NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ (REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT.)

Cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt.) là một trong những vị thuốc kinh nghiệm trong dân gian Việt Nam và nhiều nước khác trên thế giới có tác dụng khu phong, hoạt huyết, tiêu viêm, kháng sinh, chống virus, lợi tiểu, lợi sữa, chống ho, tiêu đờm. Rễ cây cốt khí củ của Việt Nam còn ít được nghiên cứu nhiều về hóa học. Việc xác định các thành phần hóa học của cây thuốc cổ truyền này của Việt Nam và đưa các hợp chất này vào các chương trình sàng lọc sẽ có thể dẫn đến sự phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học mới từ thiên nhiên, là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu các loại thuốc cũng như sản phẩm chức năng hỗ trợ điều trị các loại bệnh. Rễ cây cốt khí củ là một vị thuốc cổ truyền ở Việt Nam, mặc dù trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này song ở nước ta số lượng các công trình nghiên cứu được công bố còn rất ít. Trong chương trình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các cây thuốc cổ truyền của Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn rễ cây cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt.) làm đối tượng nghiên cứu. Luận văn thạc sĩ Nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt.) đã thu được các kết quả và các đóng góp mới sau:1. Đã xây dựng được quy trình chiết các hợp chất hữu cơ từ rễ cây cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt., Polygonaceae) theo độ phân cực tăng dần với các phần chiết nhexan (RJH, hiệu suất chiết 1,25 % so với lượng nguyên liệu khô), etyl axetat (RJE 4,00%), nbutanol (RJB, 2,72%) và nước (RJW 5,00%).2. Đã định tính các nhóm chất và xác định sự có mặt của các nhóm ankaloid, glycosid tim, flavonoid, coumarin, anthranoid, acid hữu cơ, saponin, tanin, đường khử, acid amin, chất béo, caroten, phytosterol trong rễ cốt khí củ3. Đã phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) các phần chiết. Đối với cặn nhexan, hệ dung môi khai triển là nhexanaxeton (9:1) đã phát hiện được 5 vệt, với Rf từ 0,10 đến 0,68. Đối với cặn etyl axetat, hệ dung môi triển khai là điclometan : metanol (9:1) đã phát hiện được 8 vệt, với Rf từ 0,06 đến 0,80. Còn đối với cặn nbutanol, triển khai trong hệ dung môi điclometan metanol nước (9:1:0,1), đã phát hiện được 5 vệt, với Rf từ 0,23 đến 0,86. Các điều kiện sắc ký này được áp dụng cho phân tách sắc ký cột các phần chiết.4. Bằng các kỹ thuật sắc ký cột kết hợp với phương pháp kết tinh lại đã phân lập được 16 hợp chất tinh khiết từ các phần chiết (RJH, RJE, RJB) rễ cốt khí củ.5. Đã xác định được cấu trúc của 11 hợp chất trong số các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp phổ (EIMS, 1HNMR, 13CNMR, DEPT và COSY, HSQC, HMBC). Cấu trúc của một số chất còn được khẳng định thêm bằng phương pháp sắc kí với mẫu chuẩn trong cùng một điều kiện. Các chất được nhận dạng là resveratrol và piceid (stilben), emodin, physcion, anthraglycosid A và anthraglycosid B ( anthraquinon), eleutherin (naphtoquinon) và reserpin (ankaloid), βsitosterol và daucosterol (phytosterol ), bianthron (đime emodin). Các hợp chất reserpin, eleutherin và emodin bianthron là các chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Reynoutria và cây cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt., Polygonaceae). Ngoài ra, các hợp chất βsitosterol, daucosterol lần đầu tiên được thông báo có mặt trong rễ cốt khí củ.6. Luận văn đã áp dụng phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) định lượng để xác định nồng độ của hợp chất resveratrol và piceid có trong hai mẫu rễ cốt khí củ được thu mua tại làng dược liệu Nghĩa Trai Hưng Yên (RJ1) và hiệu thuốc ở phố Lãn Ông Hà Nội (RJ2) . Hàm lượng của resveratrol ở mẫu RJ1 là 0,164 ± 0,008 %; và ở mẫu RJ2 là 0,116 ± 0,002 %. Còn hàm lượng của piceid ở mẫu RJ1 là 0,760 ± 0,030 % và ở mẫu RJ2 là 0,547 ± 0,011 %. Đây là thông báo đầu tiên về hàm lượng piceid trong rễ cốt khí củ trồng tại Việt Nam.

Hà Nội – 2012

===  ===

Trần Thanh Hà

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ

(REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT.)

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Mã số : 60 44 27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Đậu

Hà Nội – 2012

Luận văn tốt nghiệp này được hoàn thành tại Phòng thí nghiệm Hoá học các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn chân thành đến:

PGS TS Nguyễn Văn Đậu đã tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng dẫn

và tạo các điều kiện nghiên cứu thuận lợi giúp tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị em đồng nghiệp tại Viện Dược liệu - nơi tôi công tác đã chia sẻ công việc, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học cao học

Đồng thời tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các nghiên cứu sinh, các bạn học viên cao học K21 và các em sinh viên trong Phòng thí nghiệm Hoá học các hợp chất thiên nhiên đã tạo môi trường nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành tốt bản luận văn này

Hà Nội, tháng 12 năm 2012

Học viên

Trần Thanh Hà

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 THỰC VẬT HỌC 3

1.1.1 Họ Rau răm (Polygonaceae) 3

1.1.2 Chi Reynoutria 4

1.1.3 Cốt khí củ (Reynoutria Japonica Houtt.) 4

1.2 ỨNG DỤNG 6

1.3 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 7

1.3.1 Anthranoid 7

1.3.2 Stilben và dẫn xuất 9

1.3.3 Phenol 11

1.3.4 Flavonoit 12

1.3.5 Các thành phần khác 14

1.3.6 Thành phần hóa học của hoa, lá, thân cây cốt khí củ 16

1.4 TÁC DỤNG SINH HỌC 17

1.4.1 Tác dụng kháng khuẩn 17

1.4.2 Tác dụng chống oxy hóa 18

1.4.3 Tác dụng chống viêm 19

1.4.4 Tác dụng kháng u, chống ung thư 19

1.4.5 Tác dụng hạ lipit 21

1.4.6 Tác dụng chống virus 21

1.4.7 Trị đái tháo đường 21

1.4.8 Các tác dụng khác 22

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÁC CHẤT 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ PHÂN TÁCH 25

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHẢO SÁT CẤU TRÚC 26

2.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC 26

Chương 3: THỰC NGHIỆM 28

3.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 28

3.1.1 Thiết bị 28

3.1.2 Hóa chất 29

3.2 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 29

3.3 ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG RỄ CỐT KHÍ CỦ 29

3.3.1 Định tính các thành phần trong dịch chiết ete dầu hỏa 29

3.3.2 Định tính các thành phần trong dịch chiết etanol 30

3.3.3 Định tính các nhóm chất khác 32

3.4 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ RỄ CỐT KHÍ CỦ 33

3.5 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 34

3.5.1 Phân tích phần chiết n-hexan (RJH) 34

3.5.2 Phân tích phần chiết etyl axetat (RJE) 35

3.5.3 Phân tích phần chiết n-butanol (RJB) 36

3.6 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHẦN CHIẾT 37

3.6.1 Phân tách phần chiết n-hexan (RJH) 37

3.6.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (RJE) 38

3.6.3 Phân tách phần chiết n-butanol (RJB) 40

3.7 HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ 41

3.8 PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL VÀ PICEID 47

3.8.1 Nguyên liệu 47

3.8.2 Chuẩn bị mẫu phân tích: điều chế phần chiết metanol 47

3.8.3 Điều kiện phân tích sắc ký HPLC 47

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49

4.1 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT 49

4.2 ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT TRONG RỄ CỐT KHÍ CỦ 51

4.3 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ 52

4.3.1 Phân tách phần chiết n-hexan (RJH) 52

4.3.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (RJE) 54

4.3.3 Phân tách phần chiết n-butanol (RJB) 56

4.4 CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP 57

4.5 PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL VÀ PICEID 68

4.5.1 Phân tích HPLC dịch chiết MeOH của cốt khí củ 68

4.5.2 Xây dựng đường chuẩn resveratrol và đường chuẩn piceid .69

KẾT LUẬN 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC

MỤC LỤC CÁC BẢNG, HÌNH VÀ SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN

Bảng 3.1 Hiệu suất điều chế các phần chiết rễ cốt khí củ 34

Bảng 3.2 Phân tích TLC phần chiết n-hexan (RJH) 35

Bảng 3.3 Phân tích phần chiết etyl axetat (RJE) 36

Bảng 3.4 Phân tích phần chiết n-butanol (RJB) 37

Bảng 4.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong rễ cốt khí củ 51

Bảng 4.2 Nồng độ chất resveratrol và piceid trong hỗn hợp chuẩn 69

Bảng 4.3 Hàm lượng resveratrol và piceid có trong các mẫu rễ cốt khí củ 71

Hình 1.1 Một số hình ảnh về cây cốt khí củ 6

Hình 2.1 Phương pháp sắc ký cột 26

Hình 4.1 Tương tác HSQC của RJE13 65

Hình 4.2 Tương tác HMBC của RJE13 65

Hình 4.3 Sắc ký đồ HPLC 68

Hình 4.4 Phương trình đường chuẩn piceid 70

Hình 4.5 Phương trình đường chuẩn resveratrol 70

Sơ đồ 4.1 Quy trình điều chế các phần chiết từ rễ cốt khí củ 50

Sơ đồ 4.2 Quy trình phân tách phần chiết n-hexan 53

Sơ đồ 4.3 Quy trình phân tách phần chiết etyl axetat 55

Sơ đồ 4.4 Quy trình phân tách phần chiết n-butanol 56

Sơ đồ 4.5 Các mảnh cấu trúc của emodin 59

CÁC CHỮ VIẾT TẮT SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Các phương pháp sắc ký

TLC Thin layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

CC Column Chromatography Sắc ký cột thường

FC Flash Chromatography Sắc ký cột nhanh

Mini-C Minicolumn Chromatography Sắc ký cột tinh chế

HSCCC High-speed counter-current

chromatography

Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao

HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC /

UV /

ESI-MS

Highperformance liquid chromatography

-Ultraviolet- electrospray ionization- Mass

IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại

EI-MS Electron Impact Mass Spectroscopy Phổ khối lượng va chạm

13

C-NMR Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation

Transfer

Phổ DEPT

PDVB-SPG

Polydivinylbenzene microspheres were

prepared by Shirasu porous-glass (SPG)

membrane emulsification

Một loại chất hấp phụ

Các dung môi

EtOAc Ethyl acetate Etyl axetat

ACN Acetonitrile Axetonitril

MỞ ĐẦU

Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước và con người Việt Nam một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc, theo ước đoán hệ thực vật ở Việt Nam có khoảng 12.000 loài Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá Cho đến nay, việc nghiên cứu và phát triển các dược phẩm mới từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên đang đóng góp mạnh mẽ vào các lĩnh vực điều trị bao gồm: chống ung thư, chống nhiễm khuẩn, chống viêm, điều chỉnh miễn dịch và các bệnh về thần kinh Trong những năm 2000 – 2005, hơn 20 thuốc mới là sản phẩm thiên nhiên hoặc dẫn xuất từ thiên nhiên đã được đưa vào sản xuất Với việc đưa vào các phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh học nhanh đòi hỏi các nhà hóa học nghiên cứu các quy trình phân tách hiệu quả các hợp chất thiên nhiên từ các nguồn thực vật, vi nấm, sinh vật biển… và thực hiện các chuyển hóa hóa học, ví dụ như bằng các con đường mô phỏng sinh học (biomimetic), để tạo ra các dẫn xuất mới

Reynoutria Japonica Houtt tên thường gọi là cây cốt khí củ, thuộc họ Rau

răm (Polygonaceae) là loại cây mọc hoang và được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên khắp nước ta và nhiều nước trên thế giới

Rễ của cây cốt khí củ (radix Polygoni cuspidati) hay còn gọi là củ cốt khí là

một trong những vị thuốc kinh nghiệm dân gian Việt Nam và nhiều nước khác trên thế giới có tác dụng chữa tê thấp, thông kinh, lợi tiểu, tiêu đờm, giảm đau, giảm độc, dùng cho những người bị kinh nguyệt bế tắc, kinh nguyệt khó khăn đau đớn,

đẻ xong huyết ứ, bụng trướng, tiểu tiện khó khăn Nó được sử dụng để điều trị các tổn thương viêm, viêm gan, các khối u, hạ sốt và tiêu chảy Do đó, các vị thuốc từ

củ cốt khí được quan tâm nghiên cứu và đã được tiêu chuẩn hoá trong sử dụng, các tiêu chuẩn về kiểm nghiệm dược liệu từ củ cốt khí có trong dược điển quốc gia

Reynoutria Japonica Houtt (cây cốt khí củ) là một nguồn cung cấp các hợp

chất anthranoid và stilbenoid Do có các hoạt tính chống ung thư, chống oxy hóa,

kháng viêm, hạ lipit, đóng vai trò như các phytoestrogen… cùng với độc tính thấp các anthranoid và stilbenoid đang là khuôn mẫu hóa học cho các nghiên cứu phát triển các thuốc chống ung thư và phòng ngừa bệnh tim mạch thế hệ mới Do đó, chúng tôi đã lựa chọn rễ cây cốt khí củ làm đối tượng nghiên cứu của luận văn

thạc sĩ với tiêu đề: “Nghiên cứu thành phần hoá học rễ cây cốt khí củ (Reynoutria

Japonica Houtt.)”

Luận văn này có những nhiệm vụ nghiên cứu sau:

1 - Xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phần chiết chứa các hợp chất hữu cơ poliphenol từ rễ cây cốt khí củ

2 - Phân tích thành phần hóa học của rễ cây cốt khí củ bằng sắc kí lớp mỏng

3 - Phân tách các phần chiết bằng phương pháp sắc kí từ các phần chiết thu được

4 - Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập

5 - Định lượng hai hoạt chất là resveratrol và piceid bằng phương pháp HPLC, so sánh hàm lượng của chúng trong các nguồn dược liệu khác nhau

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 THỰC VẬT HỌC

1.1.1 Họ Rau răm (Polygonaceae)

Họ Rau răm hay còn gọi là họ Nghể, họ Kiều mạch có danh pháp khoa học là Polygonaceae bao gồm khoảng 1.110-1.200 loài [24], phân bố trong 43-53 chi Các

chi lớn nhất là Eriogonum (240 loài), Rumex (200 loài), Coccoloba (120 loài),

Persicaria (100 loài) và Calligonum (80 loài) [22], [51] Họ này có mặt rộng khắp

trên thế giới, nhưng đa dạng nhất tại khu vực ôn đới Bắc bán cầu, còn trong khu vực nhiệt đới thì có số lượng loài ít hơn

Họ Polygonaceae là một nhóm thực vật hai lá mầm gồm các cây thân thảo, cây bụi, cây thân gỗ nhỏ, đôi khi là dây leo Lá thường mọc cách, các lá kèm ở gốc

lá dính lại với nhau thành 1 ống gọi là bẹ chìa Cụm hoa kép gồm nhiều xim, hoa nhỏ thường lưỡng tính ít khi đơn tính, hoa đều không có cánh hoa, đài gồm 3-6 mảnh, màu lục trắng hay đỏ hồng; nhị 6 xếp thành 2 vòng, đôi khi 9 nhị; nhụy gồm

3 lá noãn, ít nhiều dính lại, bầu trên, chứa một noãn thẳng ở đáy Quả đóng hạt có phôi thẳng và nội nhũ bột lớn Dây leo quấn, lá hình tim, rễ phình thành củ

Tên gọi khoa học của họ dựa trên chi Polygonum và lần đầu tiên được Antoine Laurent de Jussieu sử dụng năm 1789 trong sách Genera Plantarum của

ông [9] Tên gọi này là chỉ tới nhiều mắt phồng lên trên thân của nhiều loài Nó có

nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp poly nghĩa là nhiều và goni nghĩa là đầu gối hay khớp

Họ Rau răm (Polygonaceae) thuộc bộ Rau răm (Polygonales), phân lớp cẩm chướng (Caryophylliadae), lớp hai lá mầm (Dicotyledoneae)

Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ, họ Rau răm (Polygonaceae) có 47 loài đánh số thứ tự từ 2968 đến 3025 [2], có tài liệu lại cho rằng có 11 chi, 45 loài [107]

Đỗ Tất Lợi cũng liệt kê 11 loài trong những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam [4] Một số thành viên trong họ này được biết đến như là kiều mạch, chút chít, đại hoàng, nghể, rau răm, hà thủ ô đỏ, ti gôn v.v

1.1.2 Chi Reynoutria

Trên thế giới chi Reynoutria bao gồm 28 loài [108] gồm các loại cây mọc lâu

năm, có hoa đực và hoa cái ở khác thân Thân rễ dày đặc Thân cây thẳng đứng, to, rỗng Lá đơn, mọc so le, có cuống lá, phiến lá hình trứng hoặc hình trứng - elip, mép lá nguyên vẹn; bẹ chìa không đối xứng Hoa đơn tính hình chùy mọc thành cụm hoa ở nách lá; bao hoa liên tục có 5 phiến; hoa có 3 cánh, hoa cái có cánh nằm

xa trục Nhị hoa 8 vòi nhụy 3, đầu nhụy có lông ở rìa Quả hình trứng, có mặt cắt tam giác [95]

Chi Reynoutria có nguồn gốc ở Đông Á, nó được di thực vào châu Âu vào thế kỷ 19 dưới dạng cây cảnh Một số loài thuộc chi Reynoutria bao gồm:

Reynoutria forbesii (Hance) Yamazaki (ut fargesii), Reynoutria Japonica var compacta, Reynoutria baldschuanica (Regel) Shinners, Reynoutria cilinodis

(Michx.) Shinners, Reynoutria convolvulus (L.) Shinners, Reynoutria Japonica Houtt., Reynoutria sachalinensis (F Schmidt ex Maxim.) Nakai, Reynoutria

scandens (L.) Shinners var cristata (Engelm & A Gray) Shinners, Reynoutria scandens (L.) Shinners var dumetorum (L.) Shinners, Reynoutria scandens (L.)

Shinners Các loài này thường thấy ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, cộng hòa Séc [14], [109]

Ở Việt Nam cho đến nay cốt khí củ (Reynoutria Japonica Houtt.) là loài duy

nhất thuộc chi này được định danh khoa học

1.1.3 Cốt khí củ (Reynoutria Japonica Houtt.)

Cốt khí củ có tên gọi khác là hoạt huyết đan, điền thất, hổ trượng căn, phù linh, nam hoàng cầm, co hớ hườn (Thái), mèng kẻng (Tày), hồng lìu (Dao) [1]

Tên khoa học: Reynoutria Japonica Houtt., tên đồng nghĩa là Reynoutria Mak., Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc, Reynoutria elata Nak [1] Theo phân

loại thực vật học cốt khí củ thuộc: Giới: Thực vật; Ngành: Magnoliophyta; Lớp: Magnoliopsida; Bộ: Polygonales; Họ: Polygonaceae; Phân họ: Polygonoideae; Chi:

Reynoutria [107]

Cốt khí củ là loại cây nhỏ, sống lâu năm Rễ phình thành củ cứng, mọc bò nghiêng dưới đất, vỏ ngoài màu nâu đen, ruột màu vàng Thân hình trụ, nhẵn, mọc thẳng đứng, cao 0,5-1 m, thường có những đốm màu tía hồng Lá mọc so le, cuống ngắn, hình trứng, đầu tù, hơi nhọn, mép nguyên, dài 5-12 cm, rộng 3,5-8 cm, mặt trên màu lục sẫm, có khi nâu đen; bẹ chìa ngắn Cụm hoa ngắn hơn lá, mọc thành chùm ở kẽ lá; hoa nhỏ màu trắng, hoa đực và hoa cái riêng; bao hoa có 5 phiến; hoa đực có 8 nhị; hoa cái có bầu 3 góc Quả 3 cạnh màu nâu đỏ, mùa hoa quả vào tháng 10-11

Cốt khí củ có nguồn gốc ở vùng Đông Á, sau lan xuống khắp các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, bao gồm Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào

và một vài nơi khác Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở vùng núi cao, từ 1000 -

1600 m và được trồng rải rác trong nhân dân ở vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ Cốt khí củ ưa sáng, ưa ẩm, nhưng ráo nước (úng ngập dễ làm thối củ) thường mọc thành khóm trong các thung lũng, nơi gần nguồn nước Cây rụng lá vào mùa đông, ra hoa quả nhiều hàng năm, có khả năng mọc chồi từ thân rễ Cây sinh trưởng mạnh từ mùa xuân đến mùa thu, bắt đầu cho thu hoạch củ từ tháng 9 trở đi, nên thu hoạch vào những ngày nắng ráo trong mùa đông, khi phần thân lá bắt đầu héo hoặc cũng có thể thu hoạch vào đầu mùa xuân, trước khi cây tái sinh

Củ cốt khí (radix Polygoni cuspidati) là rễ phơi hay sấy khô của cây cốt khí

củ, rễ cốt khí củ thu hái quanh năm, tốt nhất vào thu đông, rửa sạch đất cát, cắt bỏ rễ con, thái thành miếng nhỏ dày chừng 1-2 cm, phơi hoặc sấy khô Dược liệu có mặt ngoài nâu xám, sần sùi, nhăn nheo theo chiều dọc, có các mấu đốt và gióng, mặt cắt ngang màu vàng bẩn, lõi gần như rỗng, phần không rỗng có màu nâu sẫm Chất nhẹ, hơi cứng, mùi không rõ, vị hơi đắng [1]

Hình 1.1 Một số hình ảnh về cây cốt khí củ

1.2 ỨNG DỤNG

Theo y học cổ truyền, rễ cốt khí củ có vị đắng, tính ấm Quy kinh can, tâm bào với công năng hoạt huyết thông kinh, chỉ thống, trừ phong thấp, thanh thấp nhiệt, tiêu viêm, sát khuẩn Ở Việt Nam rễ cốt khí củ thường được dùng để chữa tê thấp, tổn thương đau đớn do bị ngã, bị thương, là một vị thuốc thu liễm cầm máu Trong bộ Bản thảo cương mục của Lý Thời Trân (Trung Quốc - thế kỷ 16),

vị thuốc này có tác dụng lợi tiểu, thông kinh, giảm đau, giảm độc, dùng cho những người bị kinh nguyệt bế tắc, kinh nguyệt khó khăn đau đớn, đẻ xong huyết ứ, bụng trướng, tiểu tiện khó khăn [4]

Trong y học cổ truyền Trung Quốc cốt khí củ được gọi là Zhang Hu, được sử dụng để điều trị các tổn thương viêm, viêm gan, các khối u, tiêu chảy, hạ sốt, giảm đau, lợi tiểu, tiêu đờm và được liệt kê chính thức trong Dược điển Trung Hoa [19]

Sử dụng trong các phương pháp điều trị đau khớp, viêm phế quản mãn tính, vàng

da, vô kinh và huyết áp cao [31]

1.3 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

Trong thành phần hóa học nổi bật của rễ cốt khí củ, hai nhóm chất chính chiếm hàm lượng lớn là các anthranoid (chủ yếu là anthraquinon) và các stilbenoid Đây là các thành phần hóa học quyết định cho nhiều hoạt tính có giá trị của cốt khí

củ như kháng khuẩn, kháng u, chống ung thư, chống oxy hóa, phòng ngừa bệnh tim mạch… Bên cạnh đó nó cũng bao gồm nhiều nhóm hợp chất khác như flavonoit, phenylpropanoid, phenol, ancaloit, quinon, axit amin… với nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý tương hỗ, bổ trợ với hai nhóm hợp chất chính làm cho cốt khí củ có hoạt tính sinh dược học cao

1.3.1 Anthranoid

Năm 2005, nhóm của Chu X và cộng sự đã phân lập được các anthraquinon

từ cặn chiết ethanol 95% của củ cốt khí là emodin (1), physcion (2), anthraglycosid

B (hay emodin-8-O-β-D-glucosid) (3) [21] Hợp chất (3) cũng được Dalei Zhang

phân lập với độ tinh khiết 98,6% [23] Liu và cộng sự phân lập được anthraglycosid

A (physcion-8-O-β-D-glucopyranosid) (4) [72]

Từ cặn chiết metanol 80% sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC–ESI-MS), Bin Shan và cộng sự đã xác định sự có mặt của emodin-8-O-

(6’-O-malonyl)-glucosid (5), emodin-1-O-glucosid (6) [13] (4), (3) cũng đã được

phân lập với quy mô lớn (large-scale) bằng phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC ) bởi Fuquan Yang và cộng sự [35]

Hợp chất (1) đã được Nguyễn Hải Nam và cộng sự phân lập vào năm 2007

từ cốt khí củ trồng ở Việt Nam [5] Nó cũng được phân lập cùng với một hợp chất

oestrogenic mới là citreorosein (7) vào năm 2009 [105]

Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với

detector UV cũng đã nhận biết được các hợp chất chrysophanol (8), rhein (9), (4), (3), (2), (1) có trong rễ cốt khí củ [25]

Trong công bố của Guangsheng Qian năm 2006 có đề cập đến sự có mặt của

falacinol (10), questinol (11) trong rễ cốt khí củ [36]

Questin (tức emodin-8-methyl ether) (12) được phân lập bởi Hua Yan [45] Hai anthraquinon malonylglucosid mới được Huan Zhang và cộng sự phân

lập là polyganins A (emodin-8-O-β-D-(6’-methylmalonyl)-glucopyranosid) (13) và polyganins B (physcion-8-O-β-D-(6’-methylmalonyl)-glucopyranosid) (14) từ cặn

chiết EtOAc của dịch chiết EtOH 95% rễ cốt khí củ [46]

1.3.2 Stilben và dẫn xuất

Năm 2005, nhóm của Chu X và cộng sự đã phân lập được các stilben từ cặn chiết ethanol 95% của củ cốt khí là resveratrol (15), piceid (16) [21]

Năm 2009, bằng phương pháp sắc kí pha đảo với chất hấp phụ PDVB-SPG

và kết tinh lại, Dalei Zhang và cộng sự đã phân lập, tinh chế được (16), (15) đạt độ

tinh khiết tương ứng là 98,8%, 98,2% [23] Hai hợp chất này cũng được phân lập bằng phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) từ cặn chiết

EtOAc với hiệu suất 2,18% (15) và 1,07% (16) so với khối lượng mẫu khô ban đầu

[68] Một dẫn xuất của stilben là

1-(3’,5’-dihydroxyphenyl)-2-(4’’-hydroxyphenyl)-etan-1,2-diol (17) cũng được phân lập từ dịch chiết 60% axeton nước của rễ cốt khí

củ [57]

Năm 2007, Nguyễn Đình Tuấn và cộng sự đã định lượng hợp chất (15) trong

cốt khí củ trồng ở Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ MS) là 0,27% [6]

(LC-Sự có mặt của các hợp chất piceatannol glucosid (18), resveratrolosid (19), piceid gallate A (20), picied gallate B (21) trong cốt khí củ được xác định nhờ sự

kết hợp của kĩ thuật sắc ký lỏng kết hợp với UV và ion hóa khối phổ (HPLC / UV /

ESI-MS) [87] Hai chất (18), (19) đã được Bret C Vastano và cộng sự phân lập

được từ dịch chiết metanol của rễ cốt khí củ [15]

Kai Xiao phân lập được các stilben glycosid natri sunfat bao gồm

glucopyranosid-6′′-natri sunfat (22), glucopyranosid-4′′-natri sunfat (23), trans-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranosid-2′′- natri sunfat (24), trans-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranosid-4′-natri sunfat (25), trans-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranosid-5- natri sunfat (26), trans-resveratrol-3- O-β-D-glucopyranosid-4′-natri sunfat (27) [55] Nhóm tác giả này cũng phân lập được hai đime stilben glycosid là (28), (29) [58]

trans-resveratrol-3-O-β-D-Vinod R Hegde và cộng sự tách được từ dịch chiết 70% metanol của rễ cốt

khí củ hai dẫn xuất của (15), tuy nhiên hai chất này mới chỉ được dự đoán có cấu trúc như (30), (31) [93]

1.3.3 Phenol

Các hợp chất phenol cũng được phân lập như phenol sunfat:

5,7-dimethoxyphthalid (32) [41], etanon (33) [56], axit natri 3,4-dihydroxy-5-methoxybenzoic (34), axit gallic (35), axit 2,6-dihydroxybenzoic (36) [57], tachiosid (37), isotachiosid (38), axit protocatechuic (39) Sự phong phú của các hợp chất phenol còn thể hiện qua sự có mặt của hợp chất torachrysone-8-O-β-D-glucosid (40) [87], axit chlorogenic (41), axit p-coumaric (42) [79]

1-(3-O-β-D-glucopyranosyl-4,5-dihydroxyphenyl)-1.3.4 Flavonoit

Các nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học của rễ cây cốt khí củ cho thấy

sự có mặt của các flavonoit như catechin (43), glucopyranosid (44) [57]

(+)–catechin-5-O-β-D-Năm 2009, Peihong Fan và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng kết hợp với UV và ion hóa khối phổ (HPLC/UV/ESI-MS) xác định sự có mặt của các

flavonoit là (43), epicatechin (45), quercetin-3-O-galactosid (46), avicularin (47), quercetin-3-O-rhamnosid (48) trong cặn chiết metanol của rễ cốt khí củ [87]

Sử dụng kỹ thuật 2D-TLC cũng đã xác định được các hợp chất flavonoit khác

từ cốt khí củ là kaempferol (49), quercetin (50), rutin (51), hyperosid (52) [79]

Năm 2010, Hong-Wei Lin và cộng sự tách được

(−)-epicatechin-5-O-β-D-glucopyranosid (53), (+)-catechin-7-O-β-D-(−)-epicatechin-5-O-β-D-glucopyranosid (54) từ dịch chiết EtOH

70% rễ cốt khí củ [41]

1.3.5 Các thành phần khác

Lignan sunfat: Hai lignan sunfat được phân lập từ cặn chiết nước của rễ cốt

khí củ là natri (−)-lyoniresinol-2a-sunfat tức natri hydroxy-3’,5’-dimethoxyphenyl)-7-hydroxy-6,8-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydro-2-

(−)-1R-3-hydroxymethyl-1-(4’-naphthalenyl metanol sunfat (55) và natri isolaricireinol-2a-sunfat tức natri

(+)-

1S-3-hydroxymethyl-1-(4’-hydroxy-3’-methoxyphenyl)-7-hydroxy-6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydro-2-naphthalenyl metanol sunfat (56) [55]

Amino axit: Một amino axit đã được phân lập là tryptophan (57) [57]

Ancaloit: Sự có mặt của ancaloit trong cốt khí củ được phát hiện nhờ phản ứng định tính với thuốc thử Mayer và Dragendoff [90]

Phenylpropanoid: Các phenylpropanoid glucosid được tìm thấy trong rễ cốt

khí củ là lapathosid A (58), lapathosid C (59), hydropiperosid (60), vanicosid A (61), vanicosid B (62) [87]

Naphthoquinon: Một naphthoquinon là 2-methoxy-6-acetyl-7-methyljuglon

(63) đã được Kimura và cộng sự phân lập được từ dịch chiết axeton rễ cốt khí củ

[61], [45] Hợp chất này cũng đã được nghiên cứu tổng hợp với tên là methoxystypandron [89]

2-1.3.6 Thành phần hóa học của hoa, lá, thân cây cốt khí củ

Các nghiên cứu về cây cốt khí củ phần lớn tập trung vào bộ phận rễ của nó

bởi các hoạt tính sinh dược học quý giá Vì thế có rất ít công bố về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các bộ phận khác của cây như hoa, lá, thân Công bố của Nadezda Vrchotová và cộng sự (2010) gần như là công bố đầu

tiên về thành phần hóa học của hoa và thân của cây này [81]

Các hợp chất phenolic trong cặn chiết metanol của ba loài Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc, P sachalinense (F Schmidt) và P bohemicum (Chrtek et

Chrtková) Zika (Polygonaceae) đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản

Theo đó, trong hoa của cốt khí củ có chứa các hợp chất (43), (16), (50), (52),

và một lượng lớn quercetin toàn phần Trong thân chứa (50), (46), (45), (41), (15), (16) và (19) Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng của quercetin toàn phần ở trong hoa nhiều hơn thân cây, và thân cây giàu (16) và (41) (tương ứng với 238 và

103 mg / kg trọng lượng khô) [81]

Trong hỗn hợp lá và thân Huang và cộng sự đã phát hiện ra glycosid của quercetin và apigenin, emodin và các dẫn xuất của nó, rhein, axit gallic, piceid [47] Trong lá phát hiện thấy có catechin, các dẫn xuất của caffeic axit, các glycosid của quercetin [82], stilben và catechin trong mầm [80], các hợp chất dễ bay hơi trong lá cũng được tìm thấy trong dịch chiết dietyl ete bằng phương pháp sắc ký khí như 2-hexenal (73,36%), 3-hexen-1-ol (6,97%), n-hexanal (2,81%), 1-penten-3-ol (2,55%), 2-penten-1-ol (2,21%), và etyl vinyl xeton (1,13%) [102] Guoqing Li và Yukio Ishikawa sử dụng kết hợp phương pháp sắc ký khí và phân tích quang phổ đã xác định được trong sáp lá của cốt khí củ có chứa ankan mạch dài C16−C33 chiếm tới 48% tổng lượng sáp, trong đó n-nonacosan (n-C29) chiếm hàm lượng cao nhất, các axit béo tự do C9−C22 chiếm 22,3% chủ yếu là axit

hexadecanoic [37] Lá của Reynoutria Japonica (cốt khí củ), Fallopia

sachalinensis, và Fallopia bohemica còn là nguồn nguyên liệu giàu các hợp chất

phenolic và polysaccharit Hàm lượng của tro, protein, lignin, axit uronic và

α-cellulozơ trong lá của F sachalinensis, F bohemica và R Japonica tương ứng là

63,3%, 64,1%, 63,4%, còn lại là hemicellulozơ và muối cacbohydrat của polysaccharit pectic [103]

Theo một công bố của Naoharu Mizuno và cộng sự, trong nhựa của lá cốt khí củ có chứa các kim loại như Ni, Mn, Fe, Zn, K, Mg, Ca Trong đó Ni, Fe, Mn chiếm hàm lượng cao nhất Hàm lượng này thay đổi phụ thuộc vào các phần của lá, vào từng loại đất mà cây sinh trưởng [83]

1.4 TÁC DỤNG SINH HỌC

Sự phong phú về thành phần hóa học và các nhóm chất có hoạt tính sinh học cao làm cho cốt khí củ có nhiều tác dụng sinh học quý giá: chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch, điều hòa miễn dịch, chống ung thư, chống vi khuẩn, chống nấm, chống virus hiệu quả

1.4.1 Tác dụng kháng khuẩn

Rễ cốt khí củ và hoạt chất của nó là emodin (1) đã được chứng minh là có

hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp kháng lại Vibrio vulnificus, một loại vi khuẩn gây ra

nhiễm trùng huyết dễ dẫn đến tử vong Trong một khảo nghiệm, Kim JR và cộng sự nhận thấy rằng rễ cốt khí củ ngăn chặn sự chết cấp tính, ngăn ngừa tổn hại về hình

thái của tế bào HeLa và RAW264.7 gây bởi V vulnificus, ức chế sự sống sót, tăng trưởng của V vulnificus trong nước thường và nước biển [60]

Dịch chiết metanol của rễ cốt khí củ và các phân đoạn chiết khác nhau có khả năng ức chế các vi khuẩn gây sâu răng gram (+) và gram (-) bao gồm 20 chủng

vi khuẩn Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus với nồng độ ức chế tối

thiểu MIC 0,5-4,0 mg/ml, và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC cao gấp 2-4 lần so với MIC [90], [91], [92]

Các stilben và dẫn xuất như (15), (16), (19), anthraquinon và dẫn xuất như (1), (2), (6) đã được chứng minh là có tác dụng diệt khuẩn đối với các vi khuẩn thực

phẩm Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia

coli và Salmonella anatum [13]

1.4.2 Tác dụng chống oxy hóa

Sự peroxit hóa lipit, peroxit protein và làm tổn thương ADN gây ra bởi các gốc tự do là nguyên nhân dẫn đến nhiều loại bệnh Theo nghiên cứu của Hsu CY và cộng sự, dịch chiết ethanol với hàm lượng phenolic và flavonoit là 641,1 ± 42,6 mg/g và 62,3 ± 6,0 mg/g có tác dụng loại các gốc tự do, gốc superoxit, gốc tự do peoroxy hóa lipit và các gốc hydroxyl gây ra sự đứt chuỗi AND với các giá trị IC50

tương ứng là là 110 μg/ ml, 3,2 μg/ml, 8 μg/ml [43]

Hợp chất (30) có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh ngăn ngừa tế

bào chết gây ra bởi các tác nhân oxy hóa tert-butyl hydroperoxid (T-BHP) trong tế

bào PC12 Hợp chất này có tác dụng chống oxy hóa mạnh hơn (15) và axit lipoic

[69]

Hợp chất (15) và resveratrol liposome có thể bảo vệ tế bào thần kinh ở chuột mắc bệnh Parkinson Sau 14 ngày điều trị (15) hoặc resveratrol liposome (20 mg/kg

mỗi ngày), hành vi quay bất thường, sự mất, tự chết của các tế bào nigral đã giảm rõ

rệt và khả năng chống oxy hóa của các mô nigral cải thiện đáng kể [100] Chất (15)

tăng cường khả năng chống oxy hóa, bảo vệ chống lại các tế bào chết gây ra bởi khói thuốc lá trong nhân tế bào biểu mô phế quản (HBE1) [40]

Hợp chất (16) được chứng minh làm giảm sản sinh ra malondialdehyd

(MDA), giảm thương tổn tế bào thần kinh nhận thức gây ra bởi oxy glucozơ (OGD), làm tăng các hoạt động của superoxid dismutase (SOD) và catalase (CAT) cải thiện tình trạng suy kém về nhận thức ở chuột mất trí nhớ Điều này được cho là

có liên quan đến hoạt động chống oxy hóa và trực tiếp bảo vệ tế bào thần kinh [88] Tác dụng chống oxy hóa không chỉ có ở phần rễ cốt khí củ mà các thí nghiệm cũng đã chứng minh lá và thân của cây cũng có khả năng này Tổng khả năng chống oxy hóa và hàm lượng phenolic đo được là 56,22 mmol trolox/100 g trọng lượng khô và 6,33g axit gallic/100 g trọng lượng khô [47] Qua các nghiên

cứu này cho thấy rằng rễ, lá và thân cốt khí củ đều biểu hiện tính chất chống oxy hóa mạnh và là nguồn tài nguyên tiềm năng của tự nhiên chứa các hoạt chất chống oxy hóa

1.4.3 Tác dụng chống viêm

Tác dụng ức chế yếu tố phiên mã NF-κB (nuclear factor kappa B) kiểm soát quá trình biểu hiện gen mã hóa của các cytokin, chemokin của các hợp chất phân

lập từ rễ cốt khí củ đã được chứng minh [62], [78], [106] Chất (15) được phát hiện

có tác dụng chống viêm qua tác dụng ức chế NF-κB và sự tổng hợp nitơ oxit (NO) trên tế bào biểu mô đường hô hấp chính (IC50 = 3,6 ± 2,9 μM), ức chế bạch cầu hạt, đại thực bào (IC50 = 0,44 ± 0,17 μM), IL-8 (IC50 = 4,7 ± 3,3 μM) và ức chế sự hoạt hóa enzym cyclooxygenase-2 trong các tế bào Điều này cho thấy rằng tác dụng

chống viêm của (15) có thể ứng dụng để điều trị các bệnh viêm nhiễm [29]

Cặn chiết nước rễ cốt khí củ đã được phát hiện có tác dụng chống viêm qua tác dụng ức chế sự tổng hợp nitơ oxit (NO) và ức chế sự hoạt hóa enzym cyclooxygenase 2 (COX-2) gây bởi lipopolysaccharit (LPS) trên tế bào RAW 264.7 [64]

Khi một chất có tác dụng ức chế NF-κB thì nó có thể thể hiện tác dụng chống viêm và cơ chế tác dụng này cũng có liên quan đến các tác dụng chống ung thư

1.4.4 Tác dụng kháng u, chống ung thư

Các nghiên cứu cho thấy các hợp chất phân lập được từ cốt khí củ đặc biệt là anthranoid (emodin và dẫn xuất) và stilbenoid (resveratrol và dẫn xuất) thể hiện các hoạt tính chống ung thư

Hoạt động chống ung thư của rễ cốt khí củ đã được chứng minh theo cơ chế

chống gây đột biến hoặc là ức chế protein-tyrosine kinase (1) được chứng minh

chống gây đột biến bởi tác nhân benzo [a] pyrene (B ([a] P), methylimidazol [4,5-f] quinolin (IQ) và 3-amino-1 -methyl-5H-pyrido [4,3-b] indol (TRP-P-2) đồng thời đóng vai trò ngăn chặn, tác động làm giảm đột biến trực tiếp

2-amino-3-của 1- nitropyren (1-NP) [44], [67] Các chất ức chế protein-tyrosine kinase, anthraquinon, stilben và các flavonoit được xác định từ rễ cốt khí củ thông qua sinh

thử nghiệm phân đoạn, (1) hiển thị hoạt động chọn lọc cao đối với hai oncogen (gen

đột biến gây ung thư) khác nhau, Src-Her-2/neu và ras oncogene [20]

Đáng chú ý, tác dụng chống ung thư của (15) là ngăn chặn sự sinh trưởng

của một loạt các tế bào khối u, bao gồm ung thư máu, đa u tủy, ung thư vú, tuyến tiền liệt, dạ dày, đại tràng, tuyến tụy, tuyến giáp, u ác tính đầu, ung thư biểu mô tế bào vảy cổ, ung thư biểu mô buồng trứng và ung thư biểu mô cổ tử cung [7]

(15) là một tác nhân chống ung thư mới, ít độc tính và hiệu quả cao Khi vào

cơ thể nó được phân bố chủ yếu trong dạ dày, tá tràng, gan và thận [28], [73] Nó có khả năng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư L-02, HepG2, SHZ-888, MCF-

7, MCF-7/ADM nhưng không gây độc cho các tế bào thường [33], ức chế tăng sinh

và tự diệt tế bào theo chương trình ở tế bào lympho không biệt hóa ALCL [99] Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là một trong các khối u ác tính nguy

hiểm nhất và cho đến nay chưa có thuốc điều trị hiệu quả Gần đây (15) được công

bố có khả năng ức chế tế bào ung thư gan Hep-G2 thông qua việc giảm cyclin D1, p38 MAP kinase, Akt và Pak1 [84]

(15) là một chất ức chế mạnh các yếu tố NF-κB kích hoạt, nó đã được thử

nghiệm chống lại ung thư vú gây ra bởi 7,12-dimethylbenz(a)anthracen (DMBA)

trên chuột cái Sprague Dawley [11] Năm 2012, (15) cũng được chứng minh khả

năng chống lại ung thư ruột kết (in vitro, in vivo) theo cơ chế chống tăng sinh và

chết theo chương trình (apoptosis), làm giảm số lượng tổn thương ở các khối u lành tính hoặc ác tính [76]

(15) cũng được chứng minh có khả năng chống kết tập tiểu cầu và ức chế bề

mặt P-selectin (protein ở người) dương tiểu cầu thông qua cơ chế ức chế sự hoạt động của protein kinase C trong màng nhỏ của tiểu cầu và giảm tỷ lệ phần trăm của màng tế bào liên quan đến hoạt động của protein kinase C [101]

1.4.5 Tác dụng hạ lipit

Sự tăng lipit máu, tăng mức cholesterol, hay đúng hơn, tăng LDL-c (lipoprotein-cholesterol tỉ trọng thấp) phổ biến ở những người béo phì là nguyên nhân chính của chứng xơ vữa làm nghẽn mạch vành tim gây ra đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, suy tim và chết bất ngờ Khi giảm lượng LDL-c, tăng HDL-c (lipoprotein-cholesterol tỉ trọng cao) trong máu sẽ giảm nguy cơ mắc phải bệnh mạch vành tim Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng nhiều loại thuốc có thể ức chế cholesterol trong huyết thanh Tuy nhiên, chúng có thể gây ra tác dụng phụ

nghiêm trọng trong các điều tiết lâm sàng khác nhau (16) được chứng minh có tác

dụng hạ lipit máu ở chuột cống và trên thỏ đã làm tăng triglycerid thông qua sự

giảm cholesterol, triglycerid, LDL-c, làm tăng HDL-c [30], [94]

Dịch chiết nước của rễ cốt khí củ cũng được chứng minh làm giảm sự hình thành este cholesteryl trong tế bào gan của con người theo cơ chế ức chế acyl-coenzyme A–cholesterol acyltransferase [18]

1.4.6 Tác dụng chống virus

Cặn chiết etanol có khả năng ức chế virus viêm gan B- HBV (p <0,0001) với liều tối thiểu là 10 μg/ml, cặn chiết nước có tác dụng ở liều cao hơn (30 μg/ml) [54]

(15) được chứng minh có khả năng chống lại sốt virus trên lợn châu Phi do

ức chế sự sao chép ADN virus, chậm tổng hợp protein virus [49]

Các công bố cho thấy (15) có khả năng điều trị lây nhiễm nhân bản virus

herpes simplex (HSV), HSV-1, HSV-2 [26], VZV (varicella-zoster virus), HCMV (human cytomegalo virus) và EBV (Epstein-Barr virus) [27], [32], [59] Nó còn có khả năng ức chế sự sao chép polyoma virus bằng cách ngăn chặn tổng hợp AND

virus (in vitro) [12], kháng virus cúm (in vitro và in vivo) [85], ức chế tăng trưởng

của virus vaccinia [17]

1.4.7 Trị đái tháo đường

Protein kinase AMP đóng vai trò trung tâm trong việc điều tiết chuyển hóa

glucozơ và lipit, do đó nó được coi là một mục tiêu trị liệu mới cho hội chứng

chuyển hóa như bệnh đái tháo đường type 2 (15) đã được chỉ rõ là làm tăng hấp thu

glucozơ trong tế bào C2C12 thông qua kích hoạt protein kinase AMP, nó làm giảm HG-do superoxid sản xuất thông qua việc tăng SIRT1 trong bạch cầu đơn nhân, đây

là một dấu hiệu cho thấy tiềm năng trị đái tháo đường của (15) [86], [53]

Các chất phân lập từ rễ cốt khí củ có khả năng làm tăng leptin - mRNA trong

mô mỡ (P <0,05) và hạ cholesterol triglycerid (P <0,05), cải thiện chuyển hóa chất béo trong huyết thanh ở chuột NAFLD (Non-alcoholic fatty liver disease) là một trong những nguyên nhân gây ra gan nhiễm mỡ, xảy ra khi chất béo được lưu ký trong gan không phải do sử dụng rượu quá mức Nó có liên quan đến sự đề kháng insulin, hội chứng trao đổi chất và có thể đáp ứng với điều trị ban đầu được phát triển kháng insulin khác, ví dụ như đái tháo đường type 2 [50]

Nghiên cứu dược động học chỉ rõ (1) được hấp thu và phân bố nhanh ở gan sau khi vào cơ thể [52] (1) đang được nghiên cứu như một tác nhân tiềm năng có

thể làm giảm tác động của bệnh đái tháo đường type 2 Nó là một chất ức chế chọn lọc mạnh của các enzym 11β-HSD1 [34]

1.4.8 Các tác dụng khác

Giảm đau, chống trầm cảm

Ở Việt Nam, độc tính cấp và tác dụng giảm đau, an thần của cốt khí củ cũng

đã được nghiên cứu, theo đó ở liều 80g/kg ở chuột nhắt trắng- gấp 200 lần liều dùng lâm sàng, cốt khí củ vẫn chưa gây ra độc tính cấp, đây cũng là liều tối đa cho chuột cống uống được Kết quả nghiên cứu về tác dụng giảm đau cho thấy cốt khí củ giảm đau theo kiểu Morphin (tác động lên vỏ não và trung tâm dưới vỏ gây ra một phản ứng kích thích hệ thống giảm đau) và theo cơ chế ngoại biên Ngoài giảm đau, cốt khí củ còn có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, làm giảm các hoạt động của chuột nhưng không gây ngủ, làm giảm đáp ứng kích thích tiếng động, ánh sáng, ức

chế được một phần trạng thái hưng phấn do cafein gây ra [3]

Tác dụng chống trầm cảm của (15) thể hiện ở việc làm gia tăng đáng kể

serotonin và noradrenaline ở mức 40 hoặc 80 mg/kg ở các vùng não, có thể liên quan đến kích hoạt serotonergic và noradrenergic, ức chế hoạt động của monoamin oxidase A (MAO-A ) [98]

Đối với xương khớp

Các tác dụng bảo vệ xương của (15) đã được chứng minh trong một số mô hình loãng xương Liu ZP và cộng sự chỉ ra rằng (15) có thể tăng mật độ khoáng và

ức chế sự giảm hàm lượng canxi của xương đùi ở chuột OVX, cho thấy rằng nó có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại sự mất xương gây ra

bởi sự thiếu hụt estrogen [71] Trong khi đó Xu He công bố (15) ngăn cản yếu tố

kích hoạt thụ thể κB ligand (RANKL) trên tế bào RAW 264.7 [97]

Dịch chiết nước của thân rễ cốt khí củ đã được chứng minh ức chế mạnh xanthin oxidase enzym (xúc tác của quá trình oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và sau đó cho axit uric), với giá trị IC50=38 μg/ml Điều này cho thấy cốt khí củ đóng một vai trò quan trọng trong điều trị bệnh gút [65]

Đối với sức khỏe phụ nữ

Sự thiếu hụt của estrogen nội sinh (hóc môn sinh dục nữ) là nguyên nhân

gây ra một số bệnh ở phụ nữ thời kỳ mãn kinh như chứng loãng xương, tăng cholesterol trong máu, triệu chứng của mãn kinh (bốc hoả từng cơn, toát nhiều mồ hôi, đổ mồ hôi về đêm và trầm cảm) Vì vậy cần có liệu pháp estrogen thay thế để

có thể hạn chế các bệnh này Các hợp chất có trong rau, củ, quả có khả năng thay

thế estrogen được gọi là phytoestrogen

Theo điều tra của Zhang CZ và cộng sự thì trong tổng số 32 cây thuốc được điều tra, dịch chiết EtOH 70% từ cốt khí củ chứa hàm lượng estrogen cao nhất

[104] Hai chất (1) và (3) được phân lập từ dịch chiết metanol của rễ cốt khí củ đã

được chứng minh là những hợp chất phytoestrogen ức chế 17β-estradiol liên kết với

thụ thể estrogen của người Rõ ràng hơn, (1) và (3) ở (1–10 μM) làm tăng sinh tế

bào MCF-7, một dòng tế bào nhạy cảm với estrogen [39], [16]

Khả năng chống dị ứng

Cơ chế tác động của khả năng chống dị ứng của rễ cốt khí củ đã được Lim

BO và cộng sự nghiên cứu Theo đó các dịch chiết từ rễ cốt khí củ cho thấy hoạt động ức chế mạnh trong các tế bào mast (tế bào thường trú của một số loại mô và chứa nhiều hạt giàu histamine và heparin, tế bào mast đóng một vai trò quan trọng tham gia mật thiết trong việc chữa lành vết thương và bảo vệ chống lại tác nhân gây bệnh) với giá trị IC50 là 62 ±2,1 μg/ml cho tế bào mast RBL-2H3 và 46 ± 3,2 μg/ml cho tủy xương có nguồn gốc từ tế bào mast bằng cách kích thích kháng nguyên

[70] Năm 2011, Lu Y và cộng sự chỉ rõ hoạt chất (1) có tác dụng chống dị ứng do

ức chế quá trình tế bào giải phóng các phân tử kháng sinh gây độc tế bào từ các túi tiết (degranulation), ức chế các eicosanoid (prostaglandin D2 và leukotriene C4),

bài tiết các cytokin (TNF-a và IL-6) [74]

Ảnh hưởng trên sinh sản

Theo công bố mới nhất (15) có tác động tích cực trong quá trình thụ tinh

trong ống nghiệm ở lợn và sự trưởng thành trong ống nghiệm của tế bào trứng lợn

Tế bào trứng được điều trị với 2 μM (15) có tỷ lệ phôi nang hình thành cao hơn

đáng kể và điều chỉnh biểu hiện gen trong tế bào trứng trưởng thành [63]

Khả năng chữa lành vết thương

Dịch chiết etanol 50% ở 25ºC của rễ cốt khí củ được chứng minh là có khả năng chữa lành vết thương ở chuột Tỷ lệ chữa lành vết thương cao hơn đáng kể sau

3, 7, 14 và 21 ngày trong nhóm chuột điều trị với dịch chiết (p <0,05), kết quả mô học và mô miễn dịch cho thấy ở chuột điều trị với dịch chiết cốt khí củ các tổ chức collagen, nguyên bào sợi, nang lông nhiều hơn, TGF-β1 tăng và các tế bào viêm ít hơn so với chuột không được điều trị [96]

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÁC CHẤT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Nguyên liệu mẫu thực vật được chiết với EtOH 90% ở nhiệt độ phòng Dịch chiết EtOH 90% được phân bố giữa H2O và các dung môi hữu cơ khác nhau nhằm làm giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ PHÂN TÁCH

a Sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) là một phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các ngành khoa học hoá học, sinh học, hoá dược với nhiều mục đích khác nhau do các đặc tính ưu việt của nó: độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ (thường từ 1 đến 100 x 10ˉ6 g), tốc độ phân tích nhanh, kỹ thuật phân tích dễ thực hiện Phương pháp TLC với chất hấp phụ silica gel được dùng để phân tích định tính hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho các phương pháp sắc ký cột để kiểm soát điều kiện phân tách

b Sắc ký cột

Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi trên silica gel theo cơ chế hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất

Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí nén để dung môi rửa giải đi qua cột nhanh hơn

c Phương pháp kết tinh lại

Phương pháp này được sử dụng để tách và làm sạch chất rắn Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn

Hình 2.1 Phương pháp sắc ký cột

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHẢO SÁT CẤU TRÚC

Hiện nay, các phương pháp phổ là công cụ hiện đại và hữu hiệu nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Các phương pháp được sử dụng để xác định

cấu trúc các hợp chất trong luận văn này bao gồm:

- Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS);

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H -NMR);

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D- NMR)

2.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động

là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu

phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Dựa vào sự khác nhau về

cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà người ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng pha thường và sắc ký lỏng pha đảo

Hiện nay phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi trong việc phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… Luận văn này sử dụng phương pháp HPLC với cột sắc ký pha đảo dựa trên nguyên tắc hấp phụ xác định các thông số thời gian lưu, diện tích píc để định lượng các chất có trong dược liệu

Chương 3: THỰC NGHIỆM

3.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

3.1.1 Thiết bị

Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel

(Merck, Đức) DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm

Sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC) và sắc ký cột tinh chế

(Mini-C) được thực hiện trên silica gel (Merck, Đức), cỡ hạt 63-200 μm, 63-100 μm và

40-63 μm

Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy Impact 410 Nicolet - Viện Hoá học, Viện

Khoa học và công nghệ Việt Nam

Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) được ghi trên thiết bị AutoSpec

Premier, Waters, USA - khoa Hóa học, trường đại học khoa học tự nhiên- Đại học

quốc gia Hà Nội

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 500 MHz), phổ cộng hưởng

từ hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR, 125 MHz) với chương trình DEPT và phổ cộng

hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR) được ghi trên thiết bị Bruker AV 500

speRJrometer Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị theo ppm Tetrametylsilan

(TMS) là chất chuẩn nội zero- Viện hóa học, viện Khoa học và công nghệ Việt

Nam

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Prominence, Shimadzu,

Detectơ UV Phân tích được thực hiện trên cột sắc ký Ascentis C18 (cỡ hạt 5 m, 4,6

mm  250 mm) và cột bảo vệ C18 (cỡ hạt 5 m, 4,6 mm  7,5 mm) Kiểm soát hệ

thống sắc ký và xử lý số liệu được thực hiện với phần mềm LC solution- Viện Dược

liệu

Đo điểm nóng chảy trên máy SMP3 (Stuart) - Viện Dược liệu

Độ quay cực được đo trên máy phân cực kế Electronic Polarimeter- P3001 -

Viện Dược liệu

3.1.2 Hóa chất

Các dung môi dùng để tách chiết và phân lập các chất như EtOH, MeOH,

n-butanol, EtOAc, điclometan, n-hexan công nghiệp, được tinh chế lại

Các dung môi dùng phân tích HPLC như ACN (Merck), H3PO4 (Merck), MeOH (Merck) Mẫu đối chiếu: resveratrol, piceid được chiết tách từ cây cốt khí

củ, với độ tinh khiết cao (>95%)

3.2 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Nguyên liệu thực vật là rễ của cây cốt khí củ hay còn gọi là củ cốt khí

(Reynoutria Japonica Houtt.) được thu thập tại làng Nghĩa Trai (xã Tân Quang,

Văn Lâm, Hưng Yên) vào tháng 10 năm 2011 được dùng để tách chiết và phân lập các chất

Mẫu rễ cốt khí củ được mua tại phố Lãn Ông- Hà Nội được dùng để định lượng so sánh

Mẫu thực vật được lưu tiêu bản tại phòng thí nghiệm Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia

Hà Nội

3.3 ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG RỄ CỐT KHÍ CỦ

3.3.1 Định tính các thành phần trong dịch chiết ete dầu hỏa

Cân khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet Chiết bằng ete dầu hỏa đến khi dung môi trong bình chiết không màu Dịch chiết đem cất thu hồi bớt dung môi Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính chất béo, tinh dầu, phytosterol và carotenoit

(1) Định tính chất béo

Nhỏ vài giọt dịch chiết ete dầu hỏa trên giấy lọc, hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy

(2) Định tính carotenoit

Cô 5ml dịch chiết ete dầu hỏa tới cắn Thêm 1-2 giọt axit sunfuric đặc, thấy xuất hiện màu xanh ve

(3) Định tính phytosterol

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ete dầu hỏa Bốc hơi dung môi đến khô Cho vào ống nghiệm 1ml anhydrit axetic, lắc kỹ, thêm 1ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Kết quả cho thấy giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím

đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu xanh

3.3.2 Định tính các thành phần trong dịch chiết etanol

Bã dược liệu sau khi chiết bằng ete dầu hỏa để bay hơi dung môi đến khô Chiết hồi lưu với 50ml cồn 900 trong 30 phút Dịch chiết được lọc và cô còn 10ml

để làm các phản ứng định tính flavonoit, coumarin, saponin, axit hữu cơ và axit amin

(1) Định tính saponin

- Phản ứng tạo bọt: Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1N và ống thứ 2 là 5ml NaOH 0,1N Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dịch chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây Để yên, thấy ống kiềm có cột bọt bền và cao gấp hai ống kia

- Phản ứng Salkowski: Lấy 10ml dịch chiết cồn cho vào bình cầu và thêm 10ml axit sunfuric loãng Đun cách thủy sinh hàn ngược trong 4 giờ Để nguội và chiết với clorofom

Lấy khoảng 2ml dịch chiết clorofom cho vào ống nghiệm Thêm từ từ 1ml axit sunfuric đặc theo thành ống nghiệm, mặt tiếp xúc giữa hai lớp xuất hiện vòng màu tím

- Phản ứng Liebermann - Burchardt: Lấy 0,2ml dịch chiết clorofom ở trên cho vào một ống nghiệm rồi cô tới cắn Cho vào cắn 0,5ml anhydrit axetic, lắc đều, đặt nghiêng ống 45o rồi thêm 0,5ml axit sunfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống chia thành 2 lớp: Lớp axit ở dưới và lớp anhydrit ở trên Mặt tiếp

xúc giữa hai lớp chất lỏng trong ống nghiệm xuất hiện màu tím đỏ

(2) Định tính coumarin

- Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết cồn, ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Sau đó đun cả 2 ống nghiệm trên cách thủy sôi trong vài phút Ống thứ nhất có màu vàng xuất hiện Sau đó cho thêm vào mỗi ống 2ml nước cất thấy ống thứ nhất trong hơn ống thứ 2, nhưng sau khi axit hóa thì cả 2 ống đều đục như nhau (phản ứng dương tính)

- Phản ứng với thuốc thử điazo: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vào đó 2ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử điazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch (phản ứng dương tính)

- Vi thăng hoa : Cho vào trong một lọ penicilin một ít dịch chiết cồn Cô cách thủy cho bay hơi hết cồn rồi đậy lên miệng lọ một phiến kính, trên có một ít bông thấm nước và tiếp tục đun Lấy phiến kính và nhỏ 1 giọt KI 10%; soi kính hiển vi thấy có tạo tinh thể màu nâu

(3) Định tính flavonoit

- Phản ứng cyanidin : Cho 2ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một

ít bột magie kim loại, rồi thêm vài giọt axit clohyđric đặc; đun nóng trên cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ (phản ứng dương tính)

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% : Cho 2ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh sẫm

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng hiện rõ, khi soi dưới đèn tử ngoại thấy có màu vàng sáng (phản ứng dương tính)

(4) Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn và cô tới cắn Hòa cắn trong 1ml

nước và thêm vài tinh thể natri cacbonat thấy có bọt khí nổi lên

Lấy 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 15ml dung dịch

H2SO4 2%, đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6N đến pH kiềm Chiết ancaloit bằng clorofom (CHCl3)

3 lần, mỗi lần 5ml Dịch chiết CHCl3 được gộp lại và lắc với H2SO4 2% Gạn lấy lớp nước axit, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1ml để làm các phản ứng sau:

- Với thuốc thử Mayer (tủa trắng hay vàng nhạt)

- Với thuốc thử Bouchardat (tủa nâu)

- Với thuốc thử Dragendorff (tủa vàng cam hoặc đỏ)

(2) Định tính anthranoid: (Phản ứng Borntraeger)

Cho vào ống nghiệm 1g bột dược liệu, thêm dung dịch H2SO4 25% tới ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5ml ete Lấy 1ml dịch ete cho vào ống nghiệm, thêm 1ml KOH 10%, quan sát màu của lớp dung dịch KOH (đỏ)

(3) Định tính tanin: (Phản ứng với gelatin 1%)

Lấy 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm nước ngập dược liệu rồi đun sôi vài phút Lọc nóng, lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, quan sát tủa (bông trắng)

(4) Định tính glycosid tim