gloeosporioides
Phương pháp phân lập và giám định nấm Colletotrichum gloeosporioides
được tiến hành theo quy trình sau:
Quy trình phân lập
Ủ ở nhiệt độ 28oC từ 2 - 4 ngày Mẫu quả bệnh
Khử trùng bằng cồn 70o
Ủ mẫu
Dùng tăm vô trùng chấm vào mô bệnh
Hình 2.2. Quy trình phân lập và giám định nấm từ mẫu bệnh
(*) Các môi trường PDA được chuẩn bị theo [Phụ lục 1]
Thuyết minh quy trình
- Khử trùng và ủ mẫu bệnh
+ Sau khi được đưa về phòng thí nghiệm thì mẫu được rửa dưới vòi nước sạch để loại tạp chất và bụi bẩn bám trên bề mặt. Tiếp theo khử trùng mẫu bằng cồn 70o sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng.
+ Đặt mẫu quả có vết bệnh điển hình trên giấy vô trùng, đưa vào khay nhựa đã khử trùng bằng cồn 70o, cho nước cất vô trùng vào giấy vô trùng để tạo môi trường ẩm. Sau đó dùng túi nilon bọc khay nhựa lại và ủ mẫu ở nhiệt độ khoảng (25oC – 28oC) trong điều kiện có ánh sáng để kích thích sự sinh bào tử nấm, theo dõi sự sinh bào tử trên mẫu. Sau khoảng 2 – 4 ngày quan sát khi thấy có xuất hiện bào tử, làm tiêu bản để giám định bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài, sau khi giám định sơ bộ ta tiến hành phân lập nấm trên môi
Cấy truyền sang môi trường 1/5 PDA
Quan sát bào tử dưới kính hiển vi, giám định nấm
Làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử
Giám định lại dưới kính hiển vi
Giữ mẫu
Gửi mẫu định danh
trường thích hợp .
Hình 2.3. Giữ ẩm mẫu để phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides gây hại
trên xoài - Phân lập nấm
Khi quan sát thấy có bào tử nấm xuất hiện trên vết bệnh đã ủ thì tiến hành phân lập nấm bằng cách dùng tăm vô trùng chấm vào mô bệnh rồi cấy lên đĩa môi trường chọn lọc ½ PDA. Các đĩa môi trường phân lập được ủ ở nhiệt độ 28oC trong thời gian khoảng từ 2 – 4 ngày.
- Cấy truyền
Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày, đánh giá sự phát triển của sợi nấm tại vị trí cấy. Cấy truyền khi sợi nấm mọc được khoảng 5mm từ vị trí cấy. Cắt một miếng thạch (2 × 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang môi trường 1/5 PDA .
- Làm thuần
Giai đoạn cuối cùng trong việc giám định nấm gây bệnh là việc làm thuần mẫu nấm. Chỉ một bào tử hoặc một đỉnh sinh trưởng của sợi nấm được cấy sang môi trường sạch để đảm bảo nấm được cấy là hoàn toàn thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử [Phụ lục 2] .
- Giám định nấm bằng kính hiển vi
Khi tản nấm đã xuất hiện bào tử thì tiến hành làm tiêu bản quan sát hình thái sợi nấm và bào tử nấm ở vật kính 10 và 40. Khi kết quả giám định đúng với nấm đã phân lập. Ttiến hành chụp hình và giữ mẫu ở tủ 4oC.
- Định danh ở cấp độ loài bằng phương pháp sinh học phân tử.
2.3.3. Bố trí thí nghiệm