Dựa trên phương pháp đã xác định được ở trên, chúng tôi tiến hành xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn của 2 hợp chất resveratrol và piceid.
Hỗn hợp chuẩn được chuẩn bị như sau: Chuẩn bị dung dịch gốc có thành phần: Resveratrol 45 μg/ml và piceid 260
μg/ml. Từ dung dịch gốc này, tiến hành pha loãng theo các tỷ lệ khác nhau để thu được các dung dịch khác với nồng độ được biểu diễn ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Nồng độ chất resveratrol và piceid trong hỗn hợp chuẩn
piceid resveratrol STT Nồng độ piceid (μg/ml) Spic (tlưu = 11,5 phút) Nồng độ resveratrol (μg/ml) Spic (tlưu = 23,8 phút) 1 8,1 498957 1,4 396057 2 16,3 1131520 2,8 842613 3 32,5 2257781 5,6 1676627 4 65,0 4565446 11,3 3398255 5 130,0 9443817 22,5 7206295 Đường chuẩn
Phương trình đường chuẩn piceid được cho như hình 4.4.
Kết quả thu được phương trình biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ piceid và giá trị diện tích pic là: y = 73167x – 10666. Trong đó, x là nồng độ piceid (µg/ml), y là giá trị diện tích pic thu được tại thời gian lưu 11,5 phút, hệ số tương quan R2 = 0,9998.
Diện tích Pic (S) y = 73167x - 106663 R2 = 0.9998 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 0 20 40 60 80 100 120 140 Nồng độ piceid (µg/ml)
Hình 4.4. Phương trình đường chuẩn piceid
Tương tự, ta xây dựng được phương trình đường chuẩn xác định resveratrol như hình 4.5. Diện tích pic (S) y = 321971x - 103616 R2 = 0.9991 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 0 5 10 15 20 25 Nồng độ resveratrol (µg/ml)
Hình 4.5. Phương trình đường chuẩn resveratrol
Kết quả thu được phương trình biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ resveratrol và giá trị diện tích pic là : y = 32197x – 10361. Trong đó, x là nồng độ resveratrol (µg/ml), y là giá trị diện tích pic thu được tại thời gian lưu 23,8 phút, hệ số tương quan R2 = 0,9991.
Trên cơ sở phương pháp xây dựng được, chúng tôi tiến hành phân tích mẫu dược liệu cốt khí củ. Mẫu được chuẩn bị như mục 3.8.2. Dựa trên sắc ký đồ thu được và áp dụng công thức tính hàm lượng :
Hàm lượng (%)
Trong đó: C: nồng độ hoạt chất tính theo phương trình đường chuẩn (µg/ml) m: khối lượng dược liệu cốt khí củ đem phân tích (g)
B: độ ẩm mẫu dược liệu (%)
Ta tính được hàm lượng chất resveratrol và piceid có trong các mẫu rễ cốt khí củ như bảng 4.3.
Bảng 4.3.Hàm lượng resveratrol và piceid có trong các mẫu rễ cốt khí củ
Piceid Resveratrol Mẫu Khối lượng (g) Độ ẩm (%) Spic (tlưu = 11,5 phút) Spic (tlưu = 23,8 phút) Hàm lượng Piceid (%)* Hàm lượng trung bình Piceid (%)* Hàm lượng Resveratrol (%)* Hàm lượng trung bình Resveratrol (%)* 0,2626 2602391 233141 0,79 0,167 0,2573 2361394 211658 0,73 0,155 RJ1 0,2578 13,66 2479177 232010 0,76 0,760 ± 0,030 0,169 0,164 ± 0,008 0,2412 1718826 149617 0,56 0,116 0,2566 1791701 161483 0,54 0,118 RJ2 0,2793 11,76 1951146 169491 0,54 0,547 ± 0,011 0,113 0,116 ± 0,002
*: Hàm lượng hoạt chất trong dược liệu tính theo dược liệu khô tuyệt đối. Như vậy trong rễ cốt khí củ thu mua tại làng dược liệu Nghĩa Trai - Hưng Yên (RJ1) hàm lượng trung bình của resveratrol là 0,164 ± 0,008%; của piceid là
0,760 ± 0,030%.Trong khi đóhàm lượng trung bình của resveratrol và piceidmua tại hiệu thuốc ở phố Lãn Ông- Hà Nội (RJ2) tương ứng là 0,116 ± 0,002% và 0,547 ± 0,011%.Như vậy, hàm lượng của cả resveratrol và piceid trong dược liệu mua tại Nghĩa Trai- Hưng Yên đều cao hơn hàm lượng tương ứng của chúng khi mua tại phố Lãn Ông- Hà Nội. Ngoài ra, hàm lượng của piceid trong cả hai mẫu dược liệu đều cao hơn nhiều so với hàm lượng resveratrol.
KẾT LUẬN
Luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây cốt khí củ (Reynoutria Japonica Houtt.)” đã thu được các kết quả chính sau:
1. Đã xây dựng được quy trình chiết để phân bố các hợp chất hữu cơ từ rễ cây cốt khí củ (Reynoutria Japonica Houtt., Polygonaceae) theo độ phân cực tăng dần vào các phần chiết n-hexan (RJH, hiệu suất chiết 1,25 % so với lượng nguyên liệu khô), etyl axetat (RJE, 4,00%), n-butanol (RJB, 2,72%) và nước (RJW, 5,00%).
2. Đã định tính các nhóm chất và xác nhận sự có mặt của các nhóm ancaloit, glycosid tim, flavonoit, coumarin, anthranoid, axit hữu cơ, saponin, tanin, đường khử, axit amin, chất béo, caroten, phytosterol trong rễ cốt khí củ.
3. Đã phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) các phần chiết nhận được để xác định các điều kiện sắc ký định tính các phần chiết này và các hệ dung môi thích hợp cho phân tách sắc ký cột các phần chiết.
4. Bằng các kỹ thuật sắc ký điều chế đã phân lập được 16 hợp chất từ các phần chiết (RJH, RJE, RJB) rễ cốt khí củ.
5. Đã xác định được cấu trúc của 11 hợp chất trong số các hợp chất được phân lập chủ yếu bằng các phương pháp phổ (EI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC). Trong số các thành phần chính được phân lập có 2 stilben là resveratrol và piceid, 4 anthraquinon là emodin, physcion, anthraglycosid A và anthraglycosid B, một naphtoquinon là eleutherin, một ankaloid là reserpin, 2 phytosterol là β-sitosterol và daucosterol, một đime anthraquinon là emodin bianthron. Các hợp chất β-sitosterol daucosterol được nhận dạng bằng các phương pháp sắc ký (TLC và co-TLC) với chất chuẩn.
Các hợp chất reserpin, eleutherin và emodin bianthron là các chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Reynoutria và cây cốt khí củ (Reynoutria Japonica Houtt., Polygonaceae). Đây cũng là thông báo đầu tiên về sự có mặt của các hợp chất β-
sitosterol, daucosterol trong rễ cốt khí củ.
5. Luận văn đã áp dụng phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) định lượng để xác định nồng độ của hợp chất resveratrol và piceid có trong hai mẫu rễ cốt khí củ được thu mua tại làng dược liệu Nghĩa Trai- Hưng Yên
(RJ1) và hiệu thuốc ở phố Lãn Ông- Hà Nội (RJ2). Hàm lượng của resveratrol và piceid đã được xác định trong rễ cốt khí củ là 0,164 ± 0,008% (trong RJ1); 0,116 ± 0,002% (trong RJ2) đối với resveratrol; 0,760 ± 0,030% (trong RJ1); 0,547 ± 0,011% (trong RJ2) đối với piceid. Đây là thông báo đầu tiên về hàm lượng piceid trong rễ cốt khí củ trồng tại Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích (chủ biên), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa Học Kỹ Thuật , tập 1, tr. 529-531.
2. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ việt nam, NXB Trẻ, quyển 1, tr. 741-755.
3. Nguyễn Trần Giáng Hương (2003), “Nghiên cứu độc tính cấp và một số tác dụng dược lý của cốt khí củ”, Tạp chí y học thực hành, số 5, tr. 35-38.
4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 506- 507, 1175-1176.
5. Nguyễn Hải Nam, Lã Hải Chung (2007), “Phân lập resveratrol và emodin từ cốt khí củ (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc) trồng ở Việt Nam”, Tạp chí dược học, số 369, tr. 7-10.
6. Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Hải Nam, Nguyễn Tiến Vững (2007), “Ứng dụng LC-MS định lượng resveratrol trong cốt khí củ”, Tạp chí dược học, số 379, tr. 13-16.
Tài liệu tiếng Anh
7. Aggarwal BB, BhardwaJ A, Aggarwal RS, Seeram NP, Shishodia S, Takada Y (2004), “Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical studies”, Anticancer Res., 24(5A), pp. 2783-2840.
8. Ana I. Romero-Pe´rez, Maite Ibern-Go´mez, Rosa M. Lamuela-Ravento´s, and M. Carmen de la Torre-Boronat (1999), “Piceid, the major resveratrol derivative in Grape Juices”, J. Agric. Food Chem., 47, pp. 1533-1536.
9. Antoine Laurent de Jussieu (1789), “Genera plantarum: secundum ordines naturales disposita, juxta methodum in Horto regio parisiensi exaratam”,
Herrisant and Barrois: Paris, France, pp. 82.
products of Rauwolfia ancaloits”, Pak J Pharm Sci., 18(1), pp. 33-35.
11. Banerjee S, Bueso-Ramos C, Aggarwal BB (2002), “Suppression of 7,12 dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary carcinogenesis in rats by resveratrol: role of nuclear factor-kappaB, cyclooxygenase 2, and matrix metalloprotease 9”, Cancer Res., 62(17), pp. 4945-54.
12. Berardi, V., Ricci, F., Castelli, M., Galati, G., Risuleo, G. (2009), “Resveratrol exhibits a strong cytotoxic activity in cultured cells and has an antiviral action against polyomavirus: potential clinical use”, J. Exp. Clin. Cancer Res., 28, pp. 96.
13. Bin Shan, Yi-Zhong Cai, John D Brooks, Harold Corke (2008), “Antibacterial properties of Polygonum cuspidatum roots and their major bioactive constituents”, Food Chemistry, 109(3), pp. 530-537.
14. Bohumil Mandák, Petr Pyšek & Kateřina Bímová (2004), “History of the invasion and distribution of Reynoutria taxa in the Czech Republic: a hybrid spreading faster than its parents”, Preslia, Praha, 76, pp. 15–64.
15. Bret C. Vastano, Yong Chen, Nanqun Zhu, Chi-Tang Ho, Zhengyi Zhou, and Robert T. Rosen (2000), “Isolation and identification of stilbenes in two varieties of Polygonum cuspidatum”, J. Agric. Food Chem., 48 (2), pp. 253– 256.
16. Caining Zhang, Xiaozhe Zhang, Yan Zhang, Qing Xu, Hongbin Xiao, Xinmiao Liang (2006), “Analysis of estrogenic compounds in Polygonum cuspidatum by bioassay and high performance liquid chromatography”, Journal of Ethnopharmacology, 105, pp. 223–228.
17. Cheltsov, A.V., Aoyagi, M., Aleshin, A., Yu, E.C., Gilliland, T., Zhai, D., Bobkov, A.A., Reed, J.C., Liddington, R.C., Abagyan, R. (2010), “Vaccinia virus virulence factor N1L is a novel promising target for antiviral therapeutic intervention”, J. Med. Chem., 53, pp. 3899–3906.
Ho Kim (2004), “Inhibitory effects of Polygonum cuspidatum water extract
(PCWE) and itscomponent resveratrol on acyl-coenzyme A–cholesterol acyltransferaseactivity for cholesteryl ester synthesis in HepG2 cells”,
Vascular Pharmacology, 40, pp. 279– 284.
19. China Pharmacopoeia Committee (1999), “Pharmacopoeia of the People’s Republic of China”, China Chemical Industry Press, BeiJing, pp. 167.
20. Ching-Jer Chang, Curtis L. Ashendel, Thomas C. K. Chan, Robert L. Geahlen,
Jerry McLaughlin and David J. Waters (1999), “Oncogene signal
transduction inhibitors from Chinese medicinal plants”, Pure Appl. Chem.,
71(6), pp. 1101-1104.
21. Chu X, Sun A, Liu R (2005), “Preparative isolation and purification of five compounds from the Chinese medicinal herb Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc by high-speed counter current chromatography”, J Chromatogr A.,
1097 (1-2), pp. 33-39.
22. Craig C. Freeman and James L. Reveal (2005), “Polygonaceae” In: Flora of North America Editorial Committee (editors), Flora of North America, 5, pp. 216-601.
23. Dalei Zhang, Xiunan Li, Dongxia Hao, Guisheng Li, Benming Xu, Guanghui Ma, Zhiguo Su (2009), “Systematic purification of polydatin, resveratrol and anthraglycoside B from Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc”, Separation and Purification Technology, 66, pp. 329–339.
24. David J. Mabberley (2008), Mabberley's Plant-Book, Cambridge University Press.
25. Dionex, application note 232 (2005) “Determination of Anthraquinones and Stilbenes in Giant Knotweed rhizome by HPLC with UV detection”, The Chinese Pharmacopeia Edition.
A.L. (1999), “Resveratrol inhibition of herpes simplex virus replication”,
Antiviral Research, 43, pp. 145–155.
27. Docherty, J.J., Sweet, T.J., Bailey, E., Faith, S.A., Booth, T. (2006), “Resveratrol inhibition of varicella-zoster virus replication in vitro”,
Antiviral Research, 72, pp. 171–177.
28. Donggeng Wanga, Yuerong Xu, Wenying Liu (2008), “Tissue distribution and excretion of resveratrol in rat after oral administration of Polygonum cuspidatum extract (PCE)”, Phytomedicine, 15, pp. 859–866.
29. Donnelly LE, Newton R, Kennedy GE, Fenwick PS, Leung RH, Ito K, Russell RE, Barnes PJ (2004), “Anti-inflammatory effects of resveratrol in lung epithelial cells: molecular mechanisms”, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 287 (4), pp. 774-783.
30. Du J, Sun LN, Xing WW, Huang BK, Jia M, Wu JZ, Zhang H, Qin LP (2009), “Lipit-lowering effects of polydatin from Polygonum cuspidatum in hyperlipitemic hamsters”, Phytomedicine, 16 (6-7), pp. 652-658.
31. Editor Committee of Jiangsu New Medical College (2001), “Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine”, Shanghai, Shanghai Science and Technology
Press, pp. 1329.
32. Evers, D.L., Wang, X., Huong, S.M., Huang, D.Y., Huang, E.S. (2004), “3,4’,5- Trihydroxytrans - stilbene (resveratrol) inhibits human cytomegalovirus replication and virus-induced cellular signaling”, Antiviral Research, 63, pp. 85–95.
33. Feng L, Zhang LF, Yan T, Jin J, Tao WY (2006), “Studies on active substance of anticancer effect in Polygonum cuspidatum”, Zhong Yao Cai, 29 (7), pp.
689-691.
34. Feng Y., Huang S. L., Dou W., Zhang S., Chen J. H., Shen Y., Shen J. H., Leng Y. (2010), “Emodin, a natural product, selectively inhibits 11β-
hydroxysteroid dehydrogenase type 1 and ameliorates metabolic disorder in diet-induced obese mice”, British Journal of Pharmacology, 161(1), pp. 113–126.
35. Fuquan Yang, Tianyou Zhang, Yoichiro Ito (2001), “Large-scale separation of resveratrol, anthraglycoside A and anthraglycoside B from Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc by high-speed counter-current chromatography”,
Journal of Chromatography A, 919, pp. 443–448.
36. Guangsheng Qian, Sik-Yuen Leung, GuangHua Lu, and Kelvin Sze-Yin Leung (2006), “Differentiation of Rhizoma et Radix Polygoni cuspidati from closely related herbs by HPLC fingerprinting”, Chem. Pharm. Bull., 54(8), pp. 1179- 1186.
37. Guoqing Li and Yukio Ishikawa (2006), “Leaf epicuticular wax chemicals of the Japanese Knotweed Fallopia Japonica as oviposition stimulants for ostrinia latipennis”, Journal of Chemical Ecology , 32(3), pp. 595-604. 38. Hidemitsu Hara, Naoki Maruyama, Shinsuke Yamashita, Yasuhisa Hayashi,
Kuo-Hsiung Lee, Kenneth F. Bastow, Chairul, RyuJi Marumoto, Yasuhiro Imakura (1997), “Elecanacin, a novel new naphthoquinone from the bulb of
Eleutherine americana”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 45(10), pp. 1714-1716.
39. Hisashi Matsuda, Hiroshi Shimoda, Toshio Morikawa and Masayuki Yoshikawa (2001), “Phytoestrogens from the roots of Polygonum cuspidatum
(Polygonaceae): Structure-requirement of hydroxyanthraquinones for estrogenic activity”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 11, pp. 1839–1842.
40. Hongqiao Zhang, Albert Shih, Alessandra Rinna, Henry Jay Forman (2011), “Exacerbation of tobacco smoke mediated apoptosis by resveratrol: An unexpected consequence of its antioxidant action”, The International Journal
41. Hong-Wei Lin, Ming-Xue Sun, Yun-HuaWang, Liu-Meng Yang, Ying-Ruo Yang, Ning Huang, Li-Jiang Xuan, Ya-Ming Xu, Dong-Lu Bai, Yong-Tang Zheng, Kai Xiao (2010), “Anti-HIV activities of the compounds isolated from Polygonum cuspidatum and Polygonum multiflorum”, Planta Med,
76(9), pp. 889-892.
42. Hsiu-Mei Chiang, Shang-Yuan Tsai, Pei-Ling Hsiao, Chen-Yuan Chiu, Su-Lan Hsiu and Kuo-Ching Wen (2009), “Determination of total polyphenol glycosides in Polygoni Cuspidati Rhizoma and Rumecis Radix”, Journal of the Chinese Chemical Society, 56, pp. 341-350.
43. Hsu CY, Chan YP, Chang J. (2007), “Antioxidant activity of extract from
Polygonum cuspidatum”, Biol Res, 40(1), pp. 13-21.
44. Hsueh-Yueh Su, Shur-Hueih Cherng, Chien-Chung Chen, Huei Lee (1995), “Emodin inhibits the mutagenicity and DNA adducts induced by 1- nitropyrene”, Mutation Research, 329, pp. 205-212.
45. Hua Yan, Zhou Jianyu, Ni Wei, Chen Changxiang (2001), “Studies on the
constituents of Reynoutria Japonica Houtt.”, Natural Product Research and Development, 13(6), pp. 16-18.
46. Huan Zhang, Qing-Wen Zhang, Lei Wang, Xiao-Qi Zhang, Wen-Cai Ye and Yi-Tao Wang (2011), “Two new anthraquinone malonylglucosides from
Polygonum cuspidatum”, Natural Product Research, pp. 1–5.
47. Huang Wu-Yang, Yi-Zhong Cai, Jie Xing, Harold Corke, Mei Sun (2008), “Comparative analysis of bioactivities of four Polygonum species”, Planta Med., 74, pp. 43.
48. Huige Li, Ning Xia, Ulrich Förstermann (2012), “Cardiovascular effects and molecular targets of resveratrol”, Nitric Oxide, 26, pp. 102–110.
49. I. Galindo, B. Hernáez, J. Berná, J. Fenoll, J.L. Cenis, J.M. Escribano, C. Alonso (2011), “Comparative inhibitory activity of the stilbenes resveratrol
and oxyresveratrol on African swine fever virus replication”, Antiviral Research, 91, pp. 57–63.
50. Jiang QL, Pan JY, Ma J, Li YY, Xu BL (2007), “Variances of leptin mRNA in the adipose tissue of NAFLD rats intervened with the extracts of Polygonum
cuspidatum compound”, Zhong Yao Cai, 30(8),pp.974-977.
51. John Brandbyge (1993), “Polygonaceae in The Families and Genera of Vascular Plants”, Springer-Verlag, 2, pp. 531-544.
52. Juan Peng, Zengfeng Song, Chen Ma (2008), “Emodin studies on pharmacokinetics and distribution in rat liver after Polygonum cuspidatum
Sieb. et Zucc. Extract Administration”, World Science and Technology,
10(1), pp. 64–67.
53. Jung-Mi Yun, Alexander Chien, Ishwarlal Jialal, Sridevi Devaraj (2011), “Resveratrol up-regulates SIRT1 and inhibits cellular oxidative stress in the diabetic milieu: mechanistic insights”, The Journal of nutritional biochemistry, 1, pp. 1-7.
54. Jung-San Chang, Hong-Wen Liu, Kuo-Chih Wang, Mei-Chun Chen, Lien-Chai Chiang, Yi-Cheng Hua, Chun-Ching Lin (2005), “Ethanol extract of
Polygonum cuspidatum inhibits hepatitis B virus in a stable HBV-producing
cell line”, Antiviral Research, 66, pp. 29–34.
55. Kai Xiao, Lijiang Xuan, Yaming Xu, Donglu Bai (2000), “Stilbene glycoside sunfates from Polygonum cuspidatum”, J Nat Prod, 63, pp. 1373-1376. 56. Kai Xiao, Lijiang Xuan, Yaming Xu, Donglu Bai (2003), “Studies on the
chemical constituents of Polygonum cuspidatum”, Chin Pharm J., 38, pp. 12–14.
57. Kai Xiao, Lijiang Xuan, Yaming Xu, Donglu Bai, Dexin Zhong (2002), “Constituents from Polygonum cuspidatum”, Chem. Pharm. Bull., 50(5), pp. 605-608.
58. Kai Xiao, Lijiang Xuan, Yaming Xu, Donglu Bai, Dexin Zhong, Wang ZhongHua; Zhang NaiXia (2002), “Dimeric stilbene glycosides from
Polygonum cuspidatum”, Eur J Org Chem, pp. 564–568.
59. Kapadia, G.J., Azuine, M.A., Tokuda, H., Takasaki, M., Mukainaka, T., Konoshima, T., Nishino, H. (2002), “Chemopreventive effect of resveratrol, sesamol, sesame oil and sunflower oil in the Epstein–Barr virus early antigen