NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT citroflavonoid từ CITRUS

hi Citrus là một chi lớn thuộc họ Cam (Rutaceae) và được cho là có nguồn gốc từ Đông Nam Á. Ở Việt Nam, chi Citrus có khoảng 20 loài và dưới loài. Các cây Citrus rất phổ biến ở Việt Nam gồm có: 1) Bƣởi: tên khoa học là Citrus grandis (L.) Osbeck (tên đồng nghĩa C. decumana Murr. và C. maxima (Burm.) Merr.), 2) Cam: C. sinensis (L.) Osbeck, (C. aurantium L.), 3) Chanh: tên khoa học C. limonia Osbeck (chanh kiên) và C. aurantifolia Swingle (chanh ta) 4) Quít: tên khoa học C. reticulate Blanco (C. nobilis Lour. ; C. chrysocarpa Lush.), 5) Quất: C. japonica Thunb. (Fortunella spp)Ngoài việc sử dụng ruột quả làm thức uống giải khát thì vỏ quả cũng có nhiều tác dụng không kém.Nhóm hợp chất chính trong vỏ quả các loài thuộc chi Citrus là các flavonoid có hàm lượng cao, có thể lên tới 510% tính theo vỏ quả khô. Đây là thành phần hoạt chất chính có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, giảm mỡ máu, chống các bệnh tim mạch, và chống ung thư và rất nhiều bệnh tật khác. Có vài chục flavonoid được gọi là citroflavonoid vì chúng được tìm thấy chủ yếu trong các loài Citrus , trong đó naringin và hesperidin là hai flavanon glycosid phổ biến nhất có trong quả các loài Citrus. Y học cổ truyền của Trung Quốc và một số nước châu Á có sử dụng vỏ quả (hoặc quả) của nhiều loài Citrus làm thuốc như bưởi, cam chua và cam ngọt (chỉ thực, chỉ xác), chanh, quýt (trần bì), thanh yên… . Các citroflavonoid còn được dùng làm thuốc điều trị các bệnh rối loạn thành mạch máu, một số biệt dược được bán trên thị trường hiện nay như Daflon, Diosmin, Flebosmin, Cemaflavone, Ciricularine... Như vậy, có thể coi citroflavonoid được làm thuốc dùng trong cả y học cổ truyền và y học hiện đại.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I TỔNG QUAN 3

1 CÁC LOÀI CITRUS 3

2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI CITRUS 4

2.1 Thành phần hóa học 4

2.2 Flavonoid trong vỏ quả các loài Citrus (citroflavonoid) 5

3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CITROFLAVONOID 7

3.1 Tác dụng chống oxy hóa 7

3.2 Tác dụng giảm mỡ máu 8

3.3 Tác dụng chống viêm 8

3.4 Chống các bệnh tim mạch 8

3.5 Chống ung thư 9

3.6 Các sản phẩm thuốc trên thị trường có hoạt chất là các citroflavonoid 9

4 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VỀ CITROFLAVONOID 9

5 CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID 10

6 VẤN ĐỀ TỒN TẠI CẦN GIẢI QUYẾT 13

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆUVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14

2 NGUYÊN LIỆU 14

2.1 Nguyên liệu cho chiết xuất 14

2.2 Dung môi, hóa chất 14

2.3 Động vật thí nghiệm 14

3 THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thiết bị sử dụng cho điều tra, khảo sát các loài Citrus 15

3.2 Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu qui mô phòng thí nghiệm 15

3.4 Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ở qui mô pilot 15

3.5 Thiết bị sử dụng cho kiểm nghiệm 16

3.5 Thiết bị sử dụng cho thử tác dụng sinh học 16

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

4.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu các loài thuộc chi Citrus 16

4.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng các citroflavonoid 16

4.3 Xây dựng qui trình chiết xuất citroflavonoid qui mô phòng thí nghiệm 17

4.4 Triển khai các quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid ở qui mô pilot 17

4.5 Phân lập các hoạt chất flavonoid chính làm chất đối chiếu 17

4.6 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả Citrus và sản phẩm bột citroflavonoid 18

4.7 Phương pháp thử tác dụng sinh học của bột citroflavonoid 18

4.7.1 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của các sản phẩm 18

4.7.2 Thử độc tính cấp 21

4.7.3 Thử độc tính bán trường diễn 21

4.7.4 Đánh giá tác dụng phòng chống vữa xơ động mạch 22

4.7.5 Xử lý số liệu 23

4.7.6 Nơi thực hiện nghiên cứu 23

PHẦN III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24

1 ĐIỀU TRA, KHẢO SÁT, THU THẬP VÀ PHÂN TÍCH THÔNG TIN VỀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU CITRUS TẠI VIỆT NAM 24

1.1 Phạm vi điều tra 24

1.2 Thu thập tiêu bản và xác định tên khoa học của các loài Citrus 24

1.3 Kết quả thu mua nguyên liệu vỏ quả các loài Citrus 25

1.4 Điều tra phỏng vấn nguồn nguyên liệu vỏ quả từ các loài Citrus 26

1.4.1 Kết quả điều tra, phỏng vấn về diện tích trồng và sản lượng các loài 26

1.4.2 Kết quả điều tra, phỏng vấn các công ty/xí nghiệp kinh doanh các sản phẩm từ các loài thuộc chi Citrus 27

1.5 Kết luận 28

2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CITROFLAVONOID TRONG MẪU VỎ QUẢ CITRUS VÀ CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT 28 2.1 Xây dựng phương pháp Định tính các citroflavonoid 28

2.1.1 Nguyên tắc 28

2.1.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) 29

2.1.3 Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 31

2.2 Phương pháp định lượng bằng phép đo UV-VIS 35

2.2.1 Nguyên tắc 35

2.2.2 Thực nghiệm 35

2.2.3 Kết quả 36

2.3 Phương pháp định lượng naringin và hesperidin bằng HPLC 36

2.3.1 Nguyên tắc 36

2.3.2 Thực nghiệm 36

2.3.3 Kết quả 37

3 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CITROFLAVONOID TRONG MẪU VỎ QUẢ CITRUS THU THẬP 40

3.1 Nguyên liệu 40

3.2 Phương pháp định lượng 41

3.3 Phương pháp xác định độ ẩm của mẫu thử 41

3.4 Tiến hành định lượng 41

3.5 Kết quả 42

3.5.1 Kết quả định lượng citroflavonoid 42

3.5.2 Bàn luận 44

3.6 Kết luận 45

4 PHÂN LẬP CÁC CITROFLAVONOID CHÍNH LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU 46

4.1 Phương pháp nghiên cứu 46

4.2 Thực nghiệm và kết quả 46

4.2.1 Phân lập Naringin (ký hiệu là CF-1) 46

4.2.2 Phân lập Hesperidin (CF-2) 47

4.2.3 Điều chế Naringenin (CF-3) 50

4.2.4 Điều chế Hesperetin (CF-4) 51

5 KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO 53

5.1 Kết quả thử tác dụng dọn gốc tự do 53

5.1.1 Tác dụng dọn gốc tự do DPPH 53

5.1.2 Tác dụng dọn gốc tự do superoside (O 2 –● ) 53

5.1.3 Tác dụng dọn gốc tự do hydroxy (OH ● ) 54

5.2 Tác dụng ức chế sự oxy hóa lipid 54

5.3 Tác dụng chống oxy hóa lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) 55

5.4 Bàn luận 55

6 LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU CHO CHIẾT XUẤT 56

7 XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN LẬP CITROFLAVONOID TỪ VỎ QUẢ CÁC LOÀI CITRUS Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 57

7.1 Phương pháp thực nghiệm chung 57

7.1.1 Nguyên vật liệu 57

7.1.2 Thực nghiệm 57

7.2 Khảo sát các điều kiện chiết xuất citroflavonoid từ dược liệu 57

7.2.1 Khảo sát dung môi chiết 57

7.2.2 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất 58

7.2.3 Khảo sát thời gian và số lần chiết xuất 59

7.2.4 Khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu 60

7.2.5 Khảo sát kích thước dược liệu 60

7.3 Qui trình loại tạp từ citroflavonoid chiết xuất 61

7.3.1 Nguyên liệu 61

7.3.2 Thực nghiệm 61

7.3.3 Kết quả 61

7.3.4 Kết luận 62

7.4 Xây dựng qui trình chiết xuất citroflavonoid từ dược liệu 63

7.4.1 Nguyên vật liệu 63

7.4.2 Thực nghiệm 63

7.4.3 Kết quả 63

7.4.4 Kết luận 64

8 TRIỂN KHAI QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID TỪ VỎ QUẢ CITRUS QUY MÔ PILOT 66

8.1 Triển khai và điều chỉnh các thông số kỹ thuật phù hợp cho từng công đoạn của quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid 66

8.1.1 Nguyên vật liệu 66

8.1.2 Trang thiết bị, máy móc 66

8.1.3 Thực nghiệm 66

8.1.4 Xây dựng qui trình 67

8.2 Hoàn thiện độ ổn định của quy trình công nghệ chiết xuất Citroflavonoid 70

8.2.1 Nguyên vật liệu 70

8.2.2 Máy móc, trang thiết bị 70

8.2.3 Thực nghiệm 70

8.2.3 Kết luận 71

9 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM 74

9.1 Tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả Citrus dùng cho chiết xuất 74

9.1.1 Nguyên vật liệu 74

9.1.2 Thực nghiệm 74

9.1.3 Kết quả 75

9.1.4 Tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu 78

9.2 Tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm bột citroflavonoid 79

9.2.1 Nguyên vật liệu 79

9.2.2 Thực nghiệm 79

9.2.3 Kết quả 79

9.2.4 Kết luận 81

10 XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP CỦA BỘT CITROFLAVONOID 81

10.1 Nguyên vật liệu 81

10.2 Thực nghiệm 82

10.3 Kết quả 82

11 XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA BỘT CITROFLAVONOID 82

11.1 Nguyên liệu 82

11.2 Thực nghiệm 83

11.3 Kết quả 83

11.3.1 Kết quả theo dõi tình trạng chung và cân nặng động vật thí nghiệm 83

11.3.2 Kết quả theo dõi các chỉ số huyết học 83

11.3.3 Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng gan 84

11.3.4 Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng thận 85

11.3.5 Kết quả xét nghiệm mô học 86

11.4 Kết luận 86

12 TÁC DỤNG PHÒNG CHỐNG VỮA XƠ ĐỘNG MẠCH CỦA SẢN PHẨM BỘT CITROFLAVONOID 86

12.1 Thực nghiệm 86

12.1.1 Nguyên vật liệu 86

12.1.2 Tiến hành thí nghiệm 87

12.2 Kết quả 87

12.2.1 Ảnh hưởng của thuốc thử trên các chỉ số lipid máu 87

12.2.2 Tác dụng của citroflavonoid lên mô bệnh học 89

12.3 Kết luận 90

13 NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA SẢN PHẨM BỘT CITROFLAVONOID 91

13.1 Nguyên liệu nghiên cứu 91

13.2 Phương pháp nghiên cứu 91

13.3 Kết quả 91

13.3.1 Lần kiểm nghiệm thứ nhất 91

13.3.2 Lần kiểm nghiệm thứ hai 91

13.3.3 Lần kiểm nghiệm thứ ba 92

13.3.3 Lần kiểm nghiệm thứ tư 92

PHẦN IV BÀN LUẬN 94

1 Bàn luận về các kết quả nghiên cứu đã thu được 94

1 1 Khảo sát nguồn nguyên liệu vỏ quả một số loài thuộc chi Citrus tại Việt Nam 94

1.2 Xây dựng được phương pháp định tính, định lượng các flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 94

1.3 Lựa chọn được một flavonoid để nghiên cứu chiết xuất ở qui mô lớn 96

1.4 Nghiên cứu và lựa chọn được qui trình chiết xuất citroflavonoid ở qui mô phòng thí nghiệm (1 kg/mẻ) để áp dụng cho qui trình sản xuất ở qui mô lớn (>100 kg/mẻ) 98

1 5 Đã triển khai quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quả Citrus ở qui mô pilot (>100 kg/mẻ) .99

1.6 Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cho vỏ quả Citrus và cho sản phẩm bột citroflavonoid 102

1.7 Tác dụng sinh học và độc tính của sản phẩm bột citroflavonoid 103

1.8 Độ ổn định của bán thành phẩm bột citroflavonoid 103

2 Phân tích hiệu quả kinh tế của việc sản xuất thử nghiệm bột citroflavonoid 103

2.1 Các số liệu thống kê về kinh tế của Qui trình chiết xuất 104

2.2 Phân tích về hiệu quả kinh tế nếu sản xuất thử nghiệm 105

3 Một số vấn đề còn tồn tại cần giải quyết 107

3.1 Khó khăn về tìm kiếm nguồn nguyên liệu cho chiết xuất lớn 107

3.2 Việc thực hiện chiết xuất ở qui mô pilot (≥ 120 kg) còn một số tồn tại 107

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 108

1 Kết luận 108

2 Kiến nghị 109

TÀI LIỆU THAM KHẢO 110

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Tổng hợp kết quả về diện tích trồng và sản lượng quả một số loài Citrus 26

Bảng 2 Dung môi rửa giải cho định lượng citroflavonoid 32

Bảng 3 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 38

Bảng 4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của narigin và hesperidin 38

Bảng 5 Kết quả khảo sát độ lặp lại phương pháp 38

Bảng 6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 40

Bảng 7 Kết quả xác định hàm lượng naringin và hesperidin trong các mẫu 42

Bảng 8 Số liệu 1H và 13C NMR của các chất CF-1 và CF-2 48

Bảng 9 Số liệu 1H- và 13C-NMR của các chất CF-3 và CF-4 trong DMSO 51

Bảng 10 Tác dụng dọn gốc tự do DPPH của các mẫu thử 53

Bảng 11 Tác dụng dọn gốc tự do superoxide của các mẫu thử 54

Bảng 12 Tác dụng dọn gốc tự do hydroxy của các mẫu thử 54

Bảng 13 Tác dụng chống oxy hóa lipid của các mẫu thử 55

Bảng 14 Tác dụng chống oxy hóa LDL của các mẫu thử 55

Bảng 15 Tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập được 56

Bảng 16 Kết quả loại tạp bằng phương pháp tủa trong nước 62

Bảng 17 Kết quả loại tạp bằng phương pháp tủa trong cồn 62

Bảng 18 Kết quả loại tạp bằng phương pháp tủa trong cồn-nước lạnh 62

Bảng 19 Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng citroflavonoid trong sản phẩm 64

Bảng 20 Hiệu suất sản phẩm chiết xuất và hàm lượng citroflavonoid trong sản phẩm 68

Bảng 21 Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng citroflavonoid trong sản phẩm (quy mô pilot) 71

Bảng 22 Độ ẩm của các mẫu trần bì 75

Bảng 23 Độ tro toàn phần của các mẫu trần bì 76

Bảng 24 Độ tro không tan trong acid clohydric của các mẫu trần bì 76

Bảng 25 Kết quả xác định tạp chất của các mẫu trần bì 76

Bảng 26 Hàm lượng hesperidin trong các mẫu trần bì 78

Bảng 27 Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu citroflavonoid 79

Bảng 28 Kết quả tro toàn phần của các mẫu citroflavonoid 80

Bảng 29 Hàm lượng % hesperidin trong các mẫu bột citroflavonoid 81

Bảng 30 Số liệu thử độc tính cấp của citroflavonoid 82

Bảng 31 Trọng lượng thỏ thí nghiệm ở các thời điểm theo dõi (kg) 83

Bảng 32 Kết quả theo dõi các chỉ số của máu thỏ ở các lô thí nghiệm 84

Bảng 33 Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng gan thỏ ở các lô thí nghiệm 85

Bảng 34 Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng thận thỏ ở các lô thí nghiệm 85

Bảng 35 Ảnh hưởng của thuốc thử lên nồng độ triglycerid 87

Bảng 36 Ảnh hưởng của thuốc thử lên nồng độ cholesterol toàn phần 88

Bảng 37 Ảnh hưởng của thuốc thử lên nồng độ HDL- cholesterol 88

Bảng 38 Ảnh hưởng của thuốc thử lên nồng độ LDL- cholesterol 88

Bảng 39 Kết quả quan sát đại thể và vi thể động mạch chủ 89

Bảng 40 Kết quả quan sát đại thể và vi thể gan 90

Bảng 41 Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 1 91

Bảng 42 Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 2 92

Bảng 43 Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 3 92

Bảng 44 Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 4 93

Bảng 45 Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 5 93

Bảng 46 Chi phí cho chiết xuất 120kg dược liệu (1 mẻ chiết) ở qui mô nghiên cứu 105

Bảng 47 Dự kiến chi phí cho chiết xuất 1000kg dược liệu ở quy mô sản xuất 106

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc cơ bản của các flavonoid trong vỏ quả của các loài Citrus 5

Hình 2 Flavonoid nhóm flavan trong quả các loài Citrus và các glycosid của chúng 6

Hình 3 Flavonoid nhóm flavon và flavonon có trong vỏ quả các loài Citrus 7

Hình 4 Các nhóm chức đem lại tác dụng chống oxy hóa mạnh cho flavonoid 8

Hình 5 Qui trình (I) chiết xuất flavonoid từ dược liệu 10

Hình 6 Qui trình (II) chiết xuất flavonoid từ dược liệu 11

Hình 7 Qui trình (III) chiết xuất flavonoid từ vỏ bưởi 12

Hình 8 Qui trình (IV) chiết xuất flavonoid từ vỏ bưởi 12

Hình 9 Sắc ký đồ của 4 hoạt chất tinh khiết có trong các loài Citrus 30

Hình 10 Sắc ký đồ của 4 hoạt chất tinh khiết có trong các loài Citrus 31

Hình 11 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp hesperidin và naringin (trên), mẫu naringin (giữa) và mẫu hesperidin (dưới) .33

Hình 12 Sắc ký đổ của mẫu chuẩn hỗn hợp (trên cùng), mẫu thu hái chứa hesperidin (vỏ quả quýt, giữa) và mẫu chứa naringin (vỏ bưởi, dưới cùng) .34

Hình 13 Sắc ký đổ của mẫu dược liệu chỉ chứa naringin (trên), mẫu thử chỉ chứa hesperidin (giữa) và mẫu chứa cả hai chất này (dưới) 39

Hình 14 Qui trình phân lập và tinh chế naringin (CF-1) từ dược liệu 47

Hình 15 Cấu trúc hóa học của CF-1 (naringin) và CF2 (hesperidin) 48

Hình 16 Qui trình phân lập và tinh chế hesperidin (CF-2) từ dược liệu 49

Hình 17 Nguyên tắc điều chế naringenin 50

Hình 18 Nguyên tắc điều chế hesperitin 52

Hình 19 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết xuất và hàm lượng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm 58

Hình 20 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết xuất và hàm lượng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm 59

Hình 21 Ảnh hưởng của thời gian và số lần chiết đến hiệu suất chiết xuất 59

Hình 22 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hiệu suất chiết xuất và hàm lượng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm 60

Hình 23 Ảnh hưởng của kích thước dược liệu đến hiệu suất chiết xuất và hàm lượng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm 61

Hình 24 Sơ đồ quy trình chiết xuất citroflavonoid từ dược liệu qui mô phòng thí nghiệm 65

Hình 25 Sơ đồ quy trình chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quýt 69

Hình 26 Qui trình chiết xuất citroflavonoid ở qui mô pilot 73

Hình 27 Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu trần bì 77

Hình 28 SKĐ HPLC của hesperidin đối chiếu và dược liệu trần bì 77

Hình 29 Đồ thị của phương trình hồi qui 78

Hình 30 Sắc ký đồ TLC định tính bột citroflavonoid 80

Hình 31 Sắc ký đồ HPLC của hesperidin đối chiếu và mẫu bột citroflavonoid 81

Ở Việt Nam, chi Citrus có khoảng 20 loài và dưới loài Các cây Citrus rất phổ biến ở Việt Nam gồm có: 1) Bưởi: tên khoa học là Citrus grandis (L.) Osbeck (tên đồng nghĩa C decumana Murr và C maxima (Burm.) Merr.), được trồng từ lâu đời ở Việt Nam, phân bố khắp đất nước; 2) Cam: C sinensis (L.) Osbeck, (C aurantium L.), được trồng từ lâu đời khắp đất nước; 3) Chanh: tên khoa học C limonia Osbeck (chanh kiên) được trồng nhiều ở miền Bắc và C aurantifolia Swingle (chanh ta) được trồng nhiều ở miền Nam; 4) Quít: tên khoa học

C reticulate Blanco (C nobilis Lour ; C chrysocarpa Lush.), nhiều giống quít nổi tiếng như: quít đường (có vỏ dày), quít tiều, quít Bắc Sơn, quít hồng…; 5) Quất: C japonica Thunb (Fortunella spp), được trồng rất nhiều ở Hà Nội và các tỉnh lân cận chủ yếu làm cây cảnh

Thành phần hóa học chính của các loài Citrus là acid hữu cơ, alkaloid, carotenoid,

coumarin, flavonoid, limonoid, tinh dầu và các vitamin được phân bố trong các bộ phận (rễ, thân, cánh, lá, và quả) của cây Flavonoid là thành phần chính và quan trọng trong các loài

Citrus, phân bố ở tất cả các bộ phận và đặc biệt có hàm lượng cao trong vỏ quả Hiện nay số lượng flavonoid đã được phân lập và xác định từ vỏ quả các loài Citrus là khoảng hơn 60 chất,

thuộc các nhóm flavanon, flavon, flavonol, và anthocyanin Thành phần flavonoid chính có

trong tất cả vỏ quả của các loài Citrus là các flavan Các flavan aglycon và các flavan glycosid của chúng chiếm hàm lượng rất lớn trong vỏ quả của các loài Citrus, tới hơn 90% trong

flavonoid toàn phần Trong số các flavan, hay gặp và có hàm lượng lớn nhất là naringenin, hesperitin và đặc biệt các glycosid của chúng là naringin, hesperidin Các chất này chiếm hàm lượng rất lớn, có thể tới 5−10% tính theo vỏ quả khô Điều đặc biệt là narigenin, naringin,

hesperitin, và hesperidin có hàm lượng lớn trong các loài thuộc chi Citrus nhưng lại rất hiếm gặp ở các chi và họ khác Vì vậy, chúng được coi là các flavonoid đặc trưng của chi Citrus, và

được gọi là citroflavonoid

Các citroflavonoid có rất nhiều các tác dụng sinh học được quan tâm, gồm có: 1) chống oxy hóa; 2) hạ cholesterol trong máu, góp phần điều hòa mỡ trong máu của người béo phì, người già, người bệnh; 3) chống viêm do ức chế các enzym gây ra quá trình viêm (cyclooxygenase, lipoxigenase, phospholipase, phosphodiesterase); 4) chống các bệnh tim mạch: có tác dụng làm bền thành mạch, chống vữa xơ động mạch, chống kết dính tiểu cầu và tăng tính thấm của mao mạch; và 5) chống ung thư

Về công dụng, các cây thuộc chi Citrus được trồng để thu hái quả Bưởi, cam, chanh, và

quít là những loài thu hái quả quan trọng và phổ biến cả trên thế giới và Việt Nam Vỏ quả và

lá của các loài Citrus còn được sử dụng để khai thác tinh dầu phục vụ công nghiệp mỹ phẩm và thực phẩm Tại các nước Đông Á và Việt Nam, vỏ quả của các loài Citrus cũng được dùng trong y học cổ truyền và y học dân gian Vỏ quít (C reticulate) thái mỏng phôi khô, còn được

gọi là trần bì, được dùng làm thuốc chữa ho, hen, viêm họng có đờm Quả cam chua (C aurantium) thái phơi khô, được gọi là chỉ xác hay chỉ thực, được dung chữa chán ăn, không tiêu, đau bụng, nôn mửa Trong công nghiệp Dược phẩm, các flavonoid của chi Citrus được

dùng làm thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch máu Các công ty Dược phẩm hàng đầu thế giới của nước Pháp đã đưa ra một số sản phẩm có hoạt chất là các citroflavonoid như Daflon, Diosmin, Flebosmin, Cemaflavone, Circularine Trong số này, sản phẩm thuốc Daflon của công ty Dược phẩm Servier (Pháp) là nổi tiếng và bán chạy nhất Thành phần chính của thuốc

Daflon là phân đoạn flavonoid chiết xuất từ vỏ quả của các loài Citrus, hàm lượng 500 mg,

gồm diosmin 450 mg và flavonoid tương đương với 50 mg hesperidin Thuốc có tác dụng làm tăng trương lực của tĩnh mạch, giảm ứ trệ ở tĩnh mạch, tăng sức bền ở mao mạch, được dùng điều trị các bệnh suy tĩnh mạch bạch huyết (nặng chân, đau chân, bứt rứt, đau chân, phù chân)

và đặc biệt được dùng để điều trị bệnh trĩ

Các cây thuộc chi Citrus được trồng rất rộng rãi ở nước ta với mục đích chính là lấy quả

và làm cảnh Nhân dân có sử dụng quả hoặc vỏ quả của một số loài để làm thuốc theo y học cổ truyền, y học dân gian, tuy nhiên, số lượng sử dụng là không nhiều vì nhu cầu thấp Có thể dễ

dàng nhận thấy sau khi sử dụng quả của các loài Citrus, vỏ quả giữa (còn được gọi là cùi) được

đem vứt đi mà không được sử dụng gì cả Đây là một nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc rất dồi dào, sẵn có quanh năm, là phế phẩm của ngành thực phẩm Thế nhưng hiện tại chưa có sản

phẩm nào có thành phần là các flavonoid chiết xuất từ vỏ của các loài Citrus được sản xuất bởi

các công ty dược phẩm Việt Nam trong khi chúng ta có nhu cầu rất lớn về các thuốc này

Tuy có một số nghiên cứu ở Việt Nam về việc ứng dụng các flavonoid để làm thuốc chữa bệnh, nhưng chưa có nghiên cứu cho qui mô công nghiệp và do đó chưa thể triển khai được trong công nghiệp Công nghệ hóa dược và sản xuất dược phẩm ở nước ta nói chung và ở

Hà Nội nói riêng, đã có những phát triển vượt bậc trong những năm qua Chúng ta có thể triển khai những qui trình công nghệ chiết xuất và sản xuất thuốc trên những dây chuyền công nghệ mới của các công ty dược phẩm Tại Viện Dược liệu cũng có dây chuyền chiết xuất hoạt chất

và dây chuyền sản xuất viên bao phim ở qui mô bán công nghiệp (qui mô Pilot)

Với những lý do kể trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình công

nghệ chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quả các loài thuộc chi Citrus, họ Rutaceae” Mục tiêu tổng

quát của đề tài là xây dựng được qui trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid đạt tiêu chuẩn dược dụng, có thể dùng để sản xuất các thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch rất hiệu quả, đem lại nhiều lợi nhuận về kinh tế và xã hội Các mục tiêu cụ thể của đề tài gồm có:

1 Xây dựng được qui trình công nghệ chiết xuất sản phẩm chứa trên 50% citroflavonoid

từ vỏ quả của một số loài thuộc chi Citrus, họ Rutaceae làm nguyên liệu sản xuất thuốc

2 Đánh giá được độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh rối loạn thành mạch của sản phẩm

3 Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm bột citroflavonoid

Có nhiều phân loại về các loài trong chi Citrus [3], [4] Theo Engler thì có 9 loài [4], theo Swingle có 16 loài [5], còn Tanaka lại liệt kê 166 loài thuộc chi Citrus [6] Ngày nay, đã

có rất nhiều cá thể lai giữa các loài trong chi này nên phân loại rất phức tạp

Ở Việt Nam, chi Citrus có khoảng 20 loài và dưới loài [1], [2], [7], [8], trong đó có các

cây cho quả ăn rất phổ biến sau:

- Bưởi: tên khoa học là Citrus grandis (L.) Osbeck, (còn có các tên đồng nghĩa C decumana Murr và C maxima (Burm.) Merr.) Đây là cây được trồng phổ biến ở các nước

Đông Nam Á và Nam Á Ở Việt Nam, bưởi là cây được trồng từ rất lâu đời, phân bố khắp đất nước Có nhiều giống bưởi ở nước ta, hay được biết đến như bưởi Biên Hòa (Đồng Nai), Da Xanh (Bến Tre), Đoan Hùng (Phú Thọ), Năm Roi (Cần Thơ), Phúc Trạch (Hà Tĩnh) Tại Hà Nội có bưởi Diễn cũng khá nổi tiếng

- Cam: tên khoa học Citrus sinensis (L.) Osbeck (cam vỏ nhẵn) và C nobilis Lour

(cam sành) Cam là cây trồng thu hái quả phổ biến nhất, được trồng rộng rãi ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới trên thế giới Ở nước ta cam cũng được trồng từ lâu đời Ngày nay

có nhiều giống cam quí được trồng ở nước ta như cam Bố Hạ (Yên Thế, Bắc Giang), cam Vinh và cam xã Đoài (Nghệ An), cam Bắc Quang (Hà Giang)

- Chanh: Citrus limonia Osbeck (chanh kiên) được trồng nhiều ở miền Bắc và C aurantifolia Swingle (chanh ta) được trồng nhiều ở miền Nam Tuy chanh được trồng

nhiều nơi để lấy quả và lá, nhưng năng suất quả thấp hơn các loài kể trên nên được trồng ít hơn cam và bưởi

- Quít: Citrus reticulate Blanco, (C nobilis Lour và C chrysocarpa Lush) Giống quít C reticulate được trồng nhiều ở các nước nhiệt đới Ở nước ta có nhiều giống quít nổi

tiếng như: quít đường (có vỏ dày), quít tiều, quít Bắc Sơn, quít hồng… Quít được trồng lấy quả ở các tỉnh miền núi phía bắc như Bắc Giang, Cao Bằng, Hà Giang, Lai Châu, Lạng Sơn, Thái Nguyên Ở Hà Nội (Hà Tây cũ) cũng có nhiều vùng trồng quít

- Quất: Citrus japonica Thunb., (Fortunella spp.), có nguồn gốc từ Trung Quốc,

ngày nay được trồng nhiều tại các nước nhiệt đới và bán nhiệt đới Ở Việt Nam quất được trồng rất nhiều ở Hà Nội và các tỉnh lân cận với mục đích làm cây cảnh, trang trí cho ngày Tết là chính Vùng trồng quất nổi tiếng là Quảng Bá, Quảng An, Tứ Liên Ngày nay thì các tỉnh lân cận Hà Nội cũng trồng nhiều, và đã được di thực vào miền Nam Mặc dù quất ra

rất nhiều quả nhưng ít được dùng làm thức ăn hơn các loài Citrus kể trên

- Chấp: C aurantium L., được trồng nhiều tại miền bắc

- Phật thủ: Citrus medica L var sarcodactylis (Sieb.) Swingle

Các loài liệt kê ở trên là các loài có nguồn gốc từ châu Á, đã được trồng trọt từ lâu Ngày nay, đã có rất nhiều cá thể lai mà chúng ta không xác định được chính xác tên loài [4],

nhưng để xác định các cá thể thuộc chi Citrus là tương đối dễ dàng

Về công dụng, các cây thuộc chi Citrus được trồng để thu hái quả Bưởi, cam, chanh, và

quít là những loài thu hái quả quan trọng và phổ biến trên cả trên thế giới và ở Việt Nam Vỏ

quả và lá của các loài Citrus còn được sử dụng để khai thác tinh dầu phục vụ công nghiệp mỹ phẩm và thực phẩm Tại các nước Đông Á, lá và vỏ quả của các loài Citrus cũng được dùng

trong y học cổ truyền và y học dân gian [7], [8] Trong công nghiệp Dược phẩm, các flavonoid

của chi Citrus được dùng làm thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch máu

2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI CITRUS

2.1 Thành phần hóa học

Các cây Citrus đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu rất kỹ về thành phần

hóa học Các thành phần hóa học chính của chúng là acid hữu cơ, alkaloid, coumarin, tinh dầu

và các vitamin được phân bố trong các bộ phận (rễ, thân, cánh, lá, và quả) của cây

● Carotenoid: các carotenoid có trong vỏ quả các loài Citrus là các chất sắc tố từ vàng

đến đỏ cam và tan trong tinh dầu vỏ [9] Các chất thường gặp là caroten (, , ), cryptoxanthin, auroxanthin [9]

● Tinh dầu: vỏ quả ngoài của tất cả các loài Citrus chứa một lượng lớn tinh dầu nằm

trong túi tiết [10], [11] Thành phần trong tinh dầu rất đa dạng, bao gồm các monoterpen, các alcol, các aldehyd, các ester, ether, và các ceton Một số thành phần chính trong tinh dầu

Citrus có thể kể đến là cymen, geraniol, geranial, limonene (chiếm hơn 80%), -pinen, 

-pinen, sabinen, ter-pinen, terpinolen… Vỏ quả của các loài Citrus thu hái tại nhiều nơi ở Việt Nam cũng được xác định có chứa hàm lượng lớn về tinh dầu [12] Tinh dầu Citrus có tác dụng

chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm [10], [13] Tinh dầu được sử dụng trong công nghiệp làm mỹ phẩm và làm gia vị [10]

● Limonoid: đây là thành phần đặc trưng và có hàm lượng lớn của các cây thuộc họ

Rutaceae và Meliaceae nói chung, chi Citrus nói riêng [14], [15] Về cấu trúc hóa học,

limonoid là các dẫn chất của triterpen có chứa nhiều oxy trong phân tử và có một vòng furan ở

vị trí C-17, tồn tại cả ở dạng aglycon tự do và dạng glycosid [14], [15] Một số limonoid có vị đắng và đây chính là nguyên nhân gây ra vị đắng trong vỏ quả và cả dịch quả của các loài

Citrus [14] Các limonoid có các tác dụng sinh học chống ung thư, giảm cholesterol trong máu,

có tác dụng diệt côn trùng và ký sinh trùng sốt rét, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm, và

kể cả chống HIV [14], [15]

● Coumarin: các coumarin có nhiều trong các cây thuộc họ Rutaceae nói chung [10], [17], [18], [19], [20] Tuy nhiên hàm lượng coumarin trong vỏ quả thấp hơn trong rễ, thân, cành [18]

Vì coumarin là các chất ít phân cực nên có thể tìm thấy trong tinh dầu của vỏ quả, nhưng cũng

có thể tìm thấy trong vỏ quả trong [10], [18] Một số coumarin hay gặp trong các loài Citrus là

bergamottin, bergapten, imperatorin, isoimperatorin, osthol, psoralen Coumarin có các tác

dụng sinh học chống ung thư [18], [19], chống oxy hóa, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm [10]

● Alkaloid: alkaloid có nhiều trong họ Rutaceae [20], [21], [22] Thông thường các loài

Citrus có chứa alkaloid có cấu trúc protoalkaloid là dẫn xuất của tyramin [21], [22] Các

alkaloid này có tác dụng diệt côn trùng [22]

● Flavonoid: flavonoid là thành phần chính và quan trọng trong các loài Citrus, phân bố ở

tất cả các bộ phận và đặc biệt có hàm lượng cao trong vỏ quả [9], [23], [24] Hiện nay số lượng

flavonoid đã được phân lập và xác định từ vỏ quả các loài Citrus là khoảng hơn 60 chất, thuộc

các nhóm flavanon, flavon, flavonol, và anthocyanin (Hình 1) [23], [24] Thông thường, các

flavonoid tồn tại trong Citrus ở cả dạng aglycon tự do và dạng glycosid [23]

O

2 3 4 5

O

O

2 4 5

7

1' 2' 4'

O

O

2 4 5

7

1'

3' 4'

OH O

O+

2

4 5 7

1'

3' 4'

Khung anthocyanin

OH OH

HO

Hình 1 Cấu trúc cơ bản của các flavonoid trong vỏ quả của các loài Citrus

2.2 Flavonoid trong vỏ quả các loài Citrus (citroflavonoid)

Thành phần flavonoid chính có trong vỏ quả của các loài Citrus là các flavan glycosid

của chúng [9], [23] Một số flavonoid gồm các flavan aglycon gồm naringenin, isosakuranetin, hesperitin, và eriodictyol, còn các glycosid của chúng đa số có đường gắn với cacbon ở vị trí

số 7 (Hình 2) Trong số các flavan, naringenin, hesperitin và các glycosid của chúng là

naringin, hesperidin là các thành phần chính của vỏ quả các loài Citrus [26], [27] Các chất này

chiếm hàm lượng rất lớn, có thể tới 5−10% tính theo vỏ quả khô [28], và chiếm tới hơn 90%

flavonoid toàn phần trong vỏ quả Citrus [23], [24], [25], [26], [27] Trong nhiều loài Citrus,

các glycosid naringin và hesperidin có nhiều trong quả nhưng lại không tìm thấy dạng aglycon của chúng [28], [29] Điều đặc biệt là narigenin, naringin, hesperitin, và hesperidin có hàm

lượng lớn trong các loài thuộc chi Citrus nhưng lại rất hiếm gặp ở các chi và họ khác [9] Vì vậy, chúng được coi là các flavonoid đặc trưng của chi Citrus, và được gọi là citroflavonoid Các flavon cũng có thấy ở các loài Citrus, nhưng trong vỏ quả thì có hàm lượng thấp hơn

nhiều [23], [26], [27], [28] Thường gặp là apigenin, luteolin, diosmetin, nobiletin, tangeretin, sinensetin và glycosid của diosmetin là diosmin và neodiosmin (Hình 3) Trong số này, diosmetin, nobiletin, và diosmin có hàm lượng cao, còn quercetin và rutin cũng hay gặp trong

quả Citrus nhưng có hàm lượng thấp [23], [29]

Các anthocyanin là các chất màu quan trọng trong quả của các loài Citrus, đặc biệt là các

loài cam, quít, quất [25], [26] Thông thường thi khi quả chín sẽ có hàm lượng anthocianidin cao, do đó vỏ quả từ xanh sẽ chuyển sang màu vàng, màu cam, hoặc đỏ Các anthocyanin

thường thấy trong chi Citrus là cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin [30]

2 4 5

7

1'

3' 4'

7

1'

3' 4'

2 4 5

7

1'

3' 4'

2 4 5

7

1'

3' 4'

O HO

HO

OH O

O HO

7

1'

4'

O HO

7

1'

4'

O HO

HO

OH O

O HO

2 4 5

7

1'

3' 4'

O HO

HO

O

Neohesperidin OH

O

OH HO

HO

H3C

O

OH HO HO

H3C

OH HO

2 4 5

7

1'

3' 4'

O HO

HO

OH O

O HO

2 4 5

7

1'

3' 4'

O HO

7

1'

3' 4'

O HO

HO

OH O

7

1'

3' 4'

O HO

Hình 3 Flavonoid nhóm flavon và flavonon có trong vỏ quả các loài Citrus

3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CITROFLAVONOID

Như đã trình bày ở trên, flavonoid là một trong những thành phần hóa học chính của các

loài Citrus Các citroflavonoid cũng giống như các flavonoid nói chung, có rất nhiều tác dụng

sinh học đã được biết Dưới đây nhóm tác giả liệt kê những tác dụng có nhiều ý nghĩa trong việc sử dụng chúng làm thuốc trong y học

3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Các flavonoid có nhóm hydroxy (OH) gắn với vòng thơm có tác dụng chống oxy hóa [31]

Nếu flavonoid có nhóm catechin (nhóm o-dihydroxy), hay có một nhóm OH ở vị trí số 3 và số

5 (Hình 4) sẽ cho tác dụng chống oxy hóa mạnh [31], [32] Các nhóm này có tác dụng loại bỏ

các gốc tự do trong của cơ thể, như các gốc tự do superoxid (O2-●), hydroxy (OH●), lipid peroxyl (LOO●), lipid alkoxyl (LO●), oxyd nitric (NO●) Các gốc tự do là nguyên nhân gây ra quá trình oxy hóa trong cơ thể, chúng có thể gây ra sự oxy hóa lipid, protein và kể cả DNA [33] Khi các quá trình oxy hóa xảy ra nhiều trong cở thể, chúng sẽ gây ra sự phá hủy các tế bào và do đó dẫn đến bệnh tật

Hình 4 Các nhóm chức đem lại tác dụng chống oxy hóa mạnh cho flavonoid

Các Citrus flavonoid, vì vậy, có tác dụng chống oxy hóa mạnh [24], [25] Thông thường

thì các aglycon flavonoid có tác dụng mạnh hơn các glycosid của chúng [32] Chúng giúp cơ thể chống lại sự oxy hóa lipid, protein và DNA gây ra bởi các gốc tự do

minh có tác dụng chống viêm [35], [36] Trên mô hình in vivo, diosmin [25] và hesperidin [37]

có tác dụng ức chế quá trình viêm gây ra bởi carragenin trên chuột

3.4 Chống các bệnh tim mạch

Vì có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol trong máu, và tác dụng chống viêm nên các citroflavonoid có tác dụng phòng và chống các bệnh về tim mạch Làm bền thành mạch, chống oxy hóa các lipoprotein và chống viêm đã đem lại tác dụng chống vữa xơ động mạch, một bệnh rất hay gặp ở người cao tuổi và người béo phì Các citroflavonoid còn có tác dụng chống kết dính tiểu cầu và tăng tính thấm của mao mạch [36] Đây là một tác dụng quan trọng của flavonoid vì nó giúp thành mạch bền vững hơn và nó chống các rối loạn thành mạch như vữa

xơ động mạch, nhồi máu cơ tim, viêm tĩnh mạch gây tê đau tay chân, trĩ [33], [34] Những tác dụng trên cũng góp phần làm giảm một số triệu chứng các bệnh về não như bệnh mất trí nhớ, Alzheimer và Parkinson [36] Các công ty dược phẩm trên thế giới đã dựa trên tác dụng này của citroflavonoid để làm thuốc chữa bệnh Một số sản phẩm lưu hành trên thị trường được liệt

kê ở phần dưới đây

3.6 Các sản phẩm thuốc trên thị trường có hoạt chất là các citroflavonoid

Các công ty Dược phẩm hàng đầu thế giới của nước Pháp đã đưa ra một số sản phẩm có hoạt chất là các citroflavonoid như Daflon, Diosmin, Flebosmin, Cemaflavone, Circularine Trong đó, sản phẩm Daflon, dạng bào chế là viên bao phim, của công ty Dược phẩm Servier, Pháp là nổi tiếng nhất và bán được nhiều nhất Thành phần chính của thuốc Daflon là phân

đoạn flavonoid chiết xuất từ vỏ quả của các loài Citrus, hàm lượng 500 mg (bao gồm diosmin

450 mg và flavonoid tương đương với 50 mg hesperidin) Thuốc có tác dụng làm tăng trương lực của tĩnh mạch, giảm ứ trệ ở tĩnh mạch, tăng sức bền ở mao mạch, được dùng điều trị các bệnh suy tĩnh mạch bạch huyết (nặng chân, đau chân, bứt rứt, đau chân, phù chân) và điều trị các triệu chứng của bệnh trĩ Thuốc Daflon đã được lưu hành ở Việt Nam từ lâu và bán rất chạy trên thị trường

Hiện tại chưa có sản phẩm nào có thành phần là các flavonoid chiết xuất từ vỏ của các loài

Citrus được sản xuất bởi các công ty dược phẩm Việt Nam trong khi chúng ta có nhu cầu rất

lớn về các thuốc này

4 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VỀ CITROFLAVONOID

Các nghiên cứu trong nước về chi Citrus lại chủ yếu về tinh dầu, dinh dưỡng, trồng trọt

để tăng giá trị kinh tế Vẫn còn có ít nghiên cứu về các citroflavonoid

Năm 1990, Nguyễn Thị Chung đã có nghiên cứu về chiết xuất và bào chế các flavonoid

từ vỏ quả của một số loài Citrus ở Việt Nam ở qui mô nhỏ [39] Gần đây, Võ Văn Lèo đã thực hiện luận án nghiên cứu về các loài Citrus thu hái ở miền nam Đây là nghiên cứu sâu và toàn

diện về thành phần citroflavonoid [40] Tác giả đã công bố một số kết quả chính thu được sau đây: (1) Phân lập được từ vỏ bưởi hai flavonoid glycosid hesperidin và naringin Các aglycon của chúng là hesperidin và naringin thu được bằng cách thủy phân hai glycosid tương ứng Xây dựng được qui trình chiết xuất quy mô phòng thí nghiệm hai flavonoid glycosid này (2) Phân lập được 5 chất thuộc nhóm polymethoxyflavon là 7-hydroxy-3,3,4,5,6,8-hexamthoxyflavon, nobiletin, 5-O-desmethylnobiletin, sinensetin, tangeretin Hai chất có hàm

lượng rất cao trong vỏ quả Citrus là nobiletin và tangeretin (3) Xây dựng được phương pháp

định lượng hai thành phần citroflavonoid chính là naringin và hesperidin trong vỏ quả các loài

Citrus bằng các phương pháp điện di mao quản (CE), đo quang (UV-VIS), và sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC) Các kết quả khẳng định rằng hàm lượng hesperidin và naringin trong các loài chanh, bưởi là rất cao, thấp nhất là 2,8%, thông thường là khoảng 5−10%, và đặc biệt quả thanh bì thu hái ở Tiền Giang có hàm lượng hesperidin tới tận hơn 23%

Tác giả Nguyễn Văn Tựu đã chiết xuất hesperidin với hiệu suất khá cao và đã đưa ra được tiêu chuẩn cho dược liệu vỏ quít [41] Đây là tiêu chuẩn cho dược liệu dùng trong Y học

cổ truyền, còn được gọi với tên khác là trần bì

5 CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID

Thông thường để chiết xuất flavonoid nói chung từ dược liệu, người ta thường dùng qui trình sau đây (Hình 5) Theo qui trình này thì sau khi chiết với cồn (EtOH), tất cả các chất từ ít

phân cực và phân cực đều được chiết và hòa tan vào dung môi cồn Sau khi lắc với n-hexan để

loại chất béo và chất ít phân cực (sẽ ở phân đoạn 1), lắc tiếp phân đoạn nước với ethyl acetate (EtOAc) rồi cô cạn dung môi EtOAc sẽ cho phân đoạn flavonoid toàn phần Phân đoạn flavonoid toàn phần sẽ chứa cả flavonoid dạng aglycon và dạng glycosid Tuy nhiên trong phân đoạn này vẫn còn có nhiều tạp chất ít phân cực khác và hàm lượng flavonoid glycosid sẽ thấp vì vẫn còn có rất nhiều glycosid vẫn ở trong phân đoạn nước [9]

Hình 5 Qui trình (I) chiết xuất flavonoid từ dược liệu

Còn một cách khác để chiết flavonoid như trong qui trình II (Hình 6) Ở qui trình này, thì các chất có độ phân cực kém đã bị loại bỏ từ đầu Do đó dịch chiết EtOAc sẽ có các chất phân cực vừa phải, vì EtOAc là một dung môi có độ phân cực trung bình Như vậy nếu muốn chiết flavonoid glycosid thì qui trình II sẽ cho hiệu suất thấp hơn qui trình I, bởi vì chỉ có rất ít flavonoid glycosid tan trong EtOAc Cả hai qui trình I và II đều là các qui trình nghiên cứu

trong phòng thí nghiệm, sử dụng các dung môi độc hại, đắt tiền (n-hexan, CHCl3, EtOAc) và

có hiệu suất chiết xuất không cao Các qui trình này chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu, chiết tách và phân lập flavonoid từ dược liệu

Tác giả Võ Văn Lẹo có đưa ra 3 qui trình chiết xuất hesperidin và naringin [40] là chiết ngấm kiệt hoặc chiết nóng với cồn (Hình 7, qui trình III) và chiết với nước nóng (Hình 8, qui trình IV) Qui trình III tương tự như qui trình I, nhưng có ưu điểm không dùng các dung môi là

CHCl3 và EtOAc, là các dung môi độc hại không được phép sử dụng trong công nghiệp dược phẩm Nếu hàm lượng flavonoid trong dược liệu cao thì có thể kết tinh dễ dàng chứ không cần phải loại tạp [40] Tuy nhiên, nếu để kết tinh thì sẽ cho hiệu suất thấp và nhiều đường khác cũng có thể kết tinh theo Tác giả Nguyễn Văn Tựu cũng đã chiết xuất hesperidin với hiệu suất khá cao từ dược liệu vỏ quít [41], tuy nhiên, qui mô của qui trình này là trong phòng thí nghiệm (1 kg/mẻ)

Theo qui trình IV thì các flavonoid được chiết bằng nước nóng rồi sau đó loại tạp bằng cách thêm cồn và lọc Qui trình này cũng có ưu điểm là không sử dụng các dung môi độc hại

và đơn giản, nhưng nhược điểm của nó lại là tốn nhiều năng lượng để đun sôi nước và để bay hơi dung môi Nếu chiết xuất ở qui mô lớn, việc này sẽ có thể làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm do tiếp xúc với nhiệt độ cao và làm tăng giá thành sản phẩm do cần nhiều năng lượng Mặt khác có nhiều flavonoid có độ phân cực thấp nên sử dụng dung môi là nước sẽ không cho hiệu suất cao

Hình 6 Qui trình (II) chiết xuất flavonoid từ dược liệu

thu hồi dung môi

chiết với EtOAc thu hồi dung môi

Hình 7 Qui trình (III) chiết xuất flavonoid từ vỏ bưởi

Hình 8 Qui trình (IV) chiết xuất flavonoid từ vỏ bưởi

Theo GS Nguyễn Văn Đàn, flavonoid có thể được chiết xuất bằng nước vôi trong [42]

Vì nước vôi có tính kiềm, flavonoid có tính acid nên có thể flavonoid có thể tan trong môi trường kiềm, sau đó trung hòa lại bằng acid sẽ được flavonoid không tan, lọc lấy tủa được flavonoid thô Phương pháp này được áp dụng để chiết xuất các flavonoid có tính acid mạnh,

có độ phân cực lớn như rutin từ hoa hòe, polyphenol trong chè

Dược liệu

chiết với cồn

thu hồi dung môi

Phân đoạn Ether

Tủa flavonoid thô

lắc với ether dầu hỏa

Cao lỏng

Tạp chất

để lạnh dịch lọc

nước sôi, loại tạp, lọc thu hồi dung môi

6 VẤN ĐỀ TỒN TẠI CẦN GIẢI QUYẾT

Trước hết có thể thấy rằng nguồn nguyên liệu vỏ quả các loài Citrus ở Việt Nam là rất

sẵn có, phong phú, sản lượng nhiều, quanh năm, ở các vùng trong cả nước Tuy nhiên, việc tận dụng nguồn nguyên liệu này để sản xuất thuốc thì mới chỉ có trong y học cổ truyền, chưa có ứng dụng trong sản xuất công nghiệp Phần rất lớn nguồn nguyên liệu bị vứt bỏ Nếu tận dụng được, chúng ta có thể sản xuất trong nước mà không phải nhập khẩu thuốc hay nguyên liệu làm thuốc nữa

Thực tế thì vẫn còn ít nghiên cứu về qui trình chiết xuất các citroflavonoid ở Việt Nam Các qui trình đã được nêu trong phần tổng quan là các qui trình được áp dụng trong nghiên cứu

cơ bản ở mô hình phòng thí nghiệm, được xây dựng thông qua các nghiên cứu cơ bản phục vụ luận văn tốt nghiệp, luận án tốt nghiệp Không thể áp dụng trực tiếp được các qui trình cho qui

mô công nghiệp Nếu muốn có qui trình sản xuất ở qui mô công nghiệp thì phải có nghiên cứu đầy đủ, từ nguồn nguyên liệu, lựa chọn hoạt chất, lựa chọn nguyên liệu, qui trình chiết xuất, hiệu suất chiết xuất, hàm lượng các citroflavonoid trong sản phẩm, hiệu quả kinh tế…

Vấn đề cần giải quyết ở đây là qui trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid ở qui mô công nghiệp để có thể áp dụng cho sản xuất lớn Trong đề tài này, chúng tôi đặt mục tiêu chiết xuất citroflavonoid ở qui mô pilot (≥ 100 kg/mẻ) Nó đòi hỏi chúng ta phải đầu tư nghiên cứu phát triển từ các qui trình đã nêu trên đây Các vấn đề cần giải quyết là lựa chọn dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dược liệu, dung môi, phương pháp loại tạp chất Vấn đề kiểm soát chất lượng của sản phẩm cũng rất quan trọng vì mục tiêu là có sản phẩm cho sản xuất thành phẩm phòng, chữa bệnh Do đó, việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào, tiêu chuẩn hóa và độ ổn định của sản phẩm cũng là các nội dung cần giải quyết của đề tài

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là vỏ quả của các loài Citrus thu hái tại Việt Nam và các hoạt chất

flavonoid của chúng

2 NGUYÊN LIỆU

2.1 Nguyên liệu cho chiết xuất

Sau khi khảo sát các loài trên về nguồn liệu, hàm lượng citroflavonoid, chiết xuất

citroflavonoid ở qui mô nhỏ, vỏ quả của một (hoặc vài) loài Citrus sẽ được lựa chọn cho

nghiên cứu về xây dựng qui trình công nghệ ở qui mô pilot

2.2 Dung môi, hóa chất

Các dung môi hóa chất dùng cho nghiên cứu ở qui mô phòng thí nghiệm và chiết xuất ở qui mô pilot là các dung môi công nghiệp Cồn được sử dụng là cồn công nghiệp ethanol 96% đạt tiêu chuẩn VN III (cục đo lường tiêu chuẩn VN), được mua của các công ty phân phối trong nước Nước dùng cho chiết xuất đạt tiêu chuẩn về độ sạch trong sinh hoạt (nước máy)

Các dung môi, hóa chất, nguyên liệu dùng cho xây dựng tiêu chuẩn cơ sở đạt tiêu chuẩn phân tích, kiểm nghiệm được mua của hãng Merck: các dung môi cho HPLC (acetone,

acetonitril, n-butanol, chloroform, ethanol, ethyl acetate, n-hexane, n-propanol, các loại hệ

đệm), silica gel cho sắc ký lớp mỏng pha thuận (silica gel F254) và pha đảo (RP-18 F254) cột sắc

ký HPLC pha đảo, các hóa chất khác)

Các dung môi, hóa chất sử dụng cho thử tác dụng sinh học, kit định lượng, hoá chất xét nghiệm, và làm tiêu bản mô bệnh học đều đạt tiêu chuẩn cho thử tác dụng sinh học và được mua của các hãng hóa chất có uy tín Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Đức), Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo)

2.3 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng Swiss thuần chủng, trưởng thành, 18-22 g, được mua của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (Bộ Y tế)

Thỏ chủng Newzealand white, cả hai giống (đực và cái), khoẻ mạnh, lông trắng, trọng

lượng 1,8 – 2,5 kg do Trung tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây cung cấp Động vật thực nghiệm được nuôi 3 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu bằng thức

ăn chuẩn riêng cho từng loại (do Công ty liên doanh Guyomarc’h-VCN cung cấp) tại phòng thí nghiệm của bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội

Động vật thí nghiệm sau khi mua về được nuôi tại phòng nuôi động vật của Viện Dược liệu 5-7 ngày trước khi tiến hành làm thí nghiệm Điều kiện của phòng nuôi động vật đạt tiêu chuẩn thí nghiệm sinh học Phòng được bật điện sáng 10-12 giờ/ngày (từ 8 giờ sáng đến 6-8 giờ tối)

3 THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.1 Thiết bị sử dụng cho điều tra, khảo sát các loài Citrus

- Dao, kéo, túi, giầy, báo, dây buộc

- Phim ảnh, máy ảnh

- Hóa chất, dung môi xử lý mẫu

- Các mẫu tiêu bản gốc (tại Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu)

- Các tài liệu về phân loại thực vật của Việt Nam và thế giới

3.2 Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu qui mô phòng thí nghiệm

- Bếp cách thủy các cỡ: cho bình chiết từ 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1 lít, 2 lít, 3 lít đến 10 lít, 20 lít

- Máy cất quay thu hồi dung môi các cỡ: dung tích bình cất từ 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1 lít, 2 lít, 3 lít đến 10 lít, 20 lít

- Thiết bị chiết Sohxlet các cỡ: dung tích từ 250ml, 500ml đến 5 lít

- Thiết bị chiết cách dầu: dung tích bình chiết 30 lít

- Cột sắc ký các loại

- Máy xay dược liệu

- Tủ sấy thường dung tích 100 lít (Binder – FD 115)

- Tủ sấy chân không dung tích 20 lít

- Các loại cân phân tích

- Máy đo độ ẩm (Precisa HA60)

- Máy ly tâm

- Máy đo quang phổ tử ngoại UV-VIS (Varian)

- Máy đo quang phổ hồng ngoại IR

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Bruker 500 MHz, Viện Hóa học, VAST)

- Máy đo phổ khối MS (Agilent, Viện Hóa sinh biển)

- Máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout- Italya

- Máy phân tích máu tự động SYSMEX KX21- Mỹ

3.4 Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ở qui mô pilot

Dây chuyền chiết xuất dược liệu sẵn có tại Viện Dược liệu, gồm có :

- Nồi hơi dầu công suất 500 kg hơi/ giờ

- Máy xay dược liệu

- Máy xay bột thuốc

- Kho lạnh để bảo quản sản phẩm chiết xuất

- Cột sắc ký 15cm×60cm

- Dây chuyền chiết xuất Công suất đạt 100−170 kg dược liệu/mẻ

+ 02 Bình chiết có dung tích 1000 lít

+ 01 Bình trung gian để đựng dung môi 1000 lít

+ 01 Bình cô dịch chiết dung tích 1000 lít

+ 01 Bơm đảo dịch chiết

+ 01 Bơm chân không

+ Hệ thống sinh hàn bằng máy làm lạnh

+ 01 Tủ sấy chân không dung tích 3 m3

3.5 Thiết bị sử dụng cho kiểm nghiệm

- Cân phân tích (Shimadzu, Nhật)

- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, Shimadzu, Nhật)

- Máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC, Camag, Đức)

- Máy đo độ hấp thụ quang phổ tử ngoại (UV-VIS, Shimadzu, Nhật)

- Máy đo độ ẩm (Precisa HA60)

- Bộ chiết Soxhlet

- Tủ sấy

- Kính hiển vi điện tử có gắn máy chụp ảnh

- Phần mềm Excel (Microsoft Office)

3.5 Thiết bị sử dụng cho thử tác dụng sinh học

- Máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động (Scout, Italy)

- Máy phân tích máu tự động (SYSMEX KX21, Japan)

- Máy ly tâm lạnh (Hettich- Germany)

- Máy đo quang UV-VIS (Shimazdu, Japan)

- Máy cắt vi phẫu, tiêu bản

- Máy Screen master (Hospitex Diagnostics, Italy)

- Kính hiển vi điện tử có chức năng chụp ảnh (Canon, Japan)

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu các loài thuộc chi Citrus

- Điều tra, thu thập thông tin theo phương pháp phỏng vấn trực tiếp (theo phiếu điều tra)

- Điều tra, thu thập mẫu theo Quy trình điều tra dược liệu của Bộ Y tế [43], có sửa đổi và

4.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng các citroflavonoid

- Xây dựng phương pháp định tính các citroflavonoid trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [45]

- Xây dựng phương pháp định lượng citroflavonoid toàn phần bằng phép đo quang VIS) và bằng HPLC [45]

(UV Việc xây dựng phương pháp dựa trên các nghiên cứu khảo sát:

+ Xây dựng qui trình xử lý mẫu, chiết xuất và tinh chế mẫu trước khi đo UV hoặc bơm vào máy HPLC

+ Lựa chọn điều kiện sắc ký

+ Khảo sát khoảng tuyến tính của phép định lượng

+ Khảo sát độ lặp lại của phương pháp

+ Khảo sát độ đúng của phương pháp

- Các hoạt chất có tác dụng chính phân lập ở trên được sử dụng làm chất đối chiếu để định tính và định lượng:

+ Hàm lượng citroflavonoid toàn phần

+ Hàm lượng hesperidin

+ Hàm lượng naringin

4.3 Xây dựng qui trình chiết xuất citroflavonoid qui mô phòng thí nghiệm [42], [46], [47]

- Xây dựng quy trình chiết xuất dựa trên các khảo sát về dung môi dùng để chiết xuất, kích thước dược liệu phù hợp, tỷ lệ giữa dược liệu và dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, năng lượng cần đủ

- Loại tạp chất (chất béo, muối hữu cơ, ion vô cơ, đường tự do, protein ) bằng phương pháp và dung môi phù hợp

- Chọn phương pháp loại dung môi và sấy phù hợp để khống chế nhiệt độ và thời gian hoạt chất tiếp xúc với nhiệt

- Quy mô mẻ chiết: 1 kg dược liệu/mẻ

- Tiêu chí đánh giá qui trình: hiệu suất chiết xuất, hàm lượng citroflavonoid trong sản phẩm chiết xuất, tính khả thi của qui trình (dùng dung môi ít độc, rẻ tiền, quy trình đơn giản dễ áp dụng cho sản xuất quy mô lớn)

- Khảo sát độ ổn định của qui trình chiết xuất về hiệu suất chiết xuất, hàm lượng citroflavonoid trong sản phẩm dựa trên ít nhất 06 mẻ chiết

4.4 Triển khai các quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid ở qui mô pilot [48]

- Áp dụng qui trình chiết xuất đã xây dựng ở quy mô phòng thí nghiệm với khối lượng

mẻ chiết lớn hơn (≥ 100 kg/mẻ) trên dây chuyền thiết bị quy mô pilot

- Điều chỉnh các thông số kỹ thuật phù hợp để đạt hiệu quả chiết xuất cao, tiết kiệm được dung môi và năng lượng

- Khảo sát độ ổn định của qui trình chiết xuất về hiệu suất chiết xuất, hàm lượng citroflavonoid trong sản phẩm dựa trên ít nhất 06 mẻ chiết

4.5 Phân lập các hoạt chất flavonoid chính làm chất đối chiếu [42], [46], [47]

- Chiết xuất phân đoạn chứa citroflavonoid từ dược liệu bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau

- Phân lập các flavonoid bằng các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột pha thường (silica gel), sắc ký cột pha đảo (YMC, RP-18, ODS), cột Sephadex LH-20, cột trao đổi ion (diaion HP-20)

- Tinh chế các flavonoid phân lập được bằng phương pháp kết tinh lại, bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), hoặc phương pháp thích hợp khác

- Khẳng định công thức hóa học của các chất chiết được dựa trên các tính chất hóa-lý (trạng thái, màu sắc, nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực []D) và các phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), cộng hưởng từ hạt nhân (1H, 13C NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân

hai chiều (HMBC, HMQC, COSY, NOESY), phổ khối (MS), và các phương pháp hóa học nếu cần

4.6 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả Citrus và sản phẩm bột

citroflavonoid [45]

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả Citrus dựa trên các chỉ tiêu chung

được qui định tại dược điển Việt Nam IV gồm: mô tả cảm quan, soi bột, vi phẫu, độ ẩm dược liệu, tro toàn phần, tro không tan trong acid, định tính, định lượng

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm bột citroflavonoid gồm mô tả chế phẩm, độ

ẩm, tro toàn phần, định tính bằng sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) theo qui định tại dược điển Việt Nam IV, định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

4.7 Phương pháp thử tác dụng sinh học của bột citroflavonoid

4.7.1 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của các sản phẩm

Tác dụng loại bỏ các gốc tự do DPPH (viết tắt của 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), hydroxyl radical (OH●), superoxyde (O2−●) bằng phương pháp đo quang (UV-VIS) Các bước tiến hành được mô tả cụ thể dưới đây

Khả năng dọn gốc tự do DPPH được tính toán theo công thức:

IDPPH (%) = [(Ao – Am)/Ao]×100 Trong đó: IDPPH (%): Khả năng dọn gốc tự do DPPH của mẫu thử; Ao: Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch DPPH (không chứa dịch chiết); Amt: Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của mẫu thử (mẫu thử trong dung dịch DPPH)

b) Thử hoạt tính loại bỏ gốc tự do superoxide anion (O 2 −● )

Cho vào ống nghiệm hỗn hợp gồm có: 5 l dung dịch mẫu thử, 470 l dung dịch đệm phosphat (Na2HPO4, 20 mM, pH 7,8), 10 l dung dịch xanthin (5 mM), 10 l dung dịch NBT (5 mM), và cuối cùng cho 5 l dung dịch enzym XO Trộn đều hỗn hợp trong khoảng 1 phút rồi để yên trong 5 phút tiếp theo ở điều kiện thường Dung dịch thu được đem đo mật độ quang (Am) ở bước sóng 560 nm (có thể chọn 550 nm) Tiến hành đo mật độ quang của mẫu cùng với mẫu trắng để so sánh (không có chất thử và không cho enzym XO), dung dịch chỉ có chất thử (Amt, 10 l dung dịch mẫu trong 490 l dung dịch đệm), dung dịch phản ứng không cho mẫu (Ao), và mẫu đối chứng dương Lặp lại thí nghiệm 3 lần, kết quả là trung bình của 3 lần thí nghiệm

Hoạt tính ức chế của mẫu thử được tính theo công thức:

IXO (%) = [(Ac – Am)/Ac]×100 Trong đó: IXO (%): khả năng dọn gốc tự do superoxide anion, Ac: Độ hấp thụ (OD) của mẫu chứng, Am: Độ hấp thụ (OD) của mẫu thử [49]

c) Thử hoạt tính loại bỏ gốc tự do superoxide anion (OH ● )

Cho vào ống nghiệm hỗn hợp gồm có: 450 l dung dịch đệm phosphat (Na2HPO4, nồng

độ 20 mM, pH 7,4), 10 l dung dịch đường deoxyribose (nồng độ 140 mM), 10 l dung dịch

Fe3+(FeCl3, 5 mM), 10 l dung dịch acid ascobic (5 mM), 10 l dung dịch H2O2 (500 mM), và

10 l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ cần thử Trộn hỗn hợp trong khoảng 1 phút rồi để yên trong 30 phút ở bóng tối, nhiệt độ thường Dung dịch sau khi phản ứng được cho thêm 250 l dung dịch TCA 20% và 250 l dung dịch TBA 1%, sau đó đem đung sôi cách thủy trong khoảng 15 phút Hỗn hợp thu được để nguội đến nhiệt độ thường rồi đem đo mật độ quang (Am) ở bước sóng 532 nm (có thể chọn ánh sáng có bước sóng trong khoảng 530-535 nm) Tiến hành đo mật độ quang của mẫu cùng với mẫu trắng để so sánh (không có chất thử và không cho

Fe3+), dung dịch chất thử trong dung dịch đệm (Am, 10 l dung dịch mẫu thử, 490 l dung dịch đệm), dung dịch phản ứng không cho mẫu thử (Ao, 480 l dung dịch đệm phosphat, 10 l dung dịch đường deoxyribose, 10 l dung dịch Fe3+), và mẫu đối chứng dương Lặp lại thí nghiệm 3 lần, kết quả là trung bình của 3 lần thí nghiệm

Khả năng dọn gốc tự do OH• của mẫu thử (cho cả chất đối chiếu dương) được tính theo công thức:

IOH (%) = [(Ac – Am)/(Ac)]×100 Trong đó: IOH (%): Khả năng dọn gốc tự do OH•; Ac: Độ hấp thụ (OD) của mẫu chứng; Am: Độ hấp thụ (OD) của mẫu thử [50]

d) Xác định tác dụng chống oxy hóa lipid

Chuột thí nghiệm

Chuột Swiss thuần chủng, trưởng thành, cả đực vào cái, nặng 18-22 g Chuột được mua

ở Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (Bộ Y tế), được nuôi trong nhà nuôi động vật của Viện Dược liệu 1 tuần trước khi thí nghiệm Trong thời gian này, chuột được cho uống nước và ăn thức ăn bình thường

Tách lipid từ não chuột

Trước khi thí nghiệm 24 giờ, chuột chỉ được uống nước mà không được ăn thức ăn Để lấy não chuột, giết chuột bằng ete rồi dùng dao mổ đầu, bóc xương sọ để lấy não, rửa sạch máu bằng dung dịch NaCl 0,9% lạnh (<4 0C) Thu não của toàn bộ chuột đem nghiền thành đồng thể với dung dịch đệm Na2HPO4 (20 mM, pH 7,4, nhiệt độ của dung dịch < 4oC) theo tỷ lệ 1:9 Sau khi nghiền kỹ, não đồng thể được đem ly tâm ở 9000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ

4oC Lấy phần hỗn dịch phía trên có chứa lipid để làm thí nghiệm tiếp theo Hỗn dịch này có thể bảo quản ở -80oC đến khi làm thí nghiệm, thời gian bảo quản kéo dài được 1 năm Ngay trước khi dùng làm thí nghiệm, hỗn dịch chứa lipid não chuột được làm lạnh đến 4o

C, trộn đều,

kỹ Xác định nồng độ protein trong hỗn dịch bằng phương pháp BCA rồi pha loãng để đạt nồng

độ 100mg/ml

Xác định khả năng chống oxy hóa

Trong một dung dịch phản ứng gồm có 440 l dung dịch đệm Na2HPO4 (20 mM, pH 7,4), cho thêm 50 l hỗn dịch lipid não chuột, 5 l vitamin C, và 5 l dung dịch Fe2(SO4)3 Hỗn hợp được ủ cách thủy ở 37oC trong 1 giờ rồi cho vào hỗn hợp 250 ml dung dịch TCA 20%

để dừng phản ứng Ly tâm dịch thu được ở 5000 vòng/phút trong 10 phút Lọc lấy dịch trong và thêm vào dịch 250 ml dung dịch TBA 1%, rồi đem đun cách thủy hỗn hợp phản ứng trong 15 phút Hỗn hợp hiện màu hồng được làm lạnh đến nhiệt độ thường và đo độ hấp thụ ở bước sóng 532 nm Song song làm các mẫu đối chứng dương (vitamin E, (+)-catechin), mẫu trắng (mẫu có hỗn hợp phản ứng gồm lipid trong dung dịch đệm), và mẫu chứng (mẫu gồm tất cả hỗn hợp phản ứng, trừ chất thử) Lặp lại thí nghiệm 3 lần, kết quả là trung bình của 3 lần thí nghiệm

Khả năng chống oxy hóa lipid của mẫu thử và chất đối chiếu dương được tính theo công thức:

ILP (%) = [(Ac – Am)/Ac]×100 Trong đó: ILP là khả năng chống oxy hóa lipid của mẫu thử Ac: Độ hấp thụ (OD) của mẫu chứng, Am: Độ hấp thụ (OD) của mẫu thử [48-50]

e) Tác dụng chống oxy hóa Lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL)

Tiến hành

Tác dụng chống oxy hóa LDL của sản phẩm được tiến hành như sau [49]: 495 l phosphate buffer saline (PBS, 10 mM, pH 7,4) có chứa LDL (nồng độ 100 g protein/ml) được chuẩn bị sẵn, thêm vào 5 l dung dịch CuSO4 0,5 mM (nồng độ cuối cùng là 5 M) Hỗn hợp phản ứng được ủ trong bồn cách thủy ở 37oC trong 3 giờ, rồi kết thúc phản ứng bằng cách thêm vào hỗn hợp phản ứng 50 l EDTA 10 mM và 50 l BHT 5 mM Sau đó thêm vào hỗn hợp 200

ml dung dịch TCA 20% và 200 ml TBA 1%, rồi đem đun sôi cách thủy hỗn hợp phản ứng trong 15 phút Hỗn hợp hiện màu hồng được làm lạnh, ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút Phần dung dịch bên trên của hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thụ ở bước sóng 532 nm Song song làm các mẫu đối chứng dương (vitamin E, (+)-catechin), mẫu trắng (mẫu có hỗn hợp phản ứng gồm lipid trong dung dịch đệm), và mẫu chứng (mẫu gồm tất cả hỗn hợp phản ứng, trừ chất thử) Lặp lại thí nghiệm 3 lần, kết quả là trung bình của 3 lần thí nghiệm

Khả năng chống oxy hóa lipid của mẫu thử và chất đối chiếu dương được tính theo công thức:

ILDL (%) = [(Ac – Am)/Ac]×100 Trong đó: ILDL là khả năng chống oxy hóa LDL của mẫu thử Ac: Độ hấp thụ (OD) của mẫu chứng; Am: Độ hấp thụ (OD) của mẫu thử

f) Tính toán và trình bày kết quả nghiên cứu

Ở tất cả các thí nghiệm trên, mỗi một mẫu chất tinh khiết phân lập được, sản phẩm bột citroflavonoid toàn phần, và chất đối chiếu dương được thử ở 5 nồng độ khác nhau, được lựa chọn phù thợp theo thực nghiệm Kết quả biểu diễn ở khả năng dọn gốc tự do hay chống oxy hóa lipid (%), và giá trị IC50 (Inhibitory concentration) Giá trị IC50 được hiểu là giá trị tại nồng

độ đó, chất thử dọn 50% lượng gốc tự do đối với tác dụng dọn gốc tự do, hay ức chế 50% sự oxy hóa lipid Đây là 1 giá trị lý thuyết, được tính từ kết quả của 5 nồng độ theo phương pháp Probit [51] Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, giá trị biểu diễn là giá trị trung bình ± SD

4.7.2 Thử độc tính cấp

Độc tính cấp của bột citroflavonoid được tiến hành theo phương pháp trong tài liệu [52],

và theo hướng dẫn của Bộ Y tế Giá trị LD50 được tính theo phương pháp Lichtfield-Wilcoxon [53]

- Chuột mua về được nuôi 3 ngày trước khi thí nghiệm để chuột thích nghi điều kiện thí nghiệm, được ăn thức ăn do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp, uống nước theo nhu cầu Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 16 giờ, để uống theo nhu cầu của chuột

- Đường dùng thuốc: đường uống, cho chuột uống bằng cách dùng bơm tiêm có kim đầu tù để đưa thuốc một cách nhẹ nhàng vào dạ dày chuột Mẫu thử được nghiền trong nước rồi pha thành hỗn dịch đến nồng độ thích hợp có thể bơm trực tiếp vào dạ dày chuột Chuột được cho uống với thể tích từ 0,2-0,4 ml dịch thử/10 g thể trọng chuột

- Chuột được chia thành các lô khác nhau, mỗi lô 10 con Các chuột trong cùng 1 lô được cho uống bột citroflavonoid cùng 1 liều Sau khi dò liều, tìm liều tối đa mà không có chuột nào của lô thí nghiệm chết (LD0) và liều tối thiểu để 100% chuột của lô thí nghiệm chết (LD100) Thử thêm 3-4 liều trung gian giữa 2 liều nói trên để xác định LD50 Tính kết quả LD50 theo phương pháp Lichtfield-Wilcoxon

- Thời gian theo dõi: chuột được để ở phòng thí nghiệm có khí hậu đảm bảo để mọi hoạt động của chuột bình thường Theo dõi và quan sát các biểu hiện về hành vi, hoạt động, ăn uống, bài tiết của chuột và số chuột sống chết trong 3 ngày Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử Trong trường hợp chuột chết sẽ mổ chuột để đánh giá tổn thương đại thể

4.7.3 Thử độc tính bán trường diễn

Độc tính bán trường diễn của bột citroflavonoid được thử trên thỏ theo phương pháp đã

mô tả trong tài liệu [54], [55] Thỏ được chia ngẫu nhiên làm 2 lô, mỗi lô 10 con, bố trí thí nghiệm các lô thỏ như sau:

- Lô thử thuốc (Lô 1): uống bột citroflavonoid với liều 600 mg/kg thể trọng thỏ/ ngày

- Lô đối chứng sinh lý (Lô 2): dùng để tham chiếu, nhằm xác định điều kiện môi trường và các điều kiện ngoại cảnh có thể gây ảnh hưởng đến tình trạng sức khoẻ của thỏ trong quá trình thí nghiệm

Mỗi ngày cho thỏ lô thử thuốc uống thuốc và lô thỏ chứng uống nước đun sôi để nguội

1 lần trong ngày, vào buổi sang với thể tích 4ml/kg thể trọng Thời gian uống thuốc liên tục trong 30 ngày, sau đó dừng uống thuốc và nuôi thỏ thêm 15 ngày nữa Lấy máu thỏ theo dõi đường tĩnh mạch tai , 4 lần để theo định lượng các chỉ số cần theo dõi

Các chỉ số theo dõi:

- Theo dõi chức năng gan:

 Định lượng AST, ALT theo phương pháp Reitman-Franker dùng cơ chất L-Aspartat và L-Alanin

 Định lượng Protein toàn phần bằng phương pháp Biuret

 Định lượng Bilirubin bằng phương pháp lên màu

- Theo dõi chức năng thận:

 Định lượng Creatinin bằng phương pháp Jaffe

 Định lượng Ure bằng phương pháp Rappoport dùng men Urease

- Theo dõi chức năng tạo máu:

- Phân tích số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, giá trị hematocrit, nồng độ hemoglobin

và % lympho bào trên máy phân tích máu tự động

- Xét nghiệm mô bệnh học:

 Cắt và đọc tiêu bản gan, thận sau 30 ngày dùng thuốc và sau 15 ngày ngừng thuốc

 Đơn vị thực hiện: Bộ môn giải phẫu bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội

- Đánh giá kết quả thí nghiệm:

So sánh sự thay đổi của các chỉ số sinh hoá, huyết học cũng như mô bệnh học của thỏ trước khi dùng thuốc và sau khi dùng thuốc của lô thỏ uống thuốc và lô thỏ chứng sau khi uống thuốc 15 ngày, 30 ngày và sau khi ngừng thuốc 15 ngày

4.7.4 Đánh giá tác dụng phòng chống vữa xơ động mạch

Tác dụng chống vữa xơ động mạch của sản phẩm bột citroflavonoid được thử trên thỏ Nguyên tắc là cho thỏ uống cholesterol để làm tăng mỡ máu của thỏ, do đó có thể gây ra sự thay đổi chức năng gan, làm thay đổi quá trình chuyển hóa lipid và dẫn đến bệnh vữa xơ động mạch

Chuẩn bị hỗn hợp dầu cholesterol

Đun nóng cách thuỷ dầu thực vật, cho cholesterol vào, khuấy đều cho tan hết đạt nồng

độ 20% dùng trong nghiên cứu [56]

Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu và chống vữa xơ động mạch

Mô hình gây tăng cholesterol máu ngoại sinh và gây xơ vữa mạch máu [56-58] Thỏ được chia thành 5 lô, mỗi lô 10 con với tỉ lệ đực/cái như nhau ở mỗi lô, các lô được uống thuốc trong 10 tuần như sau:

● Lô 1 (lô chứng sinh học, n = 10): hàng ngày thỏ chỉ uống nước cất với cùng thể tích nhóm uống thuốc

● Lô 2 (lô mô hình, n = 10): hàng ngày thỏ được uống hỗn hợp dầu cholesterol 1mL/kg thỏ, sau đó 2 giờ cho uống nước cất

● Lô 3 (lô uống atorvastatin, n = 10): hàng ngày thỏ được uống hỗn hợp dầu cholesterol liều 500 mg/kg, sau đó 2 giờ cho uống atorvastatin 5 mg/kg

● Lô 4 (lô uống citroflavonoid thấp, n = 10): hàng ngày thỏ được uống hỗn hợp dầu cholesterol, sau đó 2 giờ cho uống thuốc thử liều 200mg/kg

● Lô 5 (lô uống citroflavonoid cao, n = 10): hàng ngày thỏ được uống hỗn hợp dầu cholesterol liều 500 mg/kg, sau đó 2 giờ cho uống thuốc thử liều 500 mg/kg

Tiến hành cân kiểm tra trọng lượng thỏ ở tất cả các lô tại thời điểm trước, sau thí nghiệm hàng tuần Vào ngày đầu tiên sau 4 tuần, 8 tuần, và 10 tuần của thí nghiệm, thỏ trong các lô cho nhịn ăn qua đêm Lấy máu ngoại vi và tiến hành định lượng cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), high density lipoprotein–cholesterol (HDL-C), và low density lipoprotein–cholesterol (LDL-C) Tại thời điểm sau 8 tuần và 10 tuần uống thuốc, giết ngẫu nhiên 30% số động vật ở tất cả các lô để xét nghiệm đại thể, vi thể của động mạch chủ đoạn ngay trước khi đổ vào động mạch vành và tình trạng nhiễm mỡ của gan thỏ

4.7.6 Nơi thực hiện nghiên cứu

Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro của sản phẩm, thử độc tính cấp và bán trường diễn của bột citroflavonoid được thực hiện tại Khoa Dược lý sinh hóa, Viện Dược liệu

Các nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu, hạn chế xơ vữa mạch máu và các xét nghiệm sinh hoá định lượng các chất trong các nghiên cứu trên đều được thực hiện tại phòng xét nghiệm, Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội

Các xét nghiệm đánh giá giải phẫu bệnh học động mạch chủ và gan được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu và phát hiện sớm ung thư – Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật Việt Nam (do PGS.TS Lê Đình Roanh đọc kết quả)

PHẦN III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

1 ĐIỀU TRA, KHẢO SÁT, THU THẬP VÀ PHÂN TÍCH THÔNG TIN VỀ NGUỒN

NGUYÊN LIỆU CITRUS TẠI VIỆT NAM

1.1 Phạm vi điều tra

Nhóm thực hiện đề tài đã triển khai nhiều đợt điều tra thu thập thông tin và thu mẫu các

loài Citrus tại 16 tỉnh khắp 3 miền Bắc, Trung, Nam Bao gồm:

- Hà Nội và các vùng lân cận: Hà Nam, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Hòa Bình

- Các tỉnh miền núi phía Bắc: Thái Nguyên, Phú Thọ, Yên Bái, Sa Pa – Lào Cai, Tuyên Quang, Hà Giang

- Các tỉnh miền Trung: Nghệ An, Hà Tĩnh

- Các tỉnh miền Nam: Tp Hồ Chí Minh, Vĩnh Long, Bình Dương, và Đồng Nai

1.2 Thu thập tiêu bản và xác định tên khoa học của các loài Citrus

Các loài Citrus được thu thập phục vụ nghiên cứu sàng lọc cũng đồng thời được lưu

mẫu tiêu bản phục vụ công tác phân loại, giám định tên khoa học Tiêu bản được ép, sấy, tẩm hóa chất xử lý và lưu giữ, bảo quản tại phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu Tổng

số đã thu thập và xác định tên khoa học 83 tiêu bản của 8 loài Citrus (Chi tiết trong phụ lục 1

và 2)

Tuy đối tượng nghiên cứu chỉ khoanh vùng trong khoảng 6 loài Citrus được trồng phổ

biến và một số loài cùng chi để so sánh (Chấp, Phật thủ…) nhưng qua thực tế điều tra cho thấy mỗi loài lại gồm nhiều giống/ thứ rất đa dạng, đặc trưng cho điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng của từng vùng miền hoặc do con người lai ghép, tạo giống mà có:

Cam ngọt: vỏ quả nhẵn, khó bóc vỏ gồm có cam Vinh (ở Nghệ An), nay còn được trồng

ở Hưng Yên và các loài cam địa phương khác ở Hà Nam, Thái Bình, Nam Định có vị chua hơn

cam Vinh Các loại cam này đều thuộc loài Citrus sinensis (L.) Osbeck

Cam sành: vỏ quả sần sùi, dày; dễ bóc vỏ, quả to hơn cam ngọt, gồm có cam sành miền

nam, cam Bắc Quang (Hà Giang), cam Hàm Yên (Tuyên Quang) Tất cả đều thuộc loài Citrus nobilis Lour

Chanh: còn được gọi là Chanh ta, Chanh núm, Chanh hạt, có vị chua đậm Được trồng

phổ biến ở khắp nơi để lấy quả Tất cả đều thuộc loài Citrus aurantifolia (Christm & Panzer)

Swingle

Chanh tây, Chanh cali không hạt: (lấy giống từ Mỹ, được trồng ở Bình Dương) quả to

hơn loài trên, nhiều nước nhưng vị chua ít hơn, mùi thơm dịu, thuộc loài Citrus limon (L.)

Burm f

Bưởi: bao gồm nhiều giống như: bưởi chua, bưởi Diễn (Phú Diễn, Hà Nội), bưởi Đoan

Hùng (Đoan Hùng, Phú Thọ), bưởi Phúc Trạch (Hà Tĩnh), bưởi thanh (Đồng Nai), bưởi đường hồng (Đồng Nai), bưởi da xanh, bưởi năm roi (Bình Dương, Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Nai, Vĩnh Long) Tuy có khác nhau về hình thái, mùi vị nhưng tất cả các giống bưởi trên đều thuộc

một loài: Citrus grandis (L.) Osb

Quýt: Có 3 giống chính: loại quả vỏ nhẵn, dáng tròn (Quýt Sài gòn) và loại quả vỏ sần

hơn, dáng dẹt (Bắc Quang – Hà Giang, Hàm Yên – Tuyên Quang), và giống Quýt hôi quả nhỏ,

vị chua Qua phân tích cho thấy các loài quýt đều thuộc loài Citrus reticulata Blanco

Quất: Các giống Quất với tên gọi khác nhau như: Quất tết, Quất Mễ sở đều có tên

khoa học là Citrus japonica Thunb

Phật thủ: Có hình dáng quả đặc biệt với phần đầu quả phân thành nhiều thùy, khía như

bàn tay, thường dùng trong thờ cúng do có mùi thơm ngát Ngoài ra còn dùng làm thuốc trị ho,

viêm phế quản Qua phân loại cho thấy, đây là một thứ (variety) của loài Citrus medica L có tên khoa học là : Citrus medica L var sarcodactylis (Sieb.) Swingle

Thanh yên: Là loại quả cũng được sử dụng như phật thủ nhưng được phân biệt ở phần

đầu quả không phân thùy, tạo khía Đây cũng là một dưới loài (subspecies) của loài Citrus medica L., có tên khoa học là: Citrus medica L ssp bajoura Bonavia

Chấp: Quả có vỏ dày, vị đắng, chua, được dùng làm thuốc trong Y học cổ truyền với

tên vị thuốc là Chỉ xác Chấp được coi là một loài Cam đắng, có tên khoa học là Citrus aurantium L ssp ichangensis Guillaum

Cam canh: Trong các tài liệu phân loại hiện có [1-8] không thấy đề cập tới loài cam

Canh Qua phân tích sơ bộ cho thấy giống cam này cùng loài với quýt - Citrus reticulata

Blanco do đặc điểm vỏ quả mỏng (phần cùi trắng), dễ bóc vỏ

1.3 Kết quả thu mua nguyên liệu vỏ quả các loài Citrus

Đã thu hái và thu mua được tổng số 201 mẫu nguyên liệu của 6 loài là đối tượng nghiên

cứu chính Citrus để phục vụ nghiên cứu hóa học Mỗi loài được điều tra, thu mẫu tại 5 địa

điểm, mỗi địa điểm thu 3 mẫu/loài, mỗi mẫu gồm 2 loại quả: quả non và già

1/ 28 mẫu cam tại 5 địa điểm

2/ 29 mẫu cam sành tại 5 địa điểm

3/ 32 mẫu chanh tại 5 địa điểm

4/ 50 mẫu bưởi tại 8 địa điểm

5/ 32 mẫu quýt (9 số hiệu) tại 5 địa điểm

6/ 30 mẫu quất (5 số hiệu) tại 5 địa điểm

Ngoài ra còn thu mua được tổng số 23 mẫu của 5 loài và thứ khác:

+ 6 mẫu chanh tây tại 1 địa điểm

+ 3 mẫu chấp tại 1 địa điểm

+ 7 mẫu phật thủ và thanh yên tại 2 địa điểm

+ 7 mẫu cam canh tại 3 địa điểm

(Xem Danh sách mẫu của các loài Citrus đã thu mua phục vụ sàng lọc hóa học: từ Phụ lục 3

đến Phụ lục 12 của Chuyên đề 1)

Trong đó quả non và quả già được phân biệt như sau:

- Quả non: là quả còn nhỏ, chưa được thu hoạch để dùng hay bán; phần múi quả chưa phát triển đầy đủ, còn chiếm tỷ lệ nhỏ so với phần vỏ, tép chứa ít nước, quả thường có vị chua

- Quả già: là quả đã đạt tới kích thước gần tối đa, có thể thu hoạch để dùng hay bán; phần múi quả đã chiếm tỷ lệ lớn hơn, tép mọng nước, quả thường có vị ngọt hơn

Tuy nhiên sự phân biệt trên chỉ mang tính tương đối Trong một số trường hợp, quả non vẫn được thu hái để sử dụng như: quất xanh (quả ương), do loại quả xanh-ương thường có vị

chua, mùi thơm hắc, thích hợp làm nước giải khát hoặc pha canh rau, loại quả chín – màu vàng đẹp thường được bán trong ngày tết để bày mâm ngũ quả; Phật thủ quả xanh, non cũng được bán để bày mâm ngũ quả với giá rẻ hơn so với loại quả già

Các mẫu được thu mua, xử lý và bảo quản theo các tiêu chí sau:

- Mẫu thu mua đều theo tiêu chuẩn: không bị sâu bệnh, nấm, mốc, không hư hỏng, thối nhũn

- Tất cả các mẫu đều được đeo etiket, được ký hiệu và đánh số riêng để phân biệt giữa các mẫu, các giống/loài

- Mẫu sau khi thu mua được cân nguyên quả trước, ghi chép trọng lượng quả tươi sau

đó được giao cho bộ phận Hóa thực vật để tiến hành các nghiên cứu sàng lọc về hoá học Nếu chưa thể giao mẫu ngay, mẫu được bảo quản tươi trong tủ lạnh hoặc được tách vỏ, phơi khô, tránh việc hư hỏng gây ra từ phần múi bên trong

1.4 Điều tra phỏng vấn nguồn nguyên liệu vỏ quả từ các loài Citrus

Tiến hành phỏng vấn 3 đối tượng chính là: người trồng, người bán và người sản

xuất/kinh doanh các sản phẩm từ các loài Citrus để thu thập thông về diện tích trồng, sản lượng; tình hình sử dụng và giá cả các loài Citrus (Chi tiết mẫu phiếu ở các Phụ lục của

Chuyên đề 1) Tổng số phiếu đã thu thập được 108 phiếu

Các phiếu phỏng vấn được thu thập tại 14 tỉnh trên cả nước, trong đó có tập trung vào

các tỉnh có diện tích trồng lớn hoặc là nơi giao thương của nhiều loại quả Citrus

1.4.1 Kết quả điều tra, phỏng vấn về diện tích trồng và sản lượng các loài

Diện tích trồng và sản lượng của từng loài Citrus phản ánh độ phong phú của nguồn nguyên liệu từ các loài đó Dưới đây là các vùng trồng Citrus chính trong cả nước

Vùng Đồng bằng sông Cửu Long chủ yếu tập trung ở Vĩnh Long, Bến Tre, Tiền Giang, Cần Thơ, Hậu Giang Diện tích trồng khoảng 57.000 ha, gồm cam, chanh, bưởi, quýt có sản lượng hơn 530.000 tấn/năm Trong đó diện tích trồng cam, quýt đã chiếm tới 36.700 ha (~63,4%) với sản lượng khoảng 346.000 tấn/năm (~65%)

Vùng Đông Bắc Bộ, chủ yếu tập trung ở Hà Giang, Tuyên Quang Tổng diện tích trồng cam, quýt vào khoảng 7.082,8 ha với sản lượng 13.963 tấn/năm, chiếm ưu thế lớn so với các

loài Citrus khác

Bắc Trung Bộ là vùng trồng cây có múi lớn thứ 3 của cả nước, tập trung ở 2 tỉnh Nghệ

An, Hà Tĩnh Diện tích tới 5.488 ha cam, quýt cho sản lượng 38.501 tấn/năm Diện tích trồng bưởi khoảng 1.398 ha, sản lượng 6.885 tấn/năm, diện tích trồng chanh: hơn 1.000 ha, sản lượng 6.101 tấn/năm

Thông tin thu được từ 68 phiếu phỏng vấn về diện tích và sản lượng các loài Citrus tại

14 tỉnh chắc chắn không mang tính toàn diện và đầy đủ Tuy nhiên, kết quả tổng hợp phiếu phỏng vấn dưới đây phần nào cũng phản ánh đúng với những số liệu thống kê kể trên

Bảng 1 Tổng hợp kết quả về diện tích trồng và sản lượng quả một số loài Citrus

Tên loài Giống/loại Diện tích

trồng (ha)

Sản lượng TB kg/năm

Sản lượng tiêu thụ (kg/năm)

Như vậy, xét về độ phong phú, nguyên liệu từ cam, quýt chiếm ưu thế hơn trong số 6

loài Citrus Nguồn vỏ quả từ bưởi tuy ít hơn nhưng cũng chiếm tỷ lệ đáng kể Nguyên liệu từ

chanh, phật thủ và thanh yên có tỷ lệ không đáng kể

1.4.2 Kết quả điều tra, phỏng vấn các công ty/xí nghiệp kinh doanh các sản phẩm từ các loài thuộc chi Citrus

Để tận dụng nguồn nguyên liệu vỏ quả Citrus từ những nhà máy chế biến nước cam,

chanh, bưởi ép, việc tiến hành điều tra, thu thập thông tin từ các doanh nghiệp chế biến nước

ép trái cây là rất quan trọng Qua điều tra cho thấy, có rất ít doanh nghiệp trong nước chế biến

trái cây làm công tác này do chưa có công nghệ xử lý nước ép bưởi tốt, để lâu ngày nước ép dễ

bị đắng Đầu ra của sản phẩm không ổn định Tại Vĩnh Long có doanh nghiệp Hoàng Gia đã đầu tư một dây chuyền sản xuất nước ép bưởi Năm roi đóng lon công suất lớn, cho chất lượng nước ép cao, tốn kém Tuy nhiên, thực tế cho thấy đầu ra còn chưa cao nên hiện nay nhà máy này đã ngừng hoạt động

Như vậy để tận dụng vỏ quả của các loài Citrus nên tập trung vào việc thu mua vỏ quả

từ các nhà hàng, khách sạn, quán giải khát là những đầu mối tiêu thụ trực tiếp các loại quả

Citrus như Cam, Quýt, Bưởi

Ngoài ra, khi điều tra, phỏng vấn tại các nhà vườn, chúng tôi được biết có một lượng

đáng kể quả Citrus bị rụng sớm do nhiều nguyên nhân như: Mùa vụ (quả ra trái vụ thường phát

triển không tốt, dễ bị rụng), thời tiết (gió, mưa, bão…) và các tác động khác Lứa quả ra trái vụ thường còi cọc, hình dáng và mùi vị không đạt tiêu chuẩn nên người làm vườn tự ngắt bỏ để

cây tích lũy dinh dưỡng cho lứa quả chính Việc tận dụng nguồn nguyên liệu từ loại quả Citrus

này cũng cần được quan tâm

1.5 Kết luận

Qua quá trình thực hiện nội dung điều tra thu thập thông tin và thu mẫu các loài Citrus,

chúng tôi đã thu được những kết quả sau:

a) Xác định được tên khoa học của tất cả các loài Citrus nghiên cứu Thu thập và hoàn thiện bộ tiêu bản gồm 83 tiêu bản thuộc 8 loài Citrus

b) Thu thập được 201 mẫu vỏ quả của 6 loài Citrus phổ biến là cam, cam sành, chanh,

bưởi, quất, quýt phục vụ nghiên cứu sàng lọc, so sánh về hóa học Thu được 23 mẫu vỏ quả của 5 loài/thứ khác: chanh tây, chấp, phật thủ, thanh yên, cam canh

c) Thu thập, tổng hợp, thống kê và phân tích các thông tin từ các phiếu phỏng vấn Kết

quả, đã đề xuất được các loài Citrus có nguồn nguyên liệu phong phú, dễ kiếm là cam,

quýt (chiếm tỷ lệ lớn nhất), và bưởi

Những kết quả thu được kết hợp với kết quả nghiên cứu sàng lọc hóa học sẽ là cơ sở để

chọn lọc được nguồn nguyên liệu vỏ quả Citrus phù hợp nhất phục vụ cho nghiên cứu chiết

xuất Nó cũng góp phần định hướng cho việc thu mua nguồn nguyên liệu cho chiết xuất khi có ứng dụng trong thực tiễn về sau

2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

CITROFLAVONOID TRONG MẪU VỎ QUẢ CITRUS VÀ CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT

2.1 Xây dựng phương pháp Định tính các citroflavonoid

2.1.1 Nguyên tắc

Theo các nghiên cứu trước đây thì trong vỏ quả của các loài Citrus chắc chắn có các

flavonoid, đặc biệt là các citroflavonoid Có hai citroflavonoid chủ yếu là naringin (1) và hesperidin (2) được quan tâm hơn cả vì có hàm lượng rất lớn trong tổng citroflavonoid toàn

phần Do đó, chúng tôi không đặt vấn đề xác định sự có mặt các flavonoid trong các dược liệu này hay không bằng các phản ứng hóa học Vấn đề đặt ra là xác định sự có mặt của các chất này trong dược liệu và sơ lược định tính hàm lượng các chất này Điều này là cần thiết cho việc lựa chọn tôt nguyên liệu đầu vào và quản lý được chất lượng sản phẩm đầu ra Chúng tôi chọn

phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để giải quyết vấn

đề này

2.1.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

a) Cách tiến hành

Pha tĩnh

Bản mỏng silica gel GF254 (bản mỏng đã được tráng sẵn của Merck)

Pha động (dung môi khai triển)

Gồm các hệ dung môi sau:

Triển khai sắc ký

Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển (cách khoảng 5 mm) Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ thường, không đổi Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết bằng cách phun dung dịch AlCl3 2% trong ethanol

Kết quả là các sắc ký đồ TLC của các hoạt chất kể trên và các giá trị hệ số di chuyển Rf của các chất (được tính bằng tỉ số giữa quãng đường đi được của chất cần phân tích và quãng đường pha động đi được) [45]

Hệ A: Rf (1) = Rf (2) = 0,01; Rf (3) = Rf(4) = 0,55

Hệ B: Rf (1) = Rf (2) = 0,07; Rf (3) = Rf(4) = 0,61

Hệ C: Rf (1) = 0,21; Rf (2) = 0,20; Rf (3) = Rf (4) = 0,75

Hệ D: Rf(1) = 0,69; Rf(2) = 0,67; Rf(3) = Rf(4) = 0,92

Hình 9 Sắc ký đồ của 4 hoạt chất tinh khiết có trong các loài Citrus

Từ kết quả thu được có thể thấy với hệ dung môi A và B sẽ cho hệ số Rf của hai

glycosid 1 và 2 rất nhỏ (< 0,1) vì chúng là các chất phân cực, do đó dùng các hệ này để định

tính hai glycosid này là không phù hợp Cũng với hệ dung môi A và B cho giá trị Rf của hai

aglycon của 1 và 2, lần lượt là narigenin (3) và hesperitin (4) bằng nhau (Rf lần lượt là 0,55 và

0,61) và giá trị nằm trong khoảng cho phép để định tính tốt Với hệ C cho Rf của hai glycosid naringin và hesperidin thấp (Rf ~ 0,20) nhưng cũng có thể sử dụng để định tính, giá trị Rf của

hai chất 3 và 4 là 0,75 cũng phù hợp để có thể định tính bằng phương pháp TLC Trong khi ở

hệ D thì giá trị Rf của chất 1 (0,69) và 2 có (0,67) thể sử dụng được thì Rf của 3 và 4 (đều là 0,92) không phù hợp cho định tính bằng TLC Từ kết quả trên có thể thấy để định tính hai

flavonoid glycosid 1 và 2 ta có thể sử dụng các hệ dung môi C và D, trong khi 3 hệ A, B, và C

có thể sử dụng để chạy sắc ký cho hai chất 3 và 4

Áp dụng để định tính các hoạt chất này trong các mẫu Citrus, chúng tôi tiến hành thí nghiệm thử với một số loài Citrus có nhiều ở Việt Nam bằng các hệ dung môi đã lựa chọn ở

trên Các hình dưới đây (Hình 10 A, B, C, D) là kết quả định tính các hoạt chất có trong các

mẫu Citrus thu hái được Qua sắc ký đồ thấy rất rõ các glycoside 1 và 2 có chứa nhiều trong

các mẫu Citrus, đặc biệt là bưởi (vết 5), cam sành (vết 6), chanh (vết 7) và quýt (vết 10) Trong

khi đó hai aglycon của chúng là naringenin và hesperitin đều có rất ít trong các mẫu, đa số là không phát hiện được bằng sắc ký lớp mỏng

Hình 10 Sắc ký đồ của 4 hoạt chất tinh khiết có trong các loài Citrus

Vết 1: naringin; vết 2: hesperidin; vết 3: naringenin; vết 4: hesperitin; vết 5: bưởi, vết 6: cam sành;

vết 7: chanh; vết 8: phật thủ; vết 9: quất; vết 10: quýt

c) Kết luận

Bốn hệ dung môi A, B, C, D có thể sử dụng để định tính các chất naringin (1), hesperidin (2), naringenin (3), và hesperitin (4) bằng sắc ký lớp mỏng TLC Kết quả này sẽ

được áp dụng để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả các loài Citrus và sản phẩm

của qui trình chiết xuất được trình bày trong các chuyên đề sau

2.1.3 Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

a) Cách tiến hành

Hệ thống sắc ký: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích Hitachi VKN/ĐD/06,17

- Cột LiChrospher RP18 (250mm × 4,6mm ID, 5m)

- Detector diod array L-2455: 280nm

Pha động: Acetonitril (A), dung dịch acid phosphoric 0,1% (B)

Điều kiện sắc ký: - Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút, điều chỉnh nếu cần thiết

- Thể tích tiêm: 10 l

- Pha động được cài đặt theo một chương trình gradient như sau:

Bảng 2 Dung môi rửa giải cho định lượng citroflavonoid Thời gian (phút) A (%, tt/tt) B (%, tt/tt) Kiểu rửa giải

b) Kết quả

Với kết quả định tính bằng TLC và qua khảo sát sơ bộ bằng HPLC, chúng tôi nhận thấy

rằng các hoạt chất chính trong vỏ quả các loài Citrus là các glycosid 1 (naringin) và 2

(hesperidin) Vì vậy chúng tôi chỉ xây dựng phương pháp định tính hai hoạt chất chính này bằng phương pháp HPLC

Sau khi thử các hệ dung môi và các điều kiện khác nhau, chúng tôi tìm được điều kiện phân tích các citroflavonoid như đã xác định ở trên Với điều kiện sắc ký và phương pháp xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu được cho hai pic tách rõ ràng, nhiễu nền thấp, thể hiện qua sắc

ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử của hai chất naringin (1) và hesperidin (2) Trên các sắc ký đồ

(Hình 11) của mẫu thử đều có pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu (tR) của pic hesperidin trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn là 21,2 phút, trong khi thời gian lưu của naringin ngắn hơn, là 19,4 phút Với thời gian lưu và điều kiện tách như trên có thể thấy đây là điều kiện phù hợp để định tính các hoạt chất này trong dược liệu

Áp dụng phương pháp, điều kiện vừa tìm được để phân tích các thành phần các citroflavonoid trong dược liệu chúng tôi thấy phương pháp có thể sử dụng để định tính các chất này (Hình 12) Việc xác định hàm lượng của các chất này cũng có thể được

c) Kết luận

Các điều kiện trên đây phù hợp để phân tích định tính các chất naringin (1) và

hesperidin (2) trong vỏ quả các loài Citrus bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Phương pháp định tính, định lượng bằng HPLC chưa được qui định trong Dược điển Việt Nam,

do đó, chúng tôi dự kiến sẽ áp dụng kết quả này sẽ để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên

liệu vỏ quả các loài Citrus và sản phẩm của qui trình chiết xuất được trình bày trong các

chuyên đề sau Ưu điểm của phương pháp này là cho phép xác định hàm lượng các chất có độ chính xác cao, là cơ sở tin cậy để đánh giá chất lượng dược liệu và các sản phẩm chiết xuất

cũng như các sản phẩm bất kỳ nào có thành phần là vỏ quả của các loài Citrus

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min -10

0 10 20 30 40 50 60

30

mAU 280nm4nm (1.00)

Hình 11 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp hesperidin và naringin (trên), mẫu naringin

(giữa) và mẫu hesperidin (dưới)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min -10

0 10 20 30 40 50 60

Hình 12 Sắc ký đổ của mẫu chuẩn hỗn hợp (trên cùng), mẫu thu hái chứa hesperidin (vỏ

quả quýt, giữa) và mẫu chứa naringin (vỏ bưởi, dưới cùng)