1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Do có những đặc tính sinh học đặc biệt, thân thiện với môi trường, chitosan và oligochitosan đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu về khả năng kháng nấm bệnh trên rau quả, đặc biệt là trên đối tượng xoài sau thu hoạch.
Năm 2003, nhóm các tác giả S. Bautista-Bãnosa, M. Hernández - Lópeza, E. Bosquez-Molina, C.L. Wilson đã đưa ra kết luận về khả năng kháng nấm C. gloeosporioides gây bệnh thán thư trên cây đu đủ dựa trên sự kết hợp giữa chitosan và các dịch chiết từ lá mãng cầu, lá và hạt đu đủ. Sự kết hợp giữa chitosan và các chất chiết từ thực vật cho hiệu quả kháng nấm C. gloeosporioides
cao hơn trong trường hợp chỉ sử dụng từng tác nhân đơn lẻ. Dung dịch chitosan ở mức nồng độ 2,0% và 3,0% có tác dụng ức chế nấm trong khi đó các chất chiết xuất từ thực vật khả năng kháng nấm chưa thể hiện rõ, điều đặc biệt là khi có sự kết hợp giữa chitosan và dịch chiết từ thực vật thì dung dịch chitosan chỉ với mức nồng độ 2,5% thì tác dụng kháng nấm thể hiện rất rõ rệt .
Năm 2005, trong nghiên cứu của Hernández – López và cộng sự đã cho thấy ảnh hưởng của chitosan với các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0; 1,5 và 2%) đến sự phát triển của hai chủng nấm C. gloeosporioides được phân lập trên mẫu đu đủ bị nhiễm bệnh từ các tiểu bang Veracruz và Guerrero thuộc Mexico ở điều kiện in vitro .
Cũng trên đối tượng đu đủ, vào năm 2006 tác giả Asgar Ali cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan đến khả năng phát triển của sợi nấm và mức độ gây tổn thương bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2%. Kết quả cho thấy rằng tốc độ sinh trưởng của sợi nấm đều giảm đáng kể ở tất cả các nồng độ chitosan được khảo sát so với đối chứng. Tác giả cũng chỉ ra rằng nồng độ chitosan có khả năng ức chế tối đa (100%) sự phát triển của sợi nấm là 2%. Tương tự, dung dịch chitosan ở nồng độ 2% và 1,5% có khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử lần lượt với tỷ lệ là 100% và 80,4%. Kết quả chỉ ra rằng chitosan tiếp xúc trực tiếp với bào tử nấm làm cho chúng xuất hiện những dị tật, tế bào co lại và cuối cùng làm cho bào tử chết .
Với mục tiêu nghiên cứu đánh giá đặc tính kháng nấm và vai trò của chitosan về khả năng phòng bệnh thán thư trên quả sau thu hoạch gây ra bởi nấm Colletotrichum gloeosporioides được phân lập từ các mô bị nhiễm. Năm 2008 nhóm tác giả Z. Munoz, A. Moret, S. Garces đã đưa ra những kết luận về việc phòng trừ nấm C. gloeosporioides gây hại trên cà chua và nho. Nồng độ chitosan được khảo sát lần lượt là 0,0; 1,0; 1,5; 2; 2,5%, trong đó nồng độ chitosan có khả năng ức chế 50% tốc độ phát triển của sợi nấm so với đối chứng là 2,5%. Dung dịch chitosan với nồng độ 1,0 và 2,5% cũng cho kết quả tốt khi ứng dụng trực tiếp trên quả .
Năm 2010, các tác giả Abd - AllA , M.A.1 và Wafaa M. Haggag đã tiến hành nghiên cứu sử dụng chitosan để ức chế tốc độ phát triển của sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử nấm C. gloeosporioides ở điều kiện in vitro. Kết quả đã
chỉ ra rằng dung dịch chitosan với nồng độ 0,6mg/l làm giảm đáng kể sự phát triển của sợi nấm và mức độ nảy mầm của bào tử. Trong khi dung dịch chitosan với nồng độ 0,8mg/l lại có khả năng làm giảm và ức chế hoàn toàn tốc độ phát triển của sợi nấm và bào tử. Ở điều kiện in vivo dung dịch chitosan với nồng độ 0,2 và 0,4% (w/v) có tác dụng hạn chế tỷ lệ mắc bệnh thán thư trên xoài tương ứng là 89,30% và 95,0% sau 30 ngày bảo quản ở 10oC .
Nhờ có khả năng hòa tan tốt trong nước do khối lượng phân tử thấp và sự có mặt của các nhóm NH2 tự do có trong các mắt xích D-glucosamine. Chính đặc điểm khác biệt này đã tạo ra nhiều hướng ứng dụng chitosan ở dạng oligochitosan, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp (kích thích sinh trưởng, bảo vệ cây trồng) .
Năm 2010, trong một nghiên cứu về khả năng kiểm soát các bệnh hại thực vật, các tác giả Heng Yin, Xiaoming Zhao và Yuguang Du đã đưa ra kết luận rằng chitosan ở dạng oligochitosan như một dạng “vaccine” có khả năng kiểm soát các bệnh hại thực vật .
Năm 2011, các tác giả Ling-Yu Yang, Jian-Lei Zhang, Carole L. Bassett và Xiang-Hong Meng đã nghiên cứu sử dụng chitosan và oligochitosan như là các tác nhân kháng nấm tự nhiên để thay thế các loại hóa chất phòng trừ nấm tổng hợp nhằm kiểm soát các bệnh sau thu hoạch trên các loại trái cây, điển hình là khả năng ức chế nấm Monilinia fructicola gây bệnh thối nâu trên quả đào. Ở điều kiện
in vitro, chỉ tiêu nồng độ ức chế tối đa 50% đối với nấm Monilinia fructicola của oligochitosan tốt hơn so với dung dịch chitosan ở cùng nồng độ .
Oligochitosan là tác nhân sinh học nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính kháng nấm phòng trừ bệnh thán thư luôn được quan tâm nghiên cứu nhằm hạn chế tác hại của dư lượng các thuốc hóa học trong phòng trừ bệnh đến sức khỏe con người. Tuy vậy, việc sử dụng oligochitosan trong phòng trừ bệnh thán thư trên xoài vẫn chưa được nghiên cứu và công bố rộng rãi.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Hiện nay, trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm ở nước ta đã có nhiều công bố nghiên cứu ứng dụng của chitosan, đặc biệt đã có nhiều nghiên cứu sử dụng trực tiếp chitosan ở dạng màng bao nhằm kéo dài thời gian bảo quản một số loại quả , . Tuy nhiên, trong lĩnh vực nghiên cứu khả năng ức chế nấm C. gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài chỉ dừng lại ở mức độ thử nghiệm chưa đầy đủ, và chưa đủ căn cứ để công bố trên các tạp chí chuyên ngành.
Thị Thu Thủy của trường Đại học Nông nghiệp I đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến chất lượng và thời gian bảo quản chanh. Quả chanh được xử lý bằng dung dịch chitosan với ba nồng độ (1,0%, 1,5% và 2,0%). Kết quả cho thấy sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ 10oC, chanh được xử lý chitosan ở nồng độ 1,5% giữ được màu sắc đẹp nhất, có hao hụt khối lượng tự nhiên thấp và độ cứng ít biến đổi nhất .
Với mục đích kéo dài thời gian bảo quản trái cam mật sau thu hoạch, năm 2011 nhóm tác giả Nguyễn Minh Thủy và Nguyễn Thị Mỹ Tuyền đã nghiên cứu kỹ thuật bảo quản cam mật bằng phương pháp MAP. Họ đã tiến hành phân tích các chỉ tiêu hóa học của cam mật (hàm lượng vitamin C, tổng chất khô hòa tan, hàm lượng acid cùng với các chỉ tiêu vật lý (màu sắc, độ dày vỏ) và tổn thất khối lượng trái. Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể làm giảm tổn thất khối lượng của cam mật và kéo dài thời gian tồn trữ cam đến 9 tuần bằng biện pháp xử lý ozone kết hợp với bao màng chitosan, CMC (hoặc màng pectin) và bảo quản trong bao bì PE (hoặc PP) không đục lỗ ở nhiệt độ 10oC .
Năm 2011, nhóm các tác giả Nguyen Anh Dzung, Vo Thi Phuong Khanh và Tran Trung Dzung đã nghiên cứu về tác động của chitosan và oligochitosan đến đặc điểm sinh lý, sự phát triển và khả năng chịu hạn của cây cà phê tại Việt Nam. Khi sử dụng hai tác nhân này với nồng độ 0, 20, 40, 60 và 80 ppm để xử lý trên lá cây cà phê thì kết cho thấy dung dịch oligochitosan nâng cao hàm lượng chlorophyll và carotenoid trong lá cây cà phê lê đến 46,38 – 73,51% so với mẫu đối chứng trong nhà kính .
Gần đây nhất, vào năm 2012 tác giả Lê Thiên Minh và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm tạo màng sinh học chứa chitosan và nấm men đối kháng tới nấm mốc gây thối hỏng quả thanh long. Nghiên cứu này nhằm đánh giá tác dụng của chế phẩm tạo màng sinh học chứa chitosan và nấm men đối kháng Candida sake TL1 để kiểm soát nấm mốc Penicillium và Aspergillus niger gây thối hỏng quả thanh long trong quá trình bảo quản. Nồng độ ức chế tối thiểu (EC) của chitosan lên nấm mốc Penicillium và Aspergillus niger là 0,3%. Chủng nấm men Candida sake TL1 đối kháng phát triển tốt trên môi trường chứa 0,5% chitosan và 0,5% CaCl2 cho giá trị OD cao nhất 0,776 sau 90h nuôi cấy. Chế phẩm nấm men đối kháng Candida sake TL1 kết hợp với 0,5% chitosan và 0,5% CaCl2 có tác dụng ức chế cao nhất đến sự phát riển của nấm mốc Penicillium và
Aspergillus niger với tỷ lệ thối hỏng tương ứng là 18% và 16% .
kích thích sinh trưởng, tăng năng suất và phòng trừ bệnh đã được một số tác giả nghiên cứu có kết quả tốt trên một số cây trồng nông nghiệp như lúa, ngô, đậu tương, lạc, cây hồ tiêu đen, bắp cải, su hào và một số loài hoa. Bên cạnh đó chitosan hòa tan cũng cho thấy hiệu quả kháng các chủng bệnh phổ biến trên cây công nghiệp như bông, cao su, cây cà phê . Các chế phẩm oligochitosan ở Việt Nam được sử dụng chủ yếu bằng phương pháp cắt mạch bằng phóng xạ Co60, ngoài ra phương pháp cắt mạch bằng acid cũng được lựa chọn.
Với tổng quan tình hình nghiên cứu như trên, vấn đề nghiên cứu sử dụng dung dịch chitosan và oligochitosan nguồn gốc tự nhiên, có khả năng phân hủy sinh học cao với các khoảng nồng độ khác nhau nhằm phòng trừ nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài, thay thế các phương pháp bảo quản xoài bằng các hóa chất tổng hợp gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao, giúp cho việc bảo quản các loại cây ăn quả nói chung và xoài sau thu hoạch nói riêng đảm bảo an toàn, phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của Việt Nam.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu2.1.1. Chitosan 2.1.1. Chitosan
Chitosan dùng trong nghiên cứu được sản xuất tại Công ty TNHH xuất nhập khẩu Đông Tiến, TP Hồ Chí Minh bằng phương pháp hoá học với các thông số kỹ thuật như sau:
Các chỉ tiêu cảm quan - Trạng thái: Dạng bột - Màu sắc: Màu vàng nhạt - Mùi: Không mùi, không vị
- Độ tan: Không tan trong nước, trong dung dịch kiềm và các dung môi hữu cơ, tan trong dung dịch acid loãng tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt.
Các chỉ tiêu lý hóa
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu lý hóa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Tên chỉ tiêu Kết quả Đơn vị
1 Độ ẩm 10,55 %
2 Hàm lượng chitosan 97 %
3 pH (dung dịch 1%) 6,4
4 Hàm lượng tro toàn phần 0,09 % 5 Hàm lượng cặn tro không tan trong HCl 0,1 % 6 Hàm lượng Nitơ toàn phần 5,84 %
Các chỉ tiêu vi sinh vật
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu vi sinh vật
STT Tên chỉ tiêu Kết quả Đơn vị
1 Escherichia coli <0,3 MPN/g 2 Tổng số vi khuẩn hiếu khí 30 Cfu/g
3 Coliforms <0,3 MPN/g
4 Tổng số nấm men <10 Cfu/g
5 Tổng số nấm mốc 10 Cfu/g
Chế phẩm oligochitosan trong nghiên cứu sử dụng trực tiếp dung dịch sau khi cắt mạch, từ đó tiến hành pha loãng đến các nồng độ theo yêu cầu.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dung dịch hydroperoxide (H2O2) 30% để tiến hành thủy phân cắt mạch chitosan tạo ra dung dịch oligochitosan từ chitosan thô, với các điều kiện phản ứng như sau: nhiệt độ: 45oC, thời gian: 180 phút, nồng độ dung dịch: 5%. Chitosan được hòa tan trong acid acetic 2%. Bổ sung dung dịch H2O2 30%, dung dịch được lắc liên tục để cắt mạch chitosan tạo oligochitosan. Sau đó điều chỉnh pH dung dịch phản ứng về môi trường kiềm nhẹ (pH = 7 – 8) nhằm kết tủa chitosan chưa bị cắt mạch. Cuối cùng, tiến hành pha loãng dung dịch vừa cắt mạch đến các nồng độ yêu cầu .
2.1.3. Nguyên liệu quả
Mẫu xoài thí nghiệm được thu mua tại các chợ trên địa bàn thành phố Huế. Trong đó, những mẫu xoài có vết bệnh điển hình sử dụng cho quá trình phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides thuộc giống xoài cát Hòa Lộc và xoài cát Chu, mẫu xoài cho các thí nghiệm khác thuộc giống xoài cát Hòa Lộc. Đây là hai giống xoài được trồng phổ biến ở nhiều tỉnh của nước ta bao gồm: Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long, Bến Tre, Đồng Nai,...
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập nấm thán thư hại xoài và giám định bằng hình thái. Hình thái nấm được giám định bằng phương pháp:
+ Quan sát hình thái, màu sắc của sợi nấm. + Quan sát hình thái bào tử nấm.
+ Giám định bằng phương pháp sinh học phân tử.
- Đánh giá ảnh hưởng của chitosan và oligochitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở điều kiện in vitro.
- Đánh giá ảnh hưởng của chitosan đến bệnh thán thư hại xoài ở điều kiện in vivo.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu mẫu nấm bệnh
Mẫu bệnh được thu từ những quả xoài có triệu chứng vết bệnh ban đầu đến những quả có vết bệnh điển hình. Mẫu xoài bệnh được gói riêng trong túi PE và ghi các thông tin cần thiết (địa điểm, tên giống, ngày tháng thu mẫu…).
Hình 2.1. Mẫu xoài bệnh tại nơi được thu thập
2.3.2. Phương pháp phân lập và giám định nấm Colletotrichum
gloeosporioides
Phương pháp phân lập và giám định nấm Colletotrichum gloeosporioides (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
được tiến hành theo quy trình sau:
Quy trình phân lập
Ủ ở nhiệt độ 28oC từ 2 - 4 ngày Mẫu quả bệnh
Khử trùng bằng cồn 70o
Ủ mẫu
Dùng tăm vô trùng chấm vào mô bệnh
Hình 2.2. Quy trình phân lập và giám định nấm từ mẫu bệnh
(*) Các môi trường PDA được chuẩn bị theo [Phụ lục 1]
Thuyết minh quy trình
- Khử trùng và ủ mẫu bệnh
+ Sau khi được đưa về phòng thí nghiệm thì mẫu được rửa dưới vòi nước sạch để loại tạp chất và bụi bẩn bám trên bề mặt. Tiếp theo khử trùng mẫu bằng cồn 70o sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng.
+ Đặt mẫu quả có vết bệnh điển hình trên giấy vô trùng, đưa vào khay nhựa đã khử trùng bằng cồn 70o, cho nước cất vô trùng vào giấy vô trùng để tạo môi trường ẩm. Sau đó dùng túi nilon bọc khay nhựa lại và ủ mẫu ở nhiệt độ khoảng (25oC – 28oC) trong điều kiện có ánh sáng để kích thích sự sinh bào tử nấm, theo dõi sự sinh bào tử trên mẫu. Sau khoảng 2 – 4 ngày quan sát khi thấy có xuất hiện bào tử, làm tiêu bản để giám định bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài, sau khi giám định sơ bộ ta tiến hành phân lập nấm trên môi
Cấy truyền sang môi trường 1/5 PDA
Quan sát bào tử dưới kính hiển vi, giám định nấm
Làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử
Giám định lại dưới kính hiển vi
Giữ mẫu
Gửi mẫu định danh
trường thích hợp .
Hình 2.3. Giữ ẩm mẫu để phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides gây hại
trên xoài - Phân lập nấm
Khi quan sát thấy có bào tử nấm xuất hiện trên vết bệnh đã ủ thì tiến hành phân lập nấm bằng cách dùng tăm vô trùng chấm vào mô bệnh rồi cấy lên đĩa môi trường chọn lọc ½ PDA. Các đĩa môi trường phân lập được ủ ở nhiệt độ 28oC trong thời gian khoảng từ 2 – 4 ngày.
- Cấy truyền
Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày, đánh giá sự phát triển của sợi nấm tại vị trí cấy. Cấy truyền khi sợi nấm mọc được khoảng 5mm từ vị trí cấy. Cắt một miếng thạch (2 × 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang môi trường 1/5 PDA .
- Làm thuần
Giai đoạn cuối cùng trong việc giám định nấm gây bệnh là việc làm thuần mẫu nấm. Chỉ một bào tử hoặc một đỉnh sinh trưởng của sợi nấm được cấy sang môi trường sạch để đảm bảo nấm được cấy là hoàn toàn thuần bằng phương