Hiện nay, các phương pháp phổ là công cụ hiện đại và hữu hiệu nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Các phương pháp được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất trong luận văn này bao gồm:
- Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS);
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H -NMR);
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D- NMR).
2.4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Dựa vào sự khác nhau về cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà người ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến. Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng pha thường và sắc ký lỏng pha đảo.
Hiện nay phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi trong việc phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… Luận văn này sử dụng phương pháp HPLC với cột sắc ký pha đảo dựa trên nguyên tắc hấp phụ xác định các thông số thời gian lưu, diện tích píc để định lượng các chất có trong dược liệu.
Chương 3: THỰC NGHIỆM 3.1.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
3.1.1. Thiết bị
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel (Merck, Đức) DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm.
Sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC) và sắc ký cột tinh chế (Mini- C) được thực hiện trên silica gel (Merck, Đức), cỡ hạt 63-200 μm, 63-100 μm và 40-63 μm.
Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy Impact 410 Nicolet - Viện Hoá học, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam.
Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) được ghi trên thiết bị AutoSpec Premier, Waters, USA - khoa Hóa học, trường đại học khoa học tự nhiên- Đại học quốc gia Hà Nội.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 500 MHz), phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR, 125 MHz) với chương trình DEPT và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR) được ghi trên thiết bị Bruker AV 500 speRJrometer. Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị theo ppm. Tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero- Viện hóa học, viện Khoa học và công nghệ Việt Nam.
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Prominence, Shimadzu, Detectơ UV. Phân tích được thực hiện trên cột sắc ký Ascentis C18 (cỡ hạt 5 m, 4,6 mm 250 mm) và cột bảo vệ C18 (cỡ hạt 5 m, 4,6 mm 7,5 mm). Kiểm soát hệ thống sắc ký và xử lý số liệu được thực hiện với phần mềm LC solution- Viện Dược liệu.
Đo điểm nóng chảy trên máy SMP3 (Stuart) - Viện Dược liệu. Độ quay cực được đo trên máy phân cực kế Electronic Polarimeter- P3001 -
3.1.2. Hóa chất
Các dung môi dùng để tách chiết và phân lập các chất nhưEtOH, MeOH, n- butanol, EtOAc, điclometan, n-hexan công nghiệp, được tinh chế lại.
Các dung môi dùng phân tích HPLC như ACN (Merck), H3PO4 (Merck), MeOH (Merck). Mẫu đối chiếu: resveratrol, piceid được chiết tách từ cây cốt khí củ, với độ tinh khiết cao (>95%).
3.2.NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT
Nguyên liệu thực vật là rễ của cây cốt khí củ hay còn gọi là củ cốt khí (Reynoutria Japonica Houtt.) được thu thập tại làng Nghĩa Trai (xã Tân Quang, Văn Lâm, Hưng Yên) vào tháng 10 năm 2011 được dùng để tách chiết và phân lập các chất.
Mẫu rễ cốt khí củ được mua tại phố Lãn Ông- Hà Nội được dùng để định lượng so sánh.
Mẫu thực vật được lưu tiêu bản tại phòng thí nghiệm Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
3.3.ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG RỄ CỐT KHÍ CỦ 3.3.1. Định tính các thành phần trong dịch chiết ete dầu hỏa
Cân khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet. Chiết bằng ete dầu hỏa đến khi dung môi trong bình chiết không màu. Dịch chiết đem cất thu hồi bớt dung môi. Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính chất béo, tinh dầu, phytosterol và carotenoit.
(1) Định tính chất béo
Nhỏ vài giọt dịch chiết ete dầu hỏa trên giấy lọc, hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy.
Cô 5ml dịch chiết ete dầu hỏa tới cắn. Thêm 1-2 giọt axit sunfuric đặc, thấy xuất hiện màu xanh ve.
(3) Định tính phytosterol
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ete dầu hỏa. Bốc hơi dung môi đến khô. Cho vào ống nghiệm 1ml anhydrit axetic, lắc kỹ, thêm 1ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Kết quả cho thấy giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu xanh.
3.3.2. Định tính các thành phần trong dịch chiết etanol
Bã dược liệu sau khi chiết bằng ete dầu hỏa để bay hơi dung môi đến khô. Chiết hồi lưu với 50ml cồn 900 trong 30 phút. Dịch chiết được lọc và cô còn 10ml để làm các phản ứng định tính flavonoit, coumarin, saponin, axit hữu cơ và axit amin.
(1) Định tính saponin
- Phản ứng tạo bọt: Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1N và ống thứ 2 là 5ml NaOH 0,1N. Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dịch chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây. Để yên, thấy ống kiềm có cột bọt bền và cao gấp hai ống kia.
- Phản ứng Salkowski: Lấy 10ml dịch chiết cồn cho vào bình cầu và thêm 10ml axit sunfuric loãng. Đun cách thủy sinh hàn ngược trong 4 giờ. Để nguội và chiết với clorofom.
Lấy khoảng 2ml dịch chiết clorofom cho vào ống nghiệm. Thêm từ từ 1ml axit sunfuric đặc theo thành ống nghiệm, mặt tiếp xúc giữa hai lớp xuất hiện vòng màu tím.
- Phản ứng Liebermann - Burchardt: Lấy 0,2ml dịch chiết clorofom ở trên cho vào một ống nghiệm rồi cô tới cắn. Cho vào cắn 0,5ml anhydrit axetic, lắc đều, đặt nghiêng ống 45o rồi thêm 0,5ml axit sunfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống chia thành 2 lớp: Lớp axit ở dưới và lớp anhydrit ở trên. Mặt tiếp
xúc giữa hai lớp chất lỏng trong ống nghiệm xuất hiện màu tím đỏ.
(2) Định tính coumarin
- Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết cồn, ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Sau đó đun cả 2 ống nghiệm trên cách thủy sôi trong vài phút. Ống thứ nhất có màu vàng xuất hiện. Sau đó cho thêm vào mỗi ống 2ml nước cất thấy ống thứ nhất trong hơn ống thứ 2, nhưng sau khi axit hóa thì cả 2 ống đều đục như nhau (phản ứng dương tính).
- Phản ứng với thuốc thử điazo: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vào đó 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử điazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
- Vi thăng hoa : Cho vào trong một lọ penicilin một ít dịch chiết cồn. Cô cách thủy cho bay hơi hết cồn rồi đậy lên miệng lọ một phiến kính, trên có một ít bông thấm nước và tiếp tục đun. Lấy phiến kính và nhỏ 1 giọt KI 10%; soi kính hiển vi thấy có tạo tinh thể màu nâu.
(3) Định tính flavonoit
- Phản ứng cyanidin : Cho 2ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi thêm vài giọt axit clohyđric đặc; đun nóng trên cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ (phản ứng dương tính).
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% : Cho 2ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh sẫm.
- Phản ứng với kiềm: Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng hiện rõ, khi soi dưới đèn tử ngoại thấy có màu vàng sáng (phản ứng dương tính).
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn và cô tới cắn. Hòa cắn trong 1ml nước và thêm vài tinh thể natri cacbonat thấy có bọt khí nổi lên.
(5) Định tính axit amin
Lấy 3ml dịch cồn cho vào ống nghiệm. Thêm 1-3 mảnh ninhydrin, đun sôi 2 phút, dung dịch chuyển màu tím.
3.3.3. Định tính các nhóm chất khác
(1) Định tính ancaloit
Lấy 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 15ml dung dịch H2SO4 2%, đun sôi vài phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6N đến pH kiềm. Chiết ancaloit bằng clorofom (CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5ml. Dịch chiết CHCl3 được gộp lại và lắc với H2SO4 2%. Gạn lấy lớp nước axit, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1ml để làm các phản ứng sau:
- Với thuốc thử Mayer (tủa trắng hay vàng nhạt) - Với thuốc thử Bouchardat (tủa nâu)
- Với thuốc thử Dragendorff (tủa vàng cam hoặc đỏ)
(2) Định tính anthranoid: (Phản ứng Borntraeger)
Cho vào ống nghiệm 1g bột dược liệu, thêm dung dịch H2SO4 25% tới ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút. Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5ml ete. Lấy 1ml dịch ete cho vào ống nghiệm, thêm 1ml KOH 10%, quan sát màu của lớp dung dịch KOH (đỏ).
(3) Định tính tanin: (Phản ứng với gelatin 1%)
Lấy 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm nước ngập dược liệu rồi đun sôi vài phút. Lọc nóng, lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, quan sát tủa (bông trắng).
Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml nước cất, ngâm ở nhiệt độ phòng 24 giờ. Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ, loại tạp bằng lượng thừa dung dịch chì acetat 30%, lọc loại tủa. Dịch lọc chuyển vào bình gạn, lắc với CHCl3 hai lần, mỗi lần 10ml. Dịch chiết được chia vào các ống nghiệm sạch rồi cô đến cắn, sau đó thử với các thuốc thử sau:
- Thuốc thử Liebermann (vòng tím đỏ và khuyếch tán màu xanh lá cây) - Thuốc thử Baljet (màu da cam)
- Thuốc thử Xanthydron (màu đỏ)
(5) Định tính đường khử tự do
Lấy 2ml dịch chiết nước cho vào ống nghiệm. Thêm vào đó 0,5ml thuốc thử Fehling A và 0,5ml thuốc thử Fehling B. Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính).
3.4. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ RỄ CỐT KHÍ CỦ
Rễ của cây cốt khí củ (2 kg) được xay nhỏ cỡ 1cm (đường kính 5 mm), sấy ở nhiệt độ 50 oC. Sau đó được ngâm chiết với etanol (EtOH) 90% ở nhiệt độ phòng, 3 lần, mỗi lần trong 4 ngày. Sau khi lọc tách nguyên liệu rắn, các dịch lọc EtOH 90% được gộp lại và cất loại EtOH dưới áp suất giảm cho một phần chiết EtOH (kí hiệu là RJ).
Phần chiết EtOH được hòa bằng nước cất sau đó được chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat và n-butanol cho các dịch chiết hữu cơ tương ứng. Các dịch chiết này được làm khan bằng Na2SO4 sau đó được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm thu được các phần chiết tương ứng n- hexan, etyl axetat và n-butanol. Cất kiệt dịch nước còn lại dưới áp suất giảm ở
100°C cho phần chiết nước.
Quy trình điều chế các phần chiết từ rễ cốt khí củ được trình bày tóm tắt ở
Sơ đồ 4.1, Mục 4.1, Chương 4: Kết quả và thảo luận. Hiệu suất các phần chiết từ rễ cốt khí củ được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu suất điều chế các phần chiết rễ cốt khí củ
STT Phần chiết Khối lượng (g) Hiệu suất (%) a)
1 n-Hexan (RJH) 30,00 1,50
2 Etyl axetat (RJE) 80,00 4,00 3 n-Butanol (RJB) 54,40 2,72
4 Nước (RJW) 100,00 5,00 a)
Hiệu suất được tính theo khối lượng nguyên liệu khô
3.5. PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm.
Thuốc thử hiện màu là dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1%, bản mỏng sau khi phun thuốc thử được hơ nóng ở 120oC hoặc thuốc thử Dragendorff, dung dịch FeCl3 10%
3.5.1. Phân tích phần chiết n-hexan (RJH)
Hệ dung môi triển khai cho sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan là n-hexan- axeton với tỷ lệ 9:1 và 4:1 (v/v).
Kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan (RJH), trong các hệ dung môi được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Phân tích TLC phần chiết n-hexan (RJH) Hệ dung môi n-hexan: axeton STT Rf Dạng vệt Hiện màu (vanilin/H2SO4) Ánh sáng tử ngoại Hiện màu (vanilin/H2SO4)/tº 1 0,68 Tròn -- -- -- -- Tím 2 0,63 Tròn Vàng Vàng sáng Đỏ- vàng 3 0,35 Tròn Vàng -- Tím 4 0,23 Tròn -- -- Tím 9:1 5 0,10 Tròn Nâu Nâu Đỏ- vàng 1 0,71 Tròn Vàng Vàng sáng Đỏ- vàng 2 0,48 Tròn Vàng -- Tím 3 0,38 Tròn -- -- Tím 4 0,23 Tròn Nâu Nâu Đỏ- vàng 4:1 5 0,15 Tròn -- Hồng Tím
3.5.2. Phân tích phần chiết etyl axetat (RJE)
Hệ dung môi triển khai cho sắc ký lớp mỏng phần chiết etyl axetat là điclometan : metanol với các tỷ lệ khác nhau 20:1, 9:1 và 4:1 (v/v).
Kết quả phân tích TLC phần chiết etyl axetat rễ cốt khí củ (RJE) trong các hệ dung môi được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Phân tích phần chiết etyl axetat (RJE) Hệ dung môi điclometan : metanol STT Rf Dạng vệt Hiện màu (vanilin/H2SO4) Ánh sáng tử ngoại Hiện màu (vanilin/H2SO4)/tº 1 0,95 Tròn Vàng -- Tím 2 0,75 Tròn -- -- Tím 3 0,63 Tròn Vàng Nâu đỏ Vàng 4 0,34 Tròn -- Cam Vàng điclometan : metanol 20:1 5 0,30 Tròn -- Tím đỏ Da cam 1 0,80 Tròn Vàng Nâu đỏ Vàng 2 0,51 Tròn -- Cam Vàng 3 0,48 Tròn -- Tím đỏ Da cam 4 0,40 Tròn -- Đỏ Đen 5 0,25 Tròn -- -- Tím 6 0,21 Tròn -- Vàng Da cam 7 0,13 Tròn -- -- Tím 9:1 8 0,06 Tròn Tím Xanh tím Tím 1 0,88 Tròn -- -- Tím 2 0,80 Tròn -- Vàng Da cam 3 0,69 Tròn -- -- Tím 4:1 4 0,37 Tròn Tím Xanh tím Tím
3.5.3. Phân tích phần chiết n-butanol (RJB)
Hệ dung môi triển khai TLC phần chiết n-butanol là điclometan-metanol - nước với tỷ lệ 9:1:0,1 và 3:1:0,1 (v/v). Kết quả phân tích TLC phần chiết n-butanol (RJB) trong các hệ dung môi được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Phân tích phần chiết n-butanol (RJB) Hệ dung môi điclometan : metanol : nước STT Rf Dạng vệt Hiện màu (vanilin/H2SO4) Ánh sáng tử ngoại Hiện màu (vanilin/H2SO4)/tº 1 0,86 Tròn vàng Tím lục Vàng 2 0,76 Tròn -- Tím Đen 3 0,55 Tròn Nâu Tím Đen 4 0,39 Tròn -- -- Đen 9:1: 0,1
5 0,23 Dài Nâu Tím Đen
1 0,65 Tròn Nâu Tím Đen
2 0,43 Tròn -- -- Đen
3:1:0,1
3 0,27 Dài Nâu Tím Đen
3.6. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHẦN CHIẾT 3.6.1. Phân tách phần chiết n-hexan (RJH) 3.6.1. Phân tách phần chiết n-hexan (RJH)
Phần chiết n-hexan (15 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan-axeton với các tỷ lệ 100:1, 20:1, 10:1, 9:1, 4:1, 3:1 và 2:1 (v/v) được 300 phân đoạn, mỗi