3.1.1. Kết quả phân lập, tuyển chọn và giám định bằng hình thái
Sau khi tiến hành thu thập, phân lập nấm thán thư trên một số mẫu xoài có vết bệnh điển hình thuộc hai giống xoài (xoài cát Hòa Lộc và xoài cát Chu) trên môi trường ½ PDA và 1/5 PDA .
Kết quả thu được gồm 6 chủng nấm, trong đó 2 chủng được phân lập từ xoài cát Chu (N1, N2) và 4 chủng được phân lập từ xoài cát Hòa Lộc (T1, T2, T3, T4). Các chủng nấm này được tiến hành quan sát đại thể và vi thể, so sánh với đặc điểm của chủng nấm Colletotrichum gloeosporioides theo nghiên cứu của tác giả Vũ Triệu Mân .
Qua quan sát các chủng N1, N2, T1, T2, T3, T4 nhận thấy chủng T2 có những đặc điểm giống với chủng Colletotrichum gloeosporioides, đặc điểm đại thể và vi thể của chủng T2 như sau:
- Đặc điểm đại thể: Tản nấm trên môi trường ½ PDA và 1/5 PDA có màu trắng xám đến xám đậm, tuy nhiên trên môi trường 1/5 PDA tản nấm mọc thưa và yếu hơn trên môi trường 1/2 PDA. Sợi nấm phân nhánh, đa bào, khối bào tử có màu hồng nhạt.
- Đặc điểm vi thể: Bào tử nấm chủng T2 là bào tử phân sinh hình trụ với các đầu hơi tù, đôi khi hơi nhọn, đỉnh tròn, cuống hẹp, trong suốt, không có vách ngăn, hình thành trên các bào tử phân sinh hình trụ trong.
Qua quan sát đặc điểm đại thể và vi thể, chúng tôi nhận thấy chủng T2 phù hợp với mô tả của nấm Colletotrichum gloeosporioides theo nghiên cứu của tác giả Vũ Triệu Mân. Hình ảnh của chủng nấm T2 được thể hiện trong hình 3.1.
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3.1. Hình ảnh đại thể và vi thể của chủng nấm T2
(a) Mẫu xoài có vết bệnh điển hình
(b) Tản nấm Colletotrichum gloeosporioides trên môi trường ½ PDA (c) Cành bào tử phân sinh
(d) Bào tử phân sinh
3.1.2. Kết quả định danh nấm Colletotrichum gloeosporioides ở cấp độ loài
Chủng nấm T2 được định danh bằng phương pháp giải trình tự một phần gen mã hóa cho tiểu phần ribosome 28S, kết quả thể hiện ở hình 3.2.
Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA và so sánh mức độ tương đồng giữa các đoạn gen với dữ liệu đã công bố trong ngân hàng gen thông qua chương trình BLAST SEARCH cho thấy trình tự gen của chủng T2 tương đồng 100% với chủng Colletotrichum gloeosporioides RP262 (hình 3.3). Qua đó, xác định được chủng T2 thuộc loài Colletotrichum gloeosporioides. Chúng tôi gọi chủng này là Colletotrichum gloeosporioides T2.
Hình 3.3. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng định danh T2 trong
ngân hàng gen
3.2. Xác định thời gian nảy mầm của bào tử Colletotrichum gloeosporioides
Sau khi thu bào tử vào eppendorf tiến hành ủ trong tủ ấm ở 28oC, sau mỗi giờ lấy ra 2μl từ mỗi eppendorf làm tiêu bản xác định thời gian nảy mầm của bào tử nấm C. gloeosporioides T2. Kết quả cho thấy sau 5 giờ kiểm tra liên tục bào tử nấm C. gloeosporioides T2đã nảy mầm (hình 3.4). Từ đó ta có thể xác định được thời gian nảy mầm của nấm C. gloeosporioides là sau 5 giờ.
(a) (b)
Hình 3.4. Bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides T2
3.3. Xác định ngưỡng gây bệnh của Colletotrichum gloeosporioides bằng lâybệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm
Colletotrichum gloeosporioides là một loại nấm có phổ ký chủ lớn, gây hại làm ảnh hưởng lớn đến kinh tế và phát triển thuận lợi trong điều kiện nóng ẩm. Tuy nhiên, chúng không hoàn toàn phát sinh phát triển mạnh ở bất cứ điều kiện nào mà cần một ngưỡng gây bệnh phù hợp. Khi tập hợp đủ các yếu tố gây bệnh (ký sinh, ký chủ và điều kiện ngoại cảnh) thì quả sẽ bị bệnh. Do vậy chúng tôi tiến hành lây bệnh nhân tạo để xác định ngưỡng gây bệnh của nấm C. gloeosporioides T2.
Xác định ngưỡng gây bệnh trên xoài sau thu hoạch bằng cách lây bệnh nhân tạo trên quả với các nồng độ bào tử khác nhau.
Qua khảo sát bước đầu cho thấy kết quả sau 96h lây bệnh nhân tạo ở mức bào tử 106 bào tử/ml vết bệnh có tốc độ phát triển mãnh liệt không thể kiểm soát được đường kính. Cũng sau 96h lây bệnh ở mức 102 bào tử/ml khả năng phát triển của vết bệnh chậm và biểu hiện không rõ ràng. Bố trí thí nghiệm với 3 công thức: Công thức (I) lây bệnh ở mức bào tử 103 bào tử/ml, công thức (II) lây bệnh ở mức bào tử 104 bào tử/ml, công thức (III) lây bệnh ở mức bào tử 105 bào tử/ml.
Lây bệnh nhân tạo trên xoài với 10 vết bệnh đều nhau trên mỗi quả, sau khi lây bệnh tiến hành theo dõi, đo đường kính các vết bệnh được lây.
Kết quả xác định tỷ lệ bệnh và sự phát triển của vết bệnh trên xoài ở các nồng độ bào tử khác nhau được thể hiện ở bảng 3.1 và 3.2.
Bảng 3.1. Tỷ lệ bệnh ở các nồng độ bào tử khác nhau trên xoài (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Công thức (bào tử/ml) Tỷ lệ bệnh (%) 48h 72h 0 (ĐC) 00 00 103 43 100 104 67 100 105 87 100 Qua bảng 3.1 nhận thấy:
Tương ứng với các nồng độ bào tử lây bệnh khác nhau thì tỷ lệ bệnh hình thành trên xoài cũng khác nhau. Ở công thức đối chứng (ĐC) với nồng độ bào tử được lây là 0 (bào tử/ml), nghĩa là chỉ tiến hành xử lý mẫu bằng nước cất vô trùng. Sau khi kết thúc thời gian khảo sát vết bệnh vẫn không hình thành. Trong khi đó, với các công thức I (103 bào tử/ml), công thức II (104 bào tử/ml), công
thức III (105 bào tử/ml) thì sau 48h các vết bệnh đã hình thành với tỷ lệ tăng dần theo chiều tăng của nồng độ bào tử được lây bệnh, công thức I tỷ lệ bệnh thấp nhất chiếm 43%, tiếp đến là công thức II với tỷ lệ bệnh 67% và công thức III tỷ lệ bệnh xuất hiện cao nhất với 87%. Sau 72 h tất cả các vết bệnh đều hình thành ở các nồng độ bào tử được lây bệnh. Các ngưỡng gây bệnh của nấm
Colletotrichum gloeosporioides T2 trên xoài bằng lây bệnh nhân tạo được thể hiện ở hình 3.5.
0bào tử/ml 103 bào tử/ml 104 bào tử/ml 105 bào tử/ml
Hình 3.5. Các ngưỡng gây bệnh của nấm Colletotrichum gloeosporioides T2
trên xoài bằng lây bệnh nhân tạo sau 96h
Bảng 3.2. Sự phát triển của vết bệnh trên xoài ở các mức bào tử khác nhau
Công thức (bào tử/ml) Đường kính vết bệnh (cm) AUDPC
72h 96h 120h
0 (ĐC) 0,00d 0,00d 0,00d 0,00d
103 0,23c 0,62c 1,13c 31,27c
104 0,42b 0,93b 1,54b 45,68 b
105 0,49a 1,13a 1,84a 55,26a
Ghi chú: Các giá trị trung bình đường kính vết bệnh theo cột có cùng chữ cái in thường là không sai khác ở mức ý nghĩa α = 0,05
Từ bảng 3.2 cho thấy, ở các thời điểm khác nhau (72h, 96h và 120h) đường kính vết bệnh và mức độ phát triển bệnh được xác định theo đường cong tiến triển bệnh AUDPC tăng dần theo nồng độ bào tử gây bệnh. Kết quả xử lý cho thấy giữa các công thức thí nghiệm giá trị trung bình đường kính vết bệnh đều sai khác có ý nghĩa thống kê (α = 0,05). Công thức IV với mức bào tử 105 bào
tử/ml có khả năng gây bệnh trên xoài lớn nhất, đường kính vết bệnh tại thời điểm 120h là 1,84cm lớn hơn ở mức nồng độ 104 bào tử/ml là 1,54cm và 103 bào tử/ml là 1,13cm.
Sau quá trình theo dõi sự phát triển của đường kính vết bệnh ở các công thức với các mức bào tử khác nhau thì khả năng gây bệnh cũng khác nhau, ở mức bào tử 105 là mức có khả năng gây bệnh lớn nhất do có lượng bào tử lớn nhất nên vết bệnh có khả năng phát sinh, phát triển nhiều hơn nhanh hơn, tiếp đến là mức bào tử 104 và mức 103. Nồng độ bào tử 105 bào tử/ml được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4. Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 củachitosan và oligochitosan ở điều kiện in vitro chitosan và oligochitosan ở điều kiện in vitro
Với mục đích thử nghiệm chọn ra nồng độ chitosan và oligochitosan thích hợp nhằm đánh giá khả năng ức chế đối với nấm Colletotrichum gloeosporioides
T2. Trên cơ sở tham khảo các tài liệu , và các khảo nghiệm bước đầu, tiến hành khảo sát các dung dịch chitosan trong khoảng nồng độ 0,25% – 1,0% (bước nhảy 0,25%). Đối với dung dịch oligochitosan quá trình khảo sát bước đầu được thực hiện ở khoảng nồng độ 0,02% - 0,3%.
3.4.1. Ảnh hưởng của chitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở điều kiện in vitro
Ở bước nghiên cứu này, tiến hành thí nghiệm sử dụng dung dịch chitosan với các nồng độ khác nhau để khảo sát khả năng ức chế nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 trên môi trường lỏng ½ PDA và môi trường đặc 1/5 PDA.
Đánh giá ảnh hưởng của chitosan đến bệnh thán thư hại xoài thí nghiệm bố trí với 5 công thức (CT) ở các nồng độ chitosan tương ứng: CT I (0,0%), CT II (0,25%), CT III (0,5%), CT IV (0,75%) và CT V (1,0%).
3.4.1.1. Kết quả thí nghiệm trên môi trường lỏng ½ PDA
Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường lỏng ½ PDA, sau 96h nuôi cấy tiến hành thu sinh khối sợi nấm và xác định các chỉ tiêu thí nghiệm. Kết quả đánh giá được thể hiện qua hình 3.6 và 3.7 và [Phụ lục 4]
Hình 3.6. Ảnh hưởng của chitosan đến sinh khối sợi nấm Colletotrichum
gloeosporioides T2 sau 96h nuôi cấy
0,0% (ĐC) 0,25% 0,5%
0,75% 1,0% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.7. Nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 nuôi cấy trên môi trường ½
PDA lỏng với các nồng độ chitosan khác nhau sau 96h nuôi cấy
Nồng độ (%) Sinh khối tươi, khô (g)
Từ hình 3.6 cho thấy:
- Sau 96h nuôi cấy, đối với sinh khối tươi của nấm C. gloeosporioides T2 giữa các công thức thí nghiệm đều sai khác có ý nghĩa thống kê. Ở các công thức có xử lý chitosan thì sinh khối tươi và sinh khối khô của tản nấm C. gloeosporioides T2 thấp hơn so với công thức không xử lý chitosan (nồng độ 0,0%). Điều này chứng tỏ nấm C. gloeosporioides T2 bị ức chế đáng kể bởi chitosan ở các nồng độ.
- Các nồng độ chitosan khác nhau thì khả năng tác động đến sự phát triển của nấm C. gloeosporioides T2 cũng khác nhau. Sau 96h nuôi cấy, khối lượng sinh khối tươi giảm dần khi nồng độ chitosan tăng dần. Ở nồng độ 1,0% sinh khối tươi giảm mạnh nhất, từ 0,428g giảm xuống còn 0,061g. Hiệu lực ức chế của chitosan đến sinh khối sợi nấm C. gloeosporioides T2 tăng theo chiều tăng nồng độ chitosan sử dụng. Trong đó, hiệu lực ức chế thấp nhất ở nồng độ 0,25% tương ứng với sinh khối tươi là 55,14% và sinh khối khô là 53,98%, cao nhất ở nồng độ 1,0% tương ứng 85,75% đối với sinh khối tươi và 90,27% ở sinh khối khô. Đặc biệt, đối với sinh khối khô nồng độ ức chế tối thiểu 90% (EC90 – Effective concentration by 90%) là 90,27% ở nồng độ 1,0% [Phụ lục 4].
- Sau 96h nuôi cấy, kết quả xử lý số liệu cho thấy không có sự sai khác sinh khối khô giữa CT II (0,25%), CT III (0,5%) và giữa các CT III (0,5%), CT IV (0,75%), CT V (1,0%). Như vậy, khả năng ức chế tốt nhất tương ứng nồng độ chitosan 0,75% (CT IV) với khối lượng sinh khối khô thu được là 0,013g, giảm gần 9 lần so với mẫu đối chứng (0,113g) [Phụ lục 4].
Các kết quả trên cho thấy chitosan trong khoảng nồng độ 0,25 – 1,0% có khả năng ức chế đáng kể đến sự phát triển của nấm C. gloeosporioides T2. Điều này có thể giải thích do chitosan có nồng độ càng cao thì số nhóm NH3+ trong một đơn vịdung dịch càng lớn, có khả năng trung hòa các điện tích âm trên bề mặt tế bào nấm càng mạnh và làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Đây chính là nguyên nhân làm cho màng tế bào nấm mất điện tích và gây nên hiện tượng rò rỉ các vật chất bên trong, ức chế sự phát triển của nấm C. gloeosporioides T2.
3.4.1.2. Kết quả thí nghiệm trên môi trường đặc 1/5 PDA
Các nồng độ chitosan được khảo sát tương tự như các nồng độ đã tiến hành thí nghiệm trên môi trường lỏng ½ PDA. Kết quả xác định đường kính và mức độ ảnh hưởng của chitosan ở các nồng độ khác nhau đến sự phát triển của nấm
0,0% (ĐC) 0,25% 0,5%
0,75% 1,0%
Hình 3.8. Ảnh hưởng của chitosan với các nồng độ khác nhau đến tốc độ phát
triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides T2 sau 240h nuôi cấy
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chitosan đến đường kính tản nấm Colletotrichum
gloeosporioides T2 Công thức (%) Đường kính tản nấm (cm) PIRG (%) 192h AUDPC 48h 96h 144h 192h 240h 0,0(Đ/C) 1,52a 2,83a 4,43a 6,46a 7,56a 0,0 876,4a 0,25 0,94b 1,74b 3,25b 4,78b 6,06b 26,00 637,0b 0,5 0,87c 1,38c 2,76c 4,33c 5,38c 32,79 556,4c 0,75 0,71d 1,24d 2,35d 4,08d 5,07d 36,84 507,0d 1,0 0,63e 1,15d 2,33d 3,75e 4.89e 41,95 474,0e
Ghi chú: Các giá trị trung bình đường kính tản nấm theo cột có cùng chữ cái in thường là không sai khác ở mức ý nghĩa α = 0,05
Từ kết quả nghiên cứu ở bảng 3.3 cho thấy:
tương ứng tại các thời điểm khác nhau đều giảm đáng kể so với mẫu đối chứng. - Sau 48h, 192h và 240h đường kính tản nấm trung bình ở các công thức thí nghiệm đều sai khác có ý nghĩa thống kê. Đường kính tản nấm C. gloeosporioides T2 giảm dần tương ứng với nồng độ dung dịch chitosan xử lý tăng dần. Tốc độ phát triển đường kính tản nấm C. gloeosporioides T2 giảm mạnh nhất ở mẫu xử lý chitosan với nồng độ 1,0%. Ở các mẫu này, sau 192h nuôi cấy đường kính tản nấm giảm mạnh nhất (khoảng 2 lần) từ 6,46cm CT I (0,0%) xuống còn 3,75cm CT V (1,0%). Cũng tại thời điểm 192h ở CT II (0,25%) và CT III (0,5%) thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của nấm C. gloeosporioides T2, tuy nhiên mức độ ảnh hưởng kém hơn so với CT IV (0,75%) và CT V (1,0%). Trong khi đó tại thời điểm 240h khả năng ức chế nấm
C. gloeosporioides T2 của chitosan kém hơn ở 192h, đường kính tản nấm giảm khoảng 1,5 lần từ 7,5cm CT I (0,0%) đến 4,89cm CT V (1,0%).
- Ở 96h và 144h khả năng ảnh hưởng của chitosan đến sự phát triển của đường kính tản nấm C. gloeosporioides T2 là không sai khác có ý nghĩa thống kê ở cả hai công thức IV (0,75%) và CT V (1,0%) tương ứng với đường kính tản nấm lần lượt: tại 96h: IV (0,75%) là 1,24cm và CT V (1,0%) là 1,15; tại 144h: IV (0,75%) là 2,35cm và CT V (1,0%) là 2,33.
- Cũng từ kết quả bảng 3.4 cho thấy, giá trị trung bình AUDPC giữa các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Giá trị này giảm khá mạnh khi nồng độ chitosan sử dụng tăng dần. Ở công thức ĐC giá trị này là 876,4 sau đó giảm dần và giảm thấp nhất ở CT V (1,0%) với diện tích tương ứng 474,0.
- Hiệu lực ức chế sự phát triển nấm C. gloeosporioides T2 tăng theo nồng độ chitosan, hiệu lực ức chế cao nhất ở nồng độ 1,0% và thấp nhất ở nồng độ 0,25% tương ứng với giá trị PIRG lần lượt là 41,95% và 26,0%.
Như vậy, dung dịch chitosan trong khoảng nồng độ từ 0,25% – 0,5% mẫu xử lý chitosan có nồng độ càng cao thì tốc độ phát triển đường kính tản nấm C. gloeosporioides T2 càng giảm. Trong khoảng nồng độ 0,75% – 1,0% dung dịch chitosan cũng có khả năng ức chế tương tự, tuy nhiên tại thời điểm 96h và 144h không sai khác có ý nghĩa thống kê.
Các kết quả trên cho thấy chitosan đã ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm C. gloeosporioides T2 và cơ chế tác động này có thể được giải thích tương tự như ở phần 3.4.1.1.
kháng nấm của chitosan đến nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense gây bệnh héo rũ trên chuối cho thấy: Ở điều kiện in vitro tất cả các nồng độ chitosan thử nghiệm (0,1; 0,2; 0,4; 0,8 và 1,6%) đều có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm
Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Tuy nhiên, hiệu lực ức chế phát triển nấm
Fusarium oxysporum f. sp. cubense là 76,36% (PIRG %) ở nồng độ 8mg/ml (tương ứng với dung dịch chitosan 0,8%) và khả năng ức chế của chitosan đến nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense tăng dần theo nồng độ chitosan sử dụng. Tuy nhiên, với nồng độ chitosan sử dụng 0,8% hiệu lực ức chế nấm
Fusarium oxysporum f. sp. cubense đạt 76,36% trong khi đó nồng độ chitosan sử dụng cao hơn (1,0%) nhưng hiệu lực ức chế chỉ đạt 41,95% (bảng 3.3) .
Trong nghiên cứu đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư do nấm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});