3.6.1. Phân tách phần chiết n-hexan (RJH)
Phần chiết n-hexan (15 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan-axeton với các tỷ lệ 100:1, 20:1, 10:1, 9:1, 4:1, 3:1 và 2:1 (v/v) được 300 phân đoạn, mỗi phân đoạn 30 ml. Các phân đoạn có sắc ký đồ TLC giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 11 nhóm phân đoạn RJH1 (các phân đoạn 1- 12), RJH2 (13-56), RJH3 (57-77), RJH4 (78-178), RJH5 (179-188), RJH6 (189- 204), RJH7 (205-217), RJH8(218-230), RJH9(231-241), RJH10 (242-276),
RJH11 (277-300).
Nhóm phân đoạn RJH 2 (2,02 g) được được tinh chế bằng Mini-C trên silica gel (40-63 µm) với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 10:1, 6:1 và 2:1. Qua phân tích TLC các phân đoạn được gộp thành 5 nhóm phân đoạn từ RJH2.1 đến RJH2.5.
Nhóm phân đoạn RJH2.3 (45 mg) được rửa với dung môi n-hexan, sau đó kết tinh lại trong hệ dung môi n-hexan-axeton cho tinh thể hình kim màu vàng RJH2 (15 mg). Nhóm phân đoạn RJH2.4 (102 mg) được rửa với dung môi n-hexan, sau đó kết tinh lại trong hệ dung môi n-hexan-axeton cho tinh thể hình kim không màu
RJH2.4 (30 mg).
Nhóm phân đoạn RJH3 (2,06 g) được rửa bằng n-hexan sau đó rửa với hệ
dung môi n-hexan-axeton 5:1, sau đó kết tinh lại trong axeton cho các tinh thể hình kim màu vàng RJH3 (12 mg).
Nhóm phân đoạn RJH4 (6,03 g) được rửa bằng n-hexan sau đó rửa với hệ
dung môi n-hexan-axeton 5:1, sau đó kết tinh lại trong axeton cho các tinh thể hình kim màu vàng RJH4 (2,62 g).
Nhóm phân đoạn RJH6 (0,23 g) được rửa bằng metanol cho chất vô định hình màu tím RJH6 (25 mg)
Nhóm phân đoạn RJH10 (1,33 g) được rửa bằng axeton, sau đó được kết tinh lại trong hệ điclometan-metanol cho chất vô định hình màu trắng RJH10
(200mg).
Quá trình phân tách phần chiết n-hexan được trình bày trong Sơ đồ 4.2, Mục 4.3.1., Chương 4: Kết quả và thảo luận.
3.6.2. Phân tách phần chiết etyl axetat (RJE)
Phần chiết etyl axetat (RJE) (25 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 0,063-0,2 mm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải sắc ký với điclometan và hệ dung môi gradient điclometan- metanol 100:1, 20:1, 15:1, 10:1, 4:1 và 2:1 (v/v) cho 400 phân đoạn, mỗi phân đoạn 30 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 23 nhóm phân đoạn RJE1 (các phân đoạn 1- 19), RJE2 (20-31), RJE3 (32-39), RJE4 (40-48), RJE5 (49-51), RJE6 (52-80),
131), RJE12 (132-136), RJE13(137-149), RJE14 (150-160), RJE15 (161-168),
RJE16(169-190), RJE17(190-236), RJE18 (237-277), RJE19 (278-289),
RJE20(290-345), RJE21 (346-358), RJE22 (359-373), RJE23 (374-400).
Nhóm phân đoạn RJE1 (1,90 g) được rửa bằng metanol cho các tinh thể hình kim màu vàng RJE1 (0,37 g)
Nhóm phân đoạn RJE5 (0,86 g) được rửa bằng n-hexan hệ dung môi n-
hexan-axeton sau đó được kết tinh lại trong axeton cho chất vô định hình màu vàng nhạt RJE5 (13 mg)
Nhóm phân đoạn RJE7 (1,65 g) được rửa bằng n-hexan và hệ dung môi n- hexan-axeton sau đó được kết tinh lại trong axeton cho các tinh thể hình kim màu vàng RJE7 (0,51 g). Phân tích TLC cho thấy các tinh thể này là RJH4 đã được phân lập từ nhóm phân đoạn RJH4.
Nhóm phân đoạn RJE11 (1,50 g) được tinh chế trên silica gel cỡ hạt 40-63 µm, rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton. Dựa trên phân tích TLC các phân đoạn có sắc kí đồ giống nhau được gộp lại cho 3 nhóm phân đoạn từ RJE11.1
đến RJE11.3. Nhóm phân đoạn RJE11.2 (0,09 g) được rửa với dung điclometan cho các tinh thể hình kim màu vàng nhạt RJE11 (20 mg).
Nhóm phân đoạn RJE13 (0,52 g) được rửa bằng metanol sau đó được kết tinh lại trong điclometan cho tinh thể hình kim màu trắng RJE13 (20 mg).
Nhóm phân đoạn RJE14 (2,23 g) tinh chế trên silica gel cỡ hạt 40-63 µm, rửa giải với hệ dung môi n-hexan-axeton 7:3. Dựa trên phân tích TLC các phân
đoạn có sắc kí đồ giống nhau được gộp lại cho 4 nhóm phân đoạn từ RJE14.1 đến
RJE14.4. Nhóm phân đoạn RJE14.3 (0,13 g) được rửa với dung môi etyl axetat cho tinh thể hình kim màu trắng RJE14 (50 mg).
Nhóm phân đoạn RJE18 (2,24 g) tinh chế trên silica gel cỡ hạt 40-63 µm, rửa giải với hệ dung môi gradient điclometan-metanol. Dựa trên phân tích TLC các phân đoạn có sắc kí đồ giống nhau được gộp lại cho 4 nhóm phân đoạn từ RJE18.1
đến RJE18.4. Nhóm phân đoạn RJE18.1 (0,06 g) được rửa với dung môi metanol sau đó được kết tinh lại trong hệ điclometan-metanol cho tinh thể hình kim màu vàng RJE18.1 (25 mg). Nhóm phân đoạn RJE18.2 (0,78 g) được rửa với dung môi metanol sau đó được kết tinh lại trong hệ điclometan-metanol cho tinh thể hình lá màu vàng đậm RJE18.2 (350 mg).
Nhóm phân đoạn RJE21 (3,76 g) tinh chế trên silica gel cỡ hạt 40-63 µm, rửa giải với hệ dung môi gradient điclometan-metanol. Dựa trên phân tích TLC, các phân đoạn có sắc kí đồ giống nhau được gộp lại cho 4 nhóm phân đoạn từ RJE21.1
đến RJE21.4. Nhóm phân đoạn RJE21.4 (3,07g) được rửa với dung môi etyl axetat cho tinh thể hình kim màu trắng RJE21 (1,35g).
Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat được trình bày trong Sơ đồ 4.3, Mục 4.3.2., Chương 4: Kết quả và thảo luận.
3.6.3. Phân tách phần chiết n-butanol (RJB)
Phần chiết n-butanol (RJB) (20 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 0,063-0,2 mm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải sắc ký với điclometan và hệ dung môi gradient điclometan- metanol-nước 15:1:0,1, 9:1:0,1 và 3:1:0,1 (v/v) cho 200 phân đoạn mỗi phân đoạn 30 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 9 nhóm phân đoạn RJB1 (các phân đoạn 1- 16), RJB2 (17-27), RJB3 (28-39), RJB4 (40-47), RJB5 (48-86), RJB6 (87- 101),
RJB7 (102-135), RJB8 (136-180), RJB9 (181-200).
Nhóm phân đoạn RJB1 (1,05 g)được rửa bằng axeton cho các tinh thể hình kim màu vàng RJB1 (15mg).
Nhóm phân đoạn RJB2 (1,27 g) được rửa bằng metanol cho các tinh thể hình kim màu vàng RJB2 (20 mg).
Quá trình phân tách phần chiết n-butanol được trình bày trong Sơ đồ 4.4, Mục 4.3.3., Chương 4: Kết quả và thảo luận.
3.7. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP PHÂN LẬP
β-Sitosterol
Được phân lập từ phân đoạn RJH2.4.
Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 135-136 oC.
Rf = 0,44 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 4:1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Daucosterol
Được phân lập từ phân đoạn RJH10.
Bột vô định hình màu trắng, đ.n.c. 296-298 oC.
Rf = 0,41 (TLC, silica gel, điclometan- metanol 9:1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Emodin
Được phân lập từ phân đoạn RJH4 và RJE7
Tinh thể hình kim màu vàng, đ.n.c. 256-257 oC.
Rf = 0,5 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 3:1, v/v), hiện màu đỏ với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1% và chuyển dần sang màu vàng.
1 H-NMR (500 MHz, axeton-d6): δ (ppm), 12,13 (1H, s, OH–8), 12,00 (1H, s, OH–1), 7,50 (1H, s, H–4), 7,20 (1H, d, J = 2,5 Hz, H–5), 6,61 (1H, d, J = 2,5 Hz, H–7), 7,08 (1H, s, H–2), 2,44 (3H, s, CH3). 13 C-NMR (500 MHz, axeton-d6): δ (ppm) 21,9 (6-CH3), 108,8 (C-4), 109,6 (C-2), 110,4 (C-9a), 114,4 (C-8a), 121,4 (C-5), 124,8 (C-7), 124,9 (C-10a), 134,1 (C-4a), 149,5 (C-6), 163,2 (C-8), 166,2 (C-1), 166,3 (C-3), 182,0 (C-10), 191,6 (C- 9).
Physcion
Được phân lập từ phân đoạn RJE1.
Tinh thể hình kim màu vàng, đ.n.c. 206-208 oC.
Rf = 0,72 (TLC, silica gel, điclometan-axeton 15:1, v/v) hiện màu vàng với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. 1 H-NMR (500 MHz, axeton-d6): δ (ppm) 12,27 (1H, s, OH–8), 12,08 (1H, s, OH–1), 7,33 (1H, s, H-4), 7,59 (1H, s, H-5), 6,65 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2), 7,05 (1H, s, H-7), 3,93 (3H, s, OCH3), 2,44 (3H, s, CH3). 13 C-NMR (500 MHz, axeton-d6): δ (ppm) 165,1 (C-1), 108,1 (C-2), 166,5 (C-3), 106,7 (C-4), 121,2 (C-5), 148,4 (C-6), 124,4 (C-7), 162,5 (C-8), 190,7 (C- 9), 181,9 (C-10), 135,2 (C-4a), 113,6 (C-8a), 110,2 (C-9a), 133,2 (C-10a), 55,0 (3- OCH3), 22,1 (6-CH3).
Anthraglycosid A
Được phân lập từ phân đoạn RJE18.1.
Tinh thể hình kim màu vàng, đ.n.c. 229-231 oC.
Rf = 0,67 (TLC, silica gel, điclometan-metanol 7:1, v/v), hiện màu vàng với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%): 446 (M+, C22H22O10), 284 (84), 241 (21), 167 (42), 149 (100), 113 (24), 71 (36), 56 (52). 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 13,07 (1H, s, OH-1), 7,46 (1H, s, H-5), 7,34 (1H, d, J=2,5 Hz, H-4), 7,17 (1H, s, H-7), 7,16 (1H, d, J=3,0 Hz, H-2), 2,96 (3H, s, -OCH3-6), 2,40 (3H, s, -CH3-3); gốc đường: 4,71 (1H, d, J= 5,0 Hz, H-1’), 3,74 (1H, dd, J= 4,5; 10,5 Hz, H-2’), 3,50-3,32 (4H, H-5’, H-6’, H-3’), 3,19 (1H, m, H-4’), 5,17-5,11 (4-OH của gốc đường).
13
C-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 161,7 (C-1), 119,3 (C-2), 147,1 (C-3), 124,2 (C-4), 106,5 (C-5), 164,7 (C-6), 107,3 (C- 7), 160,7 (C-8), 186,4 (C-
9), 181,8 (C-10), 132,0 (C-4a), 113,4 (C-8a), 114,4 (C-9a), 136,3 (C- 10a), 56,1 (OCH3), 21,4 (CH3); gốc đường: 100,7 (C-1’), 73,2 (C-2’), 76,5 (C-3’), 69,8 (C- 4’), 77,4 (C-5’), 60,8 (C-6’).
Anthraglycosid B
Được phân lập từ phân đoạn RJE18.2.
Tinh thể hình lá, màu vàng đậm, đ.n.c. 248-251oC.
Rf = 0,61 (TLC, silica gel, điclometan-metanol 7:1, v/v), hiện màu vàng da cam với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 13,10 (1H, d, J=7,0 Hz, OH-1), 7,37 (1H, d, J= 9,5 Hz, H-5), 7,24 (1H, t, H-4), 7,08 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-7), 6,98 (1H, s, H-2), 2,35 (3H, d, J=4,5 Hz, CH3-3); gốc đường: 5,04 (1H, d, J= 8,0, H-1’), 3,72 (1H, d, J= 12,0 Hz, H-2’), 3,52 (1H, dd, J= 5,5; 12,0 Hz, H-5’), 3,42 (2H, m, H-6’), 3,33 (1H, t, J= 8,5 Hz, H-3’), 3,24 (1H, t, J= 8,5 Hz, H-4’). 13 C-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 161,7 (C-1), 119,3 (C-2), 147,0 (C-3), 124,2 (C-4), 101,0 (C-5), 164,2 (C-6), 108,4 (C- 7), 161,2 (C-8), 186,5 (C- 9), 182,1 (C-10), 132,1 (C-4a), 113,4 (C-8a), 114,4 (C-9a), 136,5 (C- 10a), 21,5 (CH3), gốc đường: 100,9 (C-1’), 73,4 (C-2’), 76,4 (C-3’), 69,6 (C-4’), 77,3 (C-5’), 60,7 (C-6’).
Resveratrol
Được phân lập từ phân đoạn RJE 14.
Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 256-257 oC.
Rf = 0,42 (TLC, silica gel, điclometan-metanol 15:1, v/v), hiện màu tím đen với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%, màu xanh đen với thuốc thử FeCl3 5%
1
H-NMR (500 MHz, axeton-d6), δ (ppm): 8,44 (1H, s, OH), 8,18 (1H, s, OH), 6,27 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4), 6,54 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2,6), 7,41 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’,6’), 6,83 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’,5’), 6,88 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-
a), 7,02 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-b). 13 C-NMR (500 MHz, axeton-d6), δ (ppm): 140,9 (C-1), 105,7 (C-2), 159,5 (C-3), 102,6 (C-4), 159,5 (C-5), 105,7 (C-6), 128,7 (C-a), 129,1 (C-b), 129,9 (C- 1’), 126,8 (C-2’), 116,4 (C-3’), 158,1(C-4’), 116,4 (C-5’), 126,8 (C-6’). Piceid
Được phân lập từ phân đoạn RJE21.
Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 223-226 ºC.
Rf = 0,44 (TLC, silica gel, điclometan- metanol 4:1, v/v), hiện màu tím đen với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
1 H-NMR (500 MHz, axeton-d6), δ (ppm): 8,52 (2H, d, OH), 7,41 (2H, d, J=8,5 Hz, H-2’, 6’), 7.09 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-b), 6,91 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-a), 6,83 (1H, d, J=8,5 Hz, H-3’, 5’), 6,81 (1H, s, H-2), 6,67 (1H, s, H-6), 6,48 (1H, t, J=2,0 Hz, H-4), 4,94 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1’’), 3,92 (1H, dd, J= 2,0, 11,5 Hz, H- 2’’), 3,72 (1H, dd, J= 6,0; 12,0 Hz, H-5’’), 3,52-3,56 (2H, m, H-3’’,4’’), 3,43-3,48 (2H, m, H-6’’). 13 C-NMR (500 MHz, axeton-d6), δ (ppm): 140,8 (C-1), 108,2 (C-2), 159,3 (C-3), 103,9 (C-4), 160,2 (C-5), 106,5 (C-6), 126,9 (C-a), 129,6 (C-b), 129,8 (C-1’), 128,7 (C-2’), 116,4 (C-3’), 158,2 (C-4’), 116,4 (C-5’), 128,7 (C-6’); gốc đường 102,0 (C-1’’), 78,0 (C-5’’), 77,7 (C-2’’), 74,7 (C-3’’), 71,4 (C-4’’), 62,7 (C-6’’). Reserpin
Được phân lập từ phân đoạn RJE13
Tinh thể hình kim màu trắng đục, đ.n.c. 264-266 oC.
Rf = 0,56 (TLC, silica gel, điclometan-metanol 9:1, v/v), hiện màu nâu với
thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%, hiện màu da cam với thuốc thử Dragendorff. IR (KBr) cm-1: 3443 (NH), 2943, 2843 (CH), 1728, 1710 (C=O), 1591, 1501, 1457 (>C=C< thơm), 1123, 1125 (C-O-C este).
EI-MS: m/z (%): 608 (100) ([M]+, C33H40N2O9), 609 (56), 607 (79), 448 (5), 395 (57), 195 (28). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,61 (1H, s, -NH), 7,32 (2H, s, H-24, 28), 7,26 (1H, s, H-9), 6,84 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-12), 6,78 (1H, dd, J = 1,5; 8,5 Hz, H-10), 5,05 (1H, m, H-18), 4,48 (1H, s, H-3), 2,94 (1H, m, H-6a), 2,51 (1H, s, H-6b), 3,18 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-5a), 3,20 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-5b), 2,31 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-14a), 1,82 (1H, d, J = 14,0 Hz, H-14b), 3,06 (1H, dd, J = 3,5; 11,5 Hz, H-21a), 2,48 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-21b), 2,05 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-15), 2,70 (1H, dd, J = 5,0; 11,5 Hz, H-16), 3,93 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-17), 2,36 (1H, m, H- 19a), 1,99 (1H, 2t, J = 4,0; 4,5; 13,0 Hz, H-19b), 1,91 (1H, d, J = 13,0 Hz, H-20), 3,83 (3H, s, H-29), 3,82 (3H, s, H-31), 3,91 (3H, s, H-32), 3,92 (3H, s, H-33), 3,91 (3H, s, H-34), 3,51 (3H, s, H-35). 13 C-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 130,0 (C-2), 53,8 (C-3), 51,2 (C-5), 16,7 (C-6), 108,1 (C-7), 122,1 (C-8), 118,5 (C-9), 109,1 (C-10), 156,3 (C-11), 95,2 (C-12), 136,4 (C-13), 24,27 (C-14), 32,2 (C-15), 51,8 (C-16), 77,8 (C-17), 77,9 (C-18), 29,7 (C-19), 33,9 (C-20), 49,0 (C-21), 172,8 (C-22), 125,3 (C-23), 106,8 (C-24), 152,9 (C-25), 142,31 (C-26), 152,9 (C-27), 106,8 (C-28), 60,9 (C- 29), 165,4 (C-30), 51,7 (C-31), 56,2 (C-32), 55,8 (C- 33), 56,2 (C-34), 60,7 (C-35). Eleutherin
Được phân lập từ phân đoạn RJH2
Tinh thể hình kim màu vàng, đ.n.c 178-179 oC. [α]D25 = + 220,5º ( c 0,19, CHCl3)
Rf = 0,65 (TLC, silica gel, điclometan-axeton 10:1, v/v), hiện màu đen với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
EI-MS: m/z (%): 272 (M+, C16H16O4), 257 (100), 243 (45), 229 (27).
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,75 (1H, dd, J = 1,0; 8,0 Hz, H-6),
(3H, s, OCH3-9), 3,98 (1H, m, H-3), 2,69 (1H, dd, J = 3,5; 19,0 Hz, H-4α), 2,24
(1H, dddd, J = 2,0; 10,5; 19,0; 29,0 Hz, H-4β), 1,54 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-3), 1,34(3H, d, J = 6,0 Hz, CH3-1)
13
C-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 184,2 (C-10), 182,7 (C-5), 159,7 (C- 9), 148,0 (C-10a), 139,3 (C-4a), 134,7 (C-7), 134,1 (C-5a), 119,8 (C-9a), 119,1 (C-6), 117,8 (C-8), 67,4 (C-1), 62,4 (C-3), 56,4 (C-OCH3), 29,5 (C-4), 21,5 (CH3- 3), 19,76 (CH3-1).
Emodin bianthron
Được phân lập từ phân đoạn RJE 11.
Tinh thể hình kim màu vàng nhạt, đ.n.c 248-250 oC.
Rf = 0,38 (TLC, silica gel, điclometan-metanol 15:1, v/v), hiện màu đen với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
EI-MS: m/z (%) 510 (M+, C30H22O8), 256 (100), 241 (25). 1
H-NMR (500 MHz, axeton-d6): δ (ppm), 12,04 (1H, s, OH–8), 11,97 (1H, s, OH–8’), 11,84 (1H, s, OH–1), 11,75 (1H, s, OH–1’), 6,64 (2H, ds, H–4 & H– 4’), 6,31 (2H, t, H–2 & H–2’), 6,27 (1H, s, H–5), 6,25 (1H, s, H–5’), 6,11 (2H, ds, H–7 & H–7’), 4,50 (2H, d, J= 3,0 Hz, H–10 & H–10’), 2,29 (3H, s, CH3-3), 2,24 (3H, s, CH3-3’).
13
C-NMR (500 MHz, axeton-d6): δ (ppm) 21,9 (d, CH3-3 & CH3-3’), 56,84 (d, C-10 & C-10’), 102,7 (C-7 & C-7’), 109,7 (d, C-5 & C-5’), 110,9 (C-8a’), 111,3 (C-8a), 114,8 (C-9a & C-9a’), 117,3 (d, C-2 & C-2’), 122,0 (d, C-4 & C-4’), 141,1 (C-4a & C-4a’), 145,5 (C-5a & C-5a’), 147,2 (C-3’), 147,5 (C-3), 162,7 (C-6 & C-6’), 165,0 (C-1’), 165,2 (C-1), 165,5 (C-8 & C-8’), 191,2 (C-9 & C-9’).
3.8.PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL VÀ PICEID CÓ TRONG RỄ CỐT KHÍ CỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC RỄ CỐT KHÍ CỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
3.8.1. Nguyên liệu
Rễ cốt khí củ (Reynoutria Japonica) được thu thập tại làng Nghĩa Trai, (xã Tân Quang, Văn Lâm, Hưng Yên) vào tháng 10 năm 2011 được ký hiệu là RJ1
Rễ cốt khí củ được mua tại hiệu thuốc bắc Lãn Ông- Hà Nội được ký hiệu là RJ2
3.8.2. Chuẩn bị mẫu phân tích: điều chế phần chiết metanol
Cân chính xác khoảng 0,2 (g) mỗi mẫu rễ cốt khí củ đã được xay nhỏ thành hạt mịn, chuyển vào bình tam giác 50 ml. Chiết siêu âm mẫu hai lần, lần lượt với 30ml và 20 ml MeOH HPLC (Merck), mỗi lần trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Lọc gạn lấy phần dịch lọc, định mức đến vạch mức bằng MeOH Merck, sau đó lọc qua giấy lọc băng xanh thu được dịch chiết MeOH. Từ dịch chiết này, tiếp tục lọc qua màng lọc HPLC 0,45 μm (Millipore) ta được mẫu thử có thể đem phân tích trên HPLC.
3.8.3. Điều kiện phân tích sắc ký HPLC
Pha động ACN – H3PO4 0,1% được rửa giải trong 60 phút. Tốc độ dòng được duy trì ở 0,8 ml/ phút, nhiệt độ cột ở nhiệt độ phòng. Đetectơ UV được đặt ở bước sóng λ 306 nm. Mẫu phân tích RJ1, RJ2 được chuẩn bị ở nồng độ 5,250 và 4,824 mg/ml trong dung môi MeOH HPLC (Merck).
Pha động: ACN – H3PO4 0,1% Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút Thể tích tiêm: 10 µl
Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng Detector: UV 306 nm Chương trình dung môi:
Thời gian (phút) % ACN % H3PO4 Kiểu rửa giải 0 – 10 20 80 Đẳng dòng 10 – 15 20 – 33 80 – 67 gradient 15 - 25 33 67 Đẳng dòng 25 – 30 33 – 60 67 – 40 Gradient 30 – 45 60 40 Đẳng dòng 45 – 50 60 – 100 40 – 0 Gradient 50 – 60 100 0 Đẳng dòng
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT
Đối tượng nghiên cứu của Luận văn là bộ phận rễ của cây cốt khí củ (Reynoutria Japonica Houtt.) được thu thập tại làng Nghĩa Trai, (xã Tân Quang, Văn Lâm, Hưng Yên) vào tháng 10 năm 2011. Mẫu được sấy khô ở 50 oC và sau đó xay thành bột nhỏ.
Mẫu rễ của cây cốt khí củ được chiết với EtOH 90% ở nhiệt độ phòng theo quy trình được miêu tả ở phần Thực nghiệm và được tóm tắt ở Sơ đồ 4.1. Kết quả đã thu được các phần chiết n-hexan (RJH, hiệu suất chiết 1,50% so với lượng nguyên liệu khô), etyl axetat (RJE,4,00%), n- butanol (RJB,2,72%) và phần còn lại tan trong nước (RJW,5,00%).
Rễ cốt khí củ (2 kg)
Dịch nước
Dịch nước Phần chiết n-hexan
(RJH; 30 g; 1,50 %)
Dịch nước
Dịch nước Phần chiết n-butanol
(RJB; 54,40 g; 2,72 %)
Phần chiết nước
(RJW; 100,00 g, 5,00 %)
1. Chiết bằng n-hexan
2. Cất loại kiệt n-hexan, 60 °C
Sơ đồ 4.1. Quy trình điều chế các phần chiết từ rễ cốt khí củ
1. Ngâm chiết với EtOH 90% (4 ngày, 3 lần)
2. Lọc, cất loại EtOH
3. Hòa vào nước cất
1. Chiết với EtOAc
2. Cất loại kiệt EtOAc, 60 °C
Phần chiết EtOAc (RJE; 80 g; 4,00 %) 1. Chiết với n-butanol
2. Cất loại kiệt n-butanol, 70 °C
4.2. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT TRONG RỄ CỐT KHÍ CỦ Bảng 4.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong rễ cốt khí củ Bảng 4.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong rễ cốt khí củ STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận Phản ứng với các thuốc thử Mayer + Dragendorff + 1 Ancaloit Bouchardat + có Liebermann + Baljet + 2 Glycosid tim Xanthydron + có Phản ứng Cyanidin + Phản ứng với NaOH + 3 Flavonoit Phản ứng với FeCl3 5% ++ có Phản ứng mở đóng vòng lacton ++ Thuốc thử diazo + 4 Coumarin Vi thăng hoa − có 5 Anthranoid Phản ứng Borntraeger ++++ có 6 Axit hữu cơ Phản ứng với bột Na2CO3 + có
Quan sát hiện tượng tạo bọt +++ Phản ứng Liebermann-Burchardt ++
có 7 Saponin
Phản ứng Salkowski −
8 Tanin Phản ứng với Gelatin 1% + có
9 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling A và Fehling B
10 Axit amin Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin + có 11 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy + có 12 Carotenoit Phản ứng với H2SO4 + có 13 Phytosterol Phản ứng Liebermann ++ có ++++: Phản ứng dương tính đặc biệt rõ +++: Phản ứng dương tính rất rõ ++ : Phản ứng dương tính rõ + : Phản ứng dương tính mờ
− : phản ứng âm tính
Như vậy trong rễ cốt khí củ bao gồm nhiều lớp chất: ancaloit, glycosid tim, phytosterol, carotenoit, chất béo, đường khử, tanin, saponin, axit hữu cơ, coumarin, anthranoid.
4.3. PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ 4.3.1. Phân tách phần chiết n-hexan (RJH) 4.3.1. Phân tách phần chiết n-hexan (RJH)
Phần chiết n-hexan (RJH) (15 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 0,063-0,2 mm), rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan-axeton với các tỷ lệ 100:1, 20:1, 10:1, 9:1, 4:1, 3:1 và 2:1
(v/v). Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 11 nhóm phân đoạn từ RJH1 đến RJH11.Các nhóm phân đoạn được rửa bằng dung môi, tinh chế bằng cột Mini-C trên silica gel và kết tinh lại thu được chất RJH2.4 (30 mg), RJH2 (15 mg), RJH4 (2,62 g) và RJH10 (200 mg).
RJH2.4 102 mg RJH2.1 RJH2.3 45 mg RJH2.2 RJH2 Tinh thể hình kim màu vàng (15 mg) RJH3 Tinh thể hình kim màu vàng (12 mg) RJH 2.5 RJH2.4 Tinh thể hình kim màu trắng (30 mg) RJH10 (242-276) 1,33 g RJH4 (78-178) 6,03 g RJH2 (13-56) 2,02 g RJH1 (1-12) 0,51 g RJH6 (189-204) 0,23 g RJH5 (179-188) 0,43 g RJH7 (205-217) 0,25 g RJH8 (218-230) 0,34 g RJH9 (231-241) 0,29 g RJH11 (277-300) 0,64 g RJH3 (57-77) 2,06 g RJH4 Tinh thể hình kim màu vàng (2,62 g) RJH10 Bột vô định hình màu trắng (200 mg) RJH6 Bột vô định hình màu tím (25 mg)
CC, silica gel, n-Hexan: axeton, gradient,