ DD, khối lượng phântử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có mặt của một số thành phần thực phẩm Khảnăng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu bởi một

số tác giả, trong đó cơ chế kháng khuẩn cũng đã được giải thích trong một sốtrường hợp Mặc dù chưa có một giải thích đầy đủ cho khả năng kháng khuẩnđối với tất cả các đối tượng vi sinh vật, nhưng hầu hết đều cho rằng khả năngkháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan lên bề mặt tế bào Trong

đó, chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn gram âm tốt hơn vi khuẩn gramdương Một số cơ chế đã được giải thích như sau:

thay đổi tính thấm của màng tế bào

- Quá trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng Lúcnày, vi sinh vật không thể nhận các chất dinh dưỡng cơ bản cho

sự phát triển bình thường như glucose dẫn đến mất cân bằnggiữa bên trong và bên ngoài màng tế bào Cuối cùng dẫn đến sựchết của tế bào

monomer ở pH<6,3 tác động lên các điện tích âm ở thành tế

bào của vi khuẩn, dẫn đến sự rò rỉ các phần tử ở bên trongmàng tế bào Đồng thời gây ra sự tương tác giữa sản phẩm củaquá trình thuỷ phân có khả năng khuếch tán bên trong tế bào visinh vật với AND dẫn đến sự ức chế mARN và sự tổng hợpprotein tế bào.

- Chitosan có khả năng phá huỷ màng tế bào thông qua

của thành phần phospholipid của màng tế bào vi khuẩn

Đối với các tế bào nấm, chitosan không những có khả năng tác dụng ở mức

độ ngoại bào mà còn tác dụng lên chúng ở mức độ nội bào

Tác dụng của chitosan trên các loại nấm gây bệnh đã được đánh giá ở cácnghiên cứu khác nhau Nhưng nhìn chung, mức độ ảnh hưởng của polymer này

có thể thay đổi và phụ thuộc vào đặc điểm của tế bào nấm Những nghiên cứutrước đây cho thấy rằng các bào tử nhạy cảm hơn so với sợi nấm dưới tác dụngcủa chitosan

Một số nghiên cứu cho thấy rằng chitosan có khả năng trung hòa điệntích ở bề mặt tế bào và làm thay đổi tính thấm của màng Do đó tương tác nàychính là nguyên nhân làm cho màng tế bào mất điện tích và gây nên hiệntượng rò rỉ các vật chất bên trong

Năm 1992, tác giả El Ghaouth và cộng sự đã đưa ra kết luận rằng chitosan

có khả năng làm thay đổi thành phần amino axit và protein của tế bào nấm

Rhizopus stolonifer

Chitosan tác động đến màng tế bào của bào tử nấm, gây tổn thương vàlàm cho màng tế bào không còn nguyên vẹn Ngoài ra, chitosan còn làm pHcủa môi trường bên trong tế bào thay đổi và giải phóng các phân tử protein, đó

là nguyên nhân gây ra sự tổn thương lớn đến màng tế bào của bào tử nấm Năm

2010, trong nghiên cứu về tác động của chitosan có khối lượng phân tử khác

nhau đến việc kiểm soát bệnh thối quả cà chua do nấm Rhizopus gây hại, tác

giả Hernández-Lauzardo và cộng sự đã cho biết rõ về tác động này củachitosan Hiệu quả ảnh hưởng của chitosan tới màng tế bào của bào tử nấm phụthuộc vào độ deacetyl, loại chitosan và nồng độ chitosan sử dụng

Trong các nghiên cứu khác, chitosan gây ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của

màng tế bào khiến cho các thành phần cấu tạo nên tế bào thoát ra ngoài Bêncạnh đó, chitosan còn gây ảnh hưởng đến đặc tính của màng tế bào Nhóm cáctác giả García-Rincón J, Vega-Pérez J, Guerra-Sánchez MG đã chứng minh

bào Hiệu ứng này có thể gây tích lũy các proton bên trong tế bào dẫn đến ứcchế khả năng trao đổi của ion H+/K+, ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tổng hợpATP của tế bào

1.3.3.2 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của oligochitosan

Các hoạt tính sinh lý và tính chất chức năng của chitosan hay oligochitosanphụ thuộc chủ yếu vào khối lượng phân tử của nó Năm 2009, trong nghiên cứu

ở điều kiện in vitro trên loài nấm Botrytis cinerea gây bệnh thối xám trên quả

cho thấy hoạt động kháng nấm tăng khi khối lượng phân tử của chitosan giảm

Kết quả tương tự được chỉ ra trên nấm Aspergillus niger, hoạt tính kháng nấm

cao tương ứng với chitosan có trọng lượng phân tử thấp

Ngoài ra, chitosan có khối lượng phân tử thấp có khả năng ức chế mạnh

đến sự tăng trưởng của sợi nấm B Cinerea và Penicillum expansum Trọng

lượng phân tử chitosan cũng ảnh hưởng đến các phản ứng sinh hóa

Bản chất polycationic của chitosan và oligochitosan cho phép chúng phảnứng với các nhóm tích điện âm của nấm, do đó biểu hiện khả năng ức chế các tếbào nấm Do có sự hình thành của các phức polyelectrolyte giữa oligochitosanvới nhóm tích điện âm trên bề mặt tế bào nên chúng có khả năng cản trở sự tăngtrưởng và các chức năng sinh lý của nấm Ngoài ra, hiệu quả chống nấm thể hiện

rõ hơn trong điều kiện nhiệt độ và pH thấp

Oligochitosan là polymer có khối lượng phân tử thấp, có thể hòa tan trongnước Chính đặc điểm khác biệt này đã tạo ra nhiều hướng ứng dụng chitosan ởdạng oligochitosan, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp (kháng nấm, khángkhuẩn, kích thích sinh trưởng…) Vì vậy, khối lượng phân tử được coi là mộtđặc tính chủ yếu của oligochitosan liên quan đến nhiều đặc tính sinh học của nó

1.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Do có những đặc tính sinh học đặc biệt, thân thiện với môi trường, chitosan và oligochitosan đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu về khả năng kháng nấm bệnh trên rau quả, đặc biệt là trên đối tượng xoài sau thu hoạch.

Năm 2003, nhóm các tác giả S Bautista-Bãnosa, M Hernández - Lópeza, E.

Bosquez-Molina, C.L Wilson đã đưa ra kết luận về khả năng kháng nấm C.

gloeosporioides gây bệnh thán thư trên cây đu đủ dựa trên sự kết hợp giữa

chitosan và các dịch chiết từ lá mãng cầu, lá và hạt đu đủ Sự kết hợp giữa

chitosan và các chất chiết từ thực vật cho hiệu quả kháng nấm C gloeosporioides

cao hơn trong trường hợp chỉ sử dụng từng tác nhân đơn lẻ Dung dịch chitosan ởmức nồng độ 2,0% và 3,0% có tác dụng ức chế nấm trong khi đó các chất chiếtxuất từ thực vật khả năng kháng nấm chưa thể hiện rõ, điều đặc biệt là khi có sựkết hợp giữa chitosan và dịch chiết từ thực vật thì dung dịch chitosan chỉ với mứcnồng độ 2,5% thì tác dụng kháng nấm thể hiện rất rõ rệt

Năm 2005, trong nghiên cứu của Hernández – López và cộng sự đã chothấy ảnh hưởng của chitosan với các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0; 1,5 và 2%)

đến sự phát triển của hai chủng nấm C gloeosporioides được phân lập trên mẫu

đu đủ bị nhiễm bệnh từ các tiểu bang Veracruz và Guerrero thuộc Mexico ở điều

kiện in vitro

Cũng trên đối tượng đu đủ, vào năm 2006 tác giả Asgar Ali cũng đã nghiêncứu ảnh hưởng của chitosan đến khả năng phát triển của sợi nấm và mức độ gây

tổn thương bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides ở các nồng độ 0,5; 1,0;

1,5 và 2% Kết quả cho thấy rằng tốc độ sinh trưởng của sợi nấm đều giảm đáng

kể ở tất cả các nồng độ chitosan được khảo sát so với đối chứng Tác giả cũngchỉ ra rằng nồng độ chitosan có khả năng ức chế tối đa (100%) sự phát triển củasợi nấm là 2% Tương tự, dung dịch chitosan ở nồng độ 2% và 1,5% có khảnăng ức chế sự nảy mầm của bào tử lần lượt với tỷ lệ là 100% và 80,4% Kếtquả chỉ ra rằng chitosan tiếp xúc trực tiếp với bào tử nấm làm cho chúng xuấthiện những dị tật, tế bào co lại và cuối cùng làm cho bào tử chết

Với mục tiêu nghiên cứu đánh giá đặc tính kháng nấm và vai trò củachitosan về khả năng phòng bệnh thán thư trên quả sau thu hoạch gây ra bởi

nấm Colletotrichum gloeosporioides được phân lập từ các mô bị nhiễm Năm

2008 nhóm tác giả Z Munoz, A Moret, S Garces đã đưa ra những kết luận về

việc phòng trừ nấm C gloeosporioides gây hại trên cà chua và nho Nồng độ

chitosan được khảo sát lần lượt là 0,0; 1,0; 1,5; 2; 2,5%, trong đó nồng độchitosan có khả năng ức chế 50% tốc độ phát triển của sợi nấm so với đối chứng

là 2,5% Dung dịch chitosan với nồng độ 1,0 và 2,5% cũng cho kết quả tốt khiứng dụng trực tiếp trên quả

Năm 2010, các tác giả Abd - AllA , M.A.1 và Wafaa M Haggag đã tiếnhành nghiên cứu sử dụng chitosan để ức chế tốc độ phát triển của sợi nấm và

chỉ ra rằng dung dịch chitosan với nồng độ 0,6mg/l làm giảm đáng kể sự pháttriển của sợi nấm và mức độ nảy mầm của bào tử Trong khi dung dịchchitosan với nồng độ 0,8mg/l lại có khả năng làm giảm và ức chế hoàn toàn

tốc độ phát triển của sợi nấm và bào tử Ở điều kiện in vivo dung dịch chitosan

với nồng độ 0,2 và 0,4% (w/v) có tác dụng hạn chế tỷ lệ mắc bệnh thán thư

Nhờ có khả năng hòa tan tốt trong nước do khối lượng phân tử thấp và sự

đặc điểm khác biệt này đã tạo ra nhiều hướng ứng dụng chitosan ở dạngoligochitosan, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp (kích thích sinh trưởng, bảo

vệ cây trồng)

Năm 2010, trong một nghiên cứu về khả năng kiểm soát các bệnh hại thựcvật, các tác giả Heng Yin, Xiaoming Zhao và Yuguang Du đã đưa ra kết luận rằngchitosan ở dạng oligochitosan như một dạng “vaccine” có khả năng kiểm soát cácbệnh hại thực vật

Năm 2011, các tác giả Ling-Yu Yang, Jian-Lei Zhang, Carole L Bassett vàXiang-Hong Meng đã nghiên cứu sử dụng chitosan và oligochitosan như là cáctác nhân kháng nấm tự nhiên để thay thế các loại hóa chất phòng trừ nấm tổnghợp nhằm kiểm soát các bệnh sau thu hoạch trên các loại trái cây, điển hình là khả

năng ức chế nấm Monilinia fructicola gây bệnh thối nâu trên quả đào Ở điều kiện

in vitro, chỉ tiêu nồng độ ức chế tối đa 50% đối với nấm Monilinia fructicola của

oligochitosan tốt hơn so với dung dịch chitosan ở cùng nồng độ

Oligochitosan là tác nhân sinh học nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính khángnấm phòng trừ bệnh thán thư luôn được quan tâm nghiên cứu nhằm hạn chế táchại của dư lượng các thuốc hóa học trong phòng trừ bệnh đến sức khỏe conngười Tuy vậy, việc sử dụng oligochitosan trong phòng trừ bệnh thán thư trênxoài vẫn chưa được nghiên cứu và công bố rộng rãi

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm ở nước ta đã có nhiều công bốnghiên cứu ứng dụng của chitosan, đặc biệt đã có nhiều nghiên cứu sử dụng trựctiếp chitosan ở dạng màng bao nhằm kéo dài thời gian bảo quản một số loại quả ,

Tuy nhiên, trong lĩnh vực nghiên cứu khả năng ức chế nấm C gloeosporioides gây

bệnh thán thư trên xoài chỉ dừng lại ở mức độ thử nghiệm chưa đầy đủ, và chưa đủcăn cứ để công bố trên các tạp chí chuyên ngành

Năm 2008, các tác giả Nguyễn Thị Bích Thủy, Nguyễn Thị Thu Nga và Đỗ

Thị Thu Thủy của trường Đại học Nông nghiệp I đã tiến hành nghiên cứu ảnhhưởng của nồng độ chitosan đến chất lượng và thời gian bảo quản chanh Quảchanh được xử lý bằng dung dịch chitosan với ba nồng độ (1,0%, 1,5% và

lý chitosan ở nồng độ 1,5% giữ được màu sắc đẹp nhất, có hao hụt khối lượng tựnhiên thấp và độ cứng ít biến đổi nhất

Với mục đích kéo dài thời gian bảo quản trái cam mật sau thu hoạch, năm

2011 nhóm tác giả Nguyễn Minh Thủy và Nguyễn Thị Mỹ Tuyền đã nghiên cứu

kỹ thuật bảo quản cam mật bằng phương pháp MAP Họ đã tiến hành phân tíchcác chỉ tiêu hóa học của cam mật (hàm lượng vitamin C, tổng chất khô hòa tan,hàm lượng acid cùng với các chỉ tiêu vật lý (màu sắc, độ dày vỏ) và tổn thất khốilượng trái Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể làm giảm tổn thất khối lượng củacam mật và kéo dài thời gian tồn trữ cam đến 9 tuần bằng biện pháp xử lý ozonekết hợp với bao màng chitosan, CMC (hoặc màng pectin) và bảo quản trong bao

bì PE (hoặc PP) không đục lỗ ở nhiệt độ 10oC

Năm 2011, nhóm các tác giả Nguyen Anh Dzung, Vo Thi Phuong Khanh

và Tran Trung Dzung đã nghiên cứu về tác động của chitosan và oligochitosanđến đặc điểm sinh lý, sự phát triển và khả năng chịu hạn của cây cà phê tại ViệtNam Khi sử dụng hai tác nhân này với nồng độ 0, 20, 40, 60 và 80 ppm để xử

lý trên lá cây cà phê thì kết cho thấy dung dịch oligochitosan nâng cao hàmlượng chlorophyll và carotenoid trong lá cây cà phê lê đến 46,38 – 73,51% sovới mẫu đối chứng trong nhà kính

Gần đây nhất, vào năm 2012 tác giả Lê Thiên Minh và cộng sự đã nghiêncứu ảnh hưởng của chế phẩm tạo màng sinh học chứa chitosan và nấm men đốikháng tới nấm mốc gây thối hỏng quả thanh long Nghiên cứu này nhằm đánh giátác dụng của chế phẩm tạo màng sinh học chứa chitosan và nấm men đối kháng

Candida sake TL1 để kiểm soát nấm mốc Penicillium và Aspergillus niger gây

thối hỏng quả thanh long trong quá trình bảo quản Nồng độ ức chế tối thiểu (EC)

của chitosan lên nấm mốc Penicillium và Aspergillus niger là 0,3% Chủng nấm

men Candida sake TL1 đối kháng phát triển tốt trên môi trường chứa 0,5%

phẩm nấm men đối kháng Candida sake TL1 kết hợp với 0,5% chitosan và 0,5%

Aspergillus niger với tỷ lệ thối hỏng tương ứng là 18% và 16%

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sử dụng chitosan và oligchitosan trong

kích thích sinh trưởng, tăng năng suất và phòng trừ bệnh đã được một số tác giảnghiên cứu có kết quả tốt trên một số cây trồng nông nghiệp như lúa, ngô, đậutương, lạc, cây hồ tiêu đen, bắp cải, su hào và một số loài hoa Bên cạnh đóchitosan hòa tan cũng cho thấy hiệu quả kháng các chủng bệnh phổ biến trên câycông nghiệp như bông, cao su, cây cà phê Các chế phẩm oligochitosan ở Việt

ngoài ra phương pháp cắt mạch bằng acid cũng được lựa chọn

Với tổng quan tình hình nghiên cứu như trên, vấn đề nghiên cứu sử dụng dung dịch chitosan và oligochitosan nguồn gốc tự nhiên, có khả năng phân hủy sinh học cao với các khoảng nồng độ khác nhau nhằm phòng trừ nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài, thay thế các phương pháp bảo quản xoài bằng các hóa chất tổng hợp gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao, giúp cho việc bảo quản các loại cây ăn quả nói chung và xoài sau thu hoạch nói riêng đảm bảo an toàn, phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của Việt Nam.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Chitosan

Chitosan dùng trong nghiên cứu được sản xuất tại Công ty TNHH xuấtnhập khẩu Đông Tiến, TP Hồ Chí Minh bằng phương pháp hoá học với cácthông số kỹ thuật như sau:

 Các chỉ tiêu cảm quan

- Trạng thái: Dạng bột

- Màu sắc: Màu vàng nhạt

- Mùi: Không mùi, không vị

- Độ tan: Không tan trong nước, trong dung dịch kiềm và các dung môi hữu

cơ, tan trong dung dịch acid loãng tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt

Chế phẩm oligochitosan trong nghiên cứu sử dụng trực tiếp dung dịchsau khi cắt mạch, từ đó tiến hành pha loãng đến các nồng độ theo yêu cầu.

30% để tiến hành thủy phân cắt mạch chitosan tạo ra dung dịch oligochitosan từchitosan thô, với các điều kiện phản ứng như sau: nhiệt độ: 45oC, thời gian: 180phút, nồng độ dung dịch: 5% Chitosan được hòa tan trong acid acetic 2% Bổsung dung dịch H2O2 30%, dung dịch được lắc liên tục để cắt mạch chitosan tạooligochitosan Sau đó điều chỉnh pH dung dịch phản ứng về môi trường kiềmnhẹ (pH = 7 – 8) nhằm kết tủa chitosan chưa bị cắt mạch Cuối cùng, tiến hànhpha loãng dung dịch vừa cắt mạch đến các nồng độ yêu cầu

2.1.3 Nguyên liệu quả

Mẫu xoài thí nghiệm được thu mua tại các chợ trên địa bàn thành phố Huế.Trong đó, những mẫu xoài có vết bệnh điển hình sử dụng cho quá trình phân lập

nấm Colletotrichum gloeosporioides thuộc giống xoài cát Hòa Lộc và xoài cát

Chu, mẫu xoài cho các thí nghiệm khác thuộc giống xoài cát Hòa Lộc Đây làhai giống xoài được trồng phổ biến ở nhiều tỉnh của nước ta bao gồm: ĐồngTháp, Cần Thơ, Vĩnh Long, Bến Tre, Đồng Nai,

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập nấm thán thư hại xoài và giám định bằng hình thái Hình tháinấm được giám định bằng phương pháp:

+ Quan sát hình thái, màu sắc của sợi nấm

+ Quan sát hình thái bào tử nấm

+ Giám định bằng phương pháp sinh học phân tử

- Đánh giá ảnh hưởng của chitosan và oligochitosan đến bệnh thán thư

hại xoài ở điều kiện in vitro

- Đánh giá ảnh hưởng của chitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở điều

kiện in vivo.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu nấm bệnh

Mẫu bệnh được thu từ những quả xoài có triệu chứng vết bệnh ban đầu đếnnhững quả có vết bệnh điển hình Mẫu xoài bệnh được gói riêng trong túi PE vàghi các thông tin cần thiết (địa điểm, tên giống, ngày tháng thu mẫu…)

26

Hình 2.1 Mẫu xoài bệnh tại nơi được thu thập 2.3.2 Phương pháp phân lập và giám định nấm Colletotrichum gloeosporioides

Phương pháp phân lập và giám định nấm Colletotrichum gloeosporioides

được tiến hành theo quy trình sau:

Dùng tăm vô trùng chấm vào mô bệnh

Hình 2.2 Quy trình phân lập và giám định nấm từ mẫu bệnh

(*) Các môi trường PDA được chuẩn bị theo [Phụ lục 1]

Thuyết minh quy trình

- Khử trùng và ủ mẫu bệnh

+ Sau khi được đưa về phòng thí nghiệm thì mẫu được rửa dưới vòi nướcsạch để loại tạp chất và bụi bẩn bám trên bề mặt Tiếp theo khử trùng mẫu bằngcồn 70o sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng

+ Đặt mẫu quả có vết bệnh điển hình trên giấy vô trùng, đưa vào khay nhựa

trường ẩm Sau đó dùng túi nilon bọc khay nhựa lại và ủ mẫu ở nhiệt độ khoảng(25oC – 28oC) trong điều kiện có ánh sáng để kích thích sự sinh bào tử nấm, theodõi sự sinh bào tử trên mẫu Sau khoảng 2 – 4 ngày quan sát khi thấy có xuất hiện

bào tử, làm tiêu bản để giám định bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides gây

bệnh thán thư trên xoài, sau khi giám định sơ bộ ta tiến hành phân lập nấm trên môi

Cấy truyền sang môi trường 1/5 PDAQuan sát bào tử dưới kính hiển vi, giám định nấmLàm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử

Giám định lại dưới kính hiển vi

Giữ mẫu

Gửi mẫu định danh

28oC trong thời gian khoảng từ 2 – 4 ngày.

- Cấy truyền

Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày, đánh giá sự phát triển của sợi nấm tại vị trícấy Cấy truyền khi sợi nấm mọc được khoảng 5mm từ vị trí cấy Cắt một miếngthạch (2 × 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang môi trường 1/5 PDA

- Làm thuần

Giai đoạn cuối cùng trong việc giám định nấm gây bệnh là việc làm thuầnmẫu nấm Chỉ một bào tử hoặc một đỉnh sinh trưởng của sợi nấm được cấy sangmôi trường sạch để đảm bảo nấm được cấy là hoàn toàn thuần bằng phươngpháp cấy đơn bào tử [Phụ lục 2]

- Giám định nấm bằng kính hiển vi

Khi tản nấm đã xuất hiện bào tử thì tiến hành làm tiêu bản quan sát hìnhthái sợi nấm và bào tử nấm ở vật kính 10 và 40 Khi kết quả giám định đúng vớinấm đã phân lập Ttiến hành chụp hình và giữ mẫu ở tủ 4oC

- Định danh ở cấp độ loài bằng phương pháp sinh học phân tử.

2.3.3 Bố trí thí nghiệm

2.3.3.1 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian nảy mầm của bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides trong phòng thí nghiệm

Trên đĩa môi trường đã cấy nấm Colletotrichum gloeosporioides đặt trong tủ

ấm 28oC, sau 7 ngày ta tiến hành thu bào tử vào eppendorf, nuôi và giữ bào tử trong

tủ ấm Cứ sau 1 h lấy 2µl bào tử từ eppendorf làm tiêu bản và quan sát dưới kính

hiển vi để xác định thời gian nảy mầm của bào tử Colletotrichum gloeosporioides

2.3.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh của Colletotrichum gloeosporioides bằng lây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm

Colletotrichum gloeosporioides được nuôi cấy trên môi trường 1/5 PDA.

bào tử C gloeosporioides vào eppendorf.

Thử khả năng gây bệnh trên quả xoài sau thu hoạch ở các nồng độ bào tử: 100

bào tử/ml, 103 bào tử/ml, 104 bào tử/ml và 105 bào tử/ml

Nồng độ bào tử được xác định bằng buồng đếm hồng cầu [Phụ lục 3]

Thí nghiệm được tiến hành với 4 công thức (CT) và 3 lần lặp lại Mỗi quảlây 10 vết, đồng đều ở tất cả các quả

Mẫu xoài lành bệnh được mua về rửa sạch bằng nước, sau đó khử trùngbằng cồn 70o và rửa lại bằng nước cất vô trùng

Đặt mẫu quả trên giấy vô trùng, đưa vào khay nhựa đã khử trùng bằng cồn

70o Cho nước cất vô trùng vào giấy vô trùng để tạo môi trường ẩm

Tiến hành lây 10 vết bệnh giống nhau trên mỗi quả Sau đó dùng túi nilonbọc khay nhựa lại và ủ mẫu ở nhiệt độ 28oC

Sau khoảng 1 đến 2 ngày khi vết bệnh bắt đầu hình thành, tiến hành theodõi thời gian hình thành vết bệnh và đo đường kính các vết bệnh

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh Colletotrichum

gloeosporioides trên quả xoài

Công thức Nồng độ bào tử C gloeosporioides (bào tử/ml)

IV 105

Các chỉ tiêu theo dõi

- Thời gian hình thành vết bệnh (h)

- Tốc độ phát triển và đường kính các vết bệnh (cm)

- Theo dõi tỷ lệ bệnh (TLB) ở các công thức TLB của nhóm bệnh được

tính theo công thức sau:

AUDPC: Đường cong tiến triển chung của bệnh

yi, yi + 1: tỷ lệ bệnh trong lần theo dõi thứ i và thứ i +1

ti, ti + 1: thời gian theo dõi bệnh ở lần thứ i và thứ i +1 (h)

n: tổng số lần theo dõi bệnh

2.3.3.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở điều kiện in vitro

 Bố trí thí nghiệm trên môi trường lỏng ½ PDA

Ở bước nghiên cứu này, tiến hành thí nghiệm sử dụng dung dịch chitosanvới các khoảng nồng độ khác nhau để khảo sát khả năng ức chế nấm

Colletotrichum gloeosporioides trên môi trường lỏng ½ PDA.

Dung dịch chitosan khảo sát bao gồm các nồng độ: 0,25%, 0,5%, 0,75% và1%, được tạo ra bằng cách hòa tan hoàn toàn bột chitosan trong dung dịch acidacetic 0,5%, sau đó điều chỉnh dung dịch đến pH = 5,6 bằng dung dịch NaOH1M Tween 80 được bổ sung vào dung dịch chitosan với tỷ lệ 0,1ml Tween 80trong 100ml dung dịch chitosan

Đánh giá ảnh hưởng của dung dịch chitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở

điều kiện in vitro được bố trí thí nghiệm với 5 công thức, 3 lần lặp lại Trong đó,

Số vết bị bệnhTổng số vết bệnh

được lây