Sơn trà Nhật Bản với tên khác là Tỳ bà, có tên khoa học là Eriobotrya japonica Lindl. thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản sau đó được du nhập vào Việt Nam, hiện có nhiều nhất ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Nội. Đây là dược liệu được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền với tác dụng: bình suyễn, lợi đờm, chống viêm , kháng khuẩn… Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về dược liệu này, đã phân tách được một số hoạt chất trong cây và nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của các hoạt chất đó như tác dụng chữa tiểu đường của acid corosolic, tác dụng ức chế khối u của các acid oleanolic… Tại Việt Nam, hầu như chưa có nghiên cứu nào về cây Sơn trà Nhật Bản được công bố, vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài “Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học lá Sơn trà Nhật Bản Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.”
Trang 1ĐẶT VẤN ĐỀ
Khí hậu nhiệt đới gió mùa đã tạo điều kiện cho thảm thực vật của nước
ta phát triển phong phú, đa dạng với hơn 12.000 loài bao gồm 2.500 chi và
300 họ Nhiều loài trong số đó đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh Với khoa học công nghệ phát triển như hiện nay, đã có nhiều cây thuốc được nghiên cứu khá đầy đủ, có hệ thống và được bào chế dưới dạng thuốc cổ truyền đạt tiêu chuẩn GMP hay chiết xuất ra các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh Tuy nhiên vẫn còn nhiều cây chưa được nghiên cứu hoặc nghiên cứu chưa đầy đủ, việc sử dụng để chữa bệnh vẫn dựa vào kinh nghiệm dân gian
Sơn trà Nhật Bản với tên khác là Tỳ bà, có tên khoa học là Eriobotrya japonica Lindl thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) có nguồn gốc từ Trung Quốc
và Nhật Bản sau đó được du nhập vào Việt Nam, hiện có nhiều nhất ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Nội Đây là dược liệu được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền với tác dụng: bình suyễn, lợi đờm, chống viêm , kháng khuẩn… Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về dược liệu này, đã phân tách được một số hoạt chất trong cây và nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của các hoạt chất đó như tác dụng chữa tiểu đường của acid corosolic, tác dụng ức chế khối u của các acid oleanolic… Tại Việt Nam, hầu như chưa có nghiên cứu nào về cây Sơn trà Nhật Bản được công bố, vì vậy chúng tôi đã thực hiện
đề tài “Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học lá Sơn trà Nhật Bản
Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.” với mục tiêu:
- Xác định các nhóm hợp chất hữu cơ có trong lá Sơn trà Nhật Bản
- Khảo sát các phân đoạn dịch chiết và phân lập một số chất từ lá Sơn trà Nhật Bản
Trang 2
bầu trên hay dưới Quả nhiều đại (Spiraeioideae, Rosoideae), mọng (Maloideae), hay quả hạch (Prunoideae) Hạt không có nội nhũ.
Họ Hoa hồng được đặc trưng bởi các ống hoa hình chén, mà phần dưới của nó tương ứng với đế hoa lõm còn phần trên do các lá đài, cánh hoa và đôi khi cả chỉ nhị hợp lại tạo thành
* Phân bố [3]
Họ Hoa hồng phân bố khắp nơi, chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc bán cầu Việt Nam có 20 chi, khoảng 130 loài, chủ yếu mọc hoang, một số loài được trồng làm cảnh (Hoa hồng, Đào); ăn quả (Táo, Lê, Mận,…) và một số được dùng làm thuốc: Đào, Mâm xôi, Kim anh, Táo mèo, Tầm xuân…
Trang 3
Hoa rất nhiều, gần như không có cuống, mọc thành chùm, đường kính 15-20 mm, có lông màu hung đỏ Quả thịt, hình hơi cầu, có lông, khi chín có mầu vàng, dài 3-4 cm, đỉnh quả có hình mắt, quanh mép mang đài tồn tại, thịt dày, có 4 hạch đơn, hơi dày, mỗi hạch mang 1-2 hạt không có phôi nhũ.
Hình 1.1: Cây Sơn trà Nhật Bản ( Eriobotrya japonica Lindl )
* Phân bố, sinh thái [9]
Sơn trà Nhật Bản có nguồn gốc ở vùng Đông Nam - Trung Quốc, sau được trồng ở nhiều vùng cận nhiệt đới hoặc ôn đới ấm như địa Địa Trung Hải, Australia, Nam Phi, Nam Mỹ, Hoa Kỳ (california), Nhật Bản, Đài Loan, Bắc Việt Nam và một số nơi thuộc vùng núi trên 1000m ở các nước Đông Nam Á
và Ấn Độ
Ở Việt Nam, cây Sơn trà Nhật Bản được nhập trồng từ lâu đời và hiện nay được trồng rải rác trong vườn các gia đình ở tỉnh Lạng Sơn, Cao Bằng,
Trang 4
Thái Nguyên và Hà Nội Cây ưa khí hậu ấm mát, có thể chịu được nhiệt độ thấp tới -10oC vào mùa đông ở Trung Quốc và Nhật Bản.
Cây sinh trưởng tốt ở đất mùn trên núi, ít sỏi đá và có thể hơi chua, ra hoa nhiều nhưng kết quả hạn chế Do mùa hoa ở Việt Nam thường có mưa xuân nên giống Sơn trà Nhật Bản ở nước ta thường cho quả chua, ít được sử dụng Nhưng ở Nhật Bản đó là cây ăn quả quan trọng, sản lượng mỗi năm đạt hơn 10.000 tấn
Sơn trà Nhật Bản dễ trồng: bằng cách chiết cành hay từ rễ, ngoài ra còn
đó cũng có một số triterpen khác được phân lập [13],[16],[18]
Trang 5
Bảng 1.1 : Các triterpen phân lập được từ lá Sơn trà Nhật Bản và hàm
lượng(%) của chúng so với tổng lượng phân đoạn EtOAc.
HO
(2)
COOH
HO HO
(3)
Trang 6
Buthanol của dịch chiết EtOH 75% của 5 kg lá Sơn trà Nhật Bản [12] Một số sesquiterpen glycoside khác cũng đã được phân lập là : nerolidol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-α-L- rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside
(21), isohumbertiol-3-O-{α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-α-L- rhamnopyranosyl(1→2)-[α-L- rhamnopyranosyl(1→6)]}-β-D-
glucopyranoside (22), isohumbertiol-3-O-{α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-α-L- rhamnopyranosyl(1→2)-[α-L-(4-trans-feruloryl)- rhamnopyranosyl(1→6)]}-
β-D-glucopyranoside (23) [13].
Trang 7
O O
R1O
OH OH
R20
O O
R1O
OH OH
R20
(20), (21) (22), (23)
(20) H α -L-Rha(1 → 4)- α -L- Rha(1 → )
(21) α -L-Rha(1 → 4)- α -L- Rha(1 → ) α -L-Rha(1 → )
(22) α -L-Rha(1 → 4)- α -L- Rha(1 → ) α -L-Rha(1 → )
(23) α -L-Rha(1 → 4)- α -L- Rha(1 → ) (4-trans-feruloyl)- α -L-Rha(1 → )
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của một số sesquiterpen
1.2.3 Hợp chất phenolic
1.2.3.1 Flavonoid glycoside
Năm 2003, Louati S và cộng sự đã tìm và xác định được một số
flavonoid trong lá Sơn trà Nhật Bản: quercetin 3-O- rutinoside (rutin) (24), kaempferol 3-O- glucoside (35), kaemferol 3-O- galactoside (26), kaemferol 3-O-dihexoside (27), kaemferol 3-O- rutinoside (28), isorhamnetin 3-O- glucoside (29), isorhamnetin 3-O- galactoside (30) [20].
Đến năm 2009, khi nghiên cứu lá, vỏ quả và thịt quả của cây Sơn trà Nhật Bản trồng ở nhiều nơi khác nhau bằng phương pháp phân tích HPLC- DAD- ESI-MS/MS đã xác định được sự có mặt của mười flavonoid
glycoside: naringenin-6,8-di-C-glucoside(31), naringenin-8-C-rhamnosyl
(1→2)glucoside (32), neohesperidoside (33), sambubioside (34), quercetin-3-O-galactoside (35), quercetin-3-O-glucoside (36), quercetin-3-O-rhamnoside (37), kaempferol-3-O-neohesperidoside (38),
Trang 8
kaempferol-3-O- sambubioside (39), kaempferol-3-O- rhamnoside (40) Tất
cả các flavonoid đều được tìm thấy trong lá cũng như trong vỏ quả ( trừ (31), (32)) Trong thịt quả không tìm thấy flavonoid [14].
1.2.3.2 Dẫn xuất hydroxycinnamic acid
Đã xác định được 8 dẫn xuất hydroxycinnamic acid trong lá Sơn trà Nhật
Bản: acid 3-caffeoylquinic (41), acid 3-p-coumaroylquinic (42), acid 5- caffeoylquinic (43), sinapoyl glucoside (44), acid 1-p- coumaroylquinic (45), acid 5-p- coumaroylquinic (46), acid 1-feruloylquinic (47), acid 5- feruloylquinic (48) [14].
Lá Sơn trà Nhật Bản là nguyên liệu chứa số lượng lớn dẫn xuất
hydroxycinnamic acid Hợp chất (41), (42), (43) và (48) có cả ở lá, vỏ quả và thị quả Trong đó (43) có nhiều ở trong lá và thịt quả, (41) có nhiều ở vỏ quả
và (44) không tìm thấy trong lá
O HO
OH OH
HO C
OH O
Trang 9
Bảng 1.2: Hàm lượng (%) so với toàn lượng phenolic của một số hợp chất
phenolic trong lá, vỏ quả, thịt quả của cây Sơn trà Nhật Bản.
carotenoid Trong đó các carotenoid chính có là: trans-β-carotene (19-55%);
trans-β-cryptoxanthin (18-28%); 5,6-diepoxy-β- cryptoxanthin (7-10%); 5’,6’- diepoxy-β- cryptoxanthin ( 9-18%) [10]
1.3 ỨNG DỤNG CỦA SƠN TRÀ NHẬT BẢN
1.3.1 Theo y học cổ truyền
Trang 10
* Tính vị, quy kinh: Lá Sơn trà Nhật Bản có vị đắng, tính bình, quy vào
kinh phế, vị [6]
* Công năng: Thanh phế, hòa vị, giáng khí, hóa đờm [9]
* Chủ trị: Lá Sơn trà Nhật Bản dùng để chữa phế nhiệt sinh ho, ho khan,
ho có đờm, khô cổ khản tiếng, ho ra máu, chảy máu cam, nôn [9]
Liều lượng: 10-20g/ngày Sắc nước uống, thường dùng phối hợp với một
số thuốc khác như Tiền hồ, Tang diệp chữa ho phong nhiệt; với Đạm trúc diệp chữa khản tiếng
Một số bài thuốc y học cổ truyền có sử dụng lá Sơn trà Nhật Bản dùng
để chữa ho, viêm họng, viêm phế quản… được thể hiện ở bảng 1.3
Bảng 1.3: Một số bài thuốc có Sơn trà Nhật Bản (Tỳ bà)
2 Chữa phế Lá Tỳ bà 12g
Trang 11
nhiệt, ho khan
lâu ngày
Tang bạch bì 10gThiên môn 10g
Can khương 1g
Nghiền thành bột, chế thành viên hoàn, chia 2 lần uống trong ngày
4 Chữa chảy
Lá Tỳ bà lau sạch lông, sao vàng, tán nhỏ Ngày uống 2 lần, mỗi lần 2g bột, chiêu bằng nước chè
Ở Ấn Độ người ta dùng quả để chống nôn, giải khát Hoa dùng để trị ho, long đờm Lá làm thuốc chữa ho, viêm phế quản mạn tính, suyễn khó thở có đờm, sốt, nóng, cảm mệt, nôn mửa nhất là khi có thai, nôn khan, miệng khát,
ăn uống khó tiêu, chảy máu cam [4]
1.3.2 Theo các nghiên cứu dược lý
Sơn trà Nhật Bản là dược liệu được sử dụng rộng rãi trên thế giới với nhiều tác dụng khác nhau như chống viêm, chống đái tháo đường, chống virus, chống oxy hóa… Các tác dụng này đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu dược lý
1.3.2.1 Tác dụng lợi đờm
Trang 12
Dịch chiết bằng cồn và dịch chiết EtOAc của lá Sơn trà Nhật Bản với liều 0,5ml/chuột, dùng đường uống có tác dụng tăng cường sự bài tiết phenolsulfonphthalin ở đường hô hấp, chứng tỏ có tác dụng lợi đờm [3].
1.3.2.2 Tác dụng chống viêm
Các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu tác dụng chống viêm của các triterpen acid chiết tách từ lá Sơn trà Nhật Bản trên mô hình gây viêm phế quản thực nghiệm trên chuột với liều dùng đường uống tương ứng 50, 150,
450 mg triterpen acid/Kg/ngày trong 3 tuần cho thấy số bạch cầu trung tính, đại thực bào và các yếu tố trung gian hóa học TNF-α, IL-8 ở dịch phế nang giảm so với nhóm chứng Điều này chứng tỏ hỗn hợp triterpen acid từ lá Sơn trà Nhật Bản có tác dụng chống viêm phế quản mạn [15]
Trong một nghiên cứu khác các triterpen được phân lập từ phân đoạn EtOAc của dịch chiết MeOH lá Sơn trà Nhật Bản có tác dụng ức chế TPA (12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetat) - yếu tố gây viêm ở chuột Tác dụng
ức chế TPA của các triterpen acid (ID50 = 0.03- 0.43 mg/ tai chuột) tốt hơn Indomethacin (ID50 = 0.3 mg/ tai chuột) [11]
1.3.2.3 Tác dụng chống đái tháo đường
Trong quá trình sử dụng Sơn trà Nhật Bản làm thuốc, các thầy thuốc Trung Quốc đã phát hiện ra tác dụng chữa bệnh đái tháo đường của cây này Nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường của sesquiterpen glycoside : nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-α-L- rhamnopyranosyl(1→2)-[α-L- rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside từ phân đoạn n-Buthanol của dịch chiết EtOH 750 lá Sơn trà Nhật Bản trên mô hình gây tiểu đường chuột bằng aloxan Kết quả cho thấy lượng glucose huyết giảm đáng kể Chứng tỏ rằng sesquiterpen glycosid từ lá Sơn trà Nhật Bản có tác dụng làm giảm đường huyết trong bệnh đái tháo đường [12]
Trang 13
Acid corosolic là một triterpnen acid có trong lá Sơn trà Nhật Bản, tác dụng của nó trên chuyển hóa carbohydrat và sự biệt hóa tế bào mỡ 3T3-L1 cũng đã được nghiên cứu Kết quả đưa ra rằng tỷ lệ hấp thu glucose vào tế bào tạo mỡ 3T3-L1 là khác nhau giữa các nồng độ acid corosolic (15µmol/L,
30µmol/L, 45µmol/L) tương ứng là 108.1%, 112.2%, 118.6% so với nhóm chứng (không có acid corosolic) Đồng thời acid corosolic còn ngăn chăn sự biệt hóa của tiền tế bào tạo mỡ 3T3-L1 [24] Qua đó có thể thấy rằng acid corosolic phân lập từ lá Sơn trà Nhật Bản có hiệu quả tốt trên bệnh nhân đái tháo đường đi kèm béo phì
Ngoài ra acid corosolic còn có tác dụng làm tăng biphosphat (F-2,6-BP) thông qua làm giảm AMPc F-2,6-BP là một chất có vai trò quan trọng trong tạo glucose và glycogen F-2,6-BP hoạt hóa 6-phosphofructo-1-kinase (PFK-1), một enzym có giới hạn nhất định trong quá trình tạo glycogen và ức chế Fructose-1,6-biphosphatase ( F-1,6-BPase ), một enzym hoạt hóa quá trình tạo glucose Vì vậy acid corosolic có tác dụng ức chế tạo glucose và kích thích tạo glycogen [26]
Fructose-2,6-Một nghiên cứu khác cũng đưa ra rằng acid corosolic và acid maslinic có tác dụng giảm đường huyết trên mô hình chuột gây đái tháo đường bằng adrenalin thông qua tác dụng ức chế emzym glycogen phosphorylase làm giảm sự thoái hóa glycogen ở gan [25]
1.3.2.4 Ức chế sự phát triển của khối u
Năm 2005, các nhà khoa học Nhật Bản đã thử tác dụng ức chế sự phát triển khối u của các triterpen acid Kết quả cho thấy các hoạt chất này có tác dụng ức chế hoạt tính kháng nguyên của siêu vi trùng Epstein-Barr ( EBV-EA) ở tế bào Raji gây ra bởi TPA [11] Acid oleanolic và acid ursolic cũng có
Trang 14
tác dụng ức chế sự hình thành và phát triển của khối u gây ra bởi TPA ở in Vitro và in vivo Điều trị cho chuột bằng acid oleanolic (200 ppm) cho vào
khẩu phần ăn hàng ngày trong 3 tuần đã làm giảm tỷ lệ mắc bệnh khối u ruột gây ra bởi azoxymethan [19]
1.3.2.5 Tác dụng bảo vệ gan
Tác dụng bảo vệ gan của acid oleanolic được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1975 Năm 1977 ở Trung Quốc đã điều trị thành công cho người viêm gan cấp và mạn tính cũng như các rối loạn chức năng gan bằng acid oleanolic dạng uống Người ta cũng đã chứng minh được acid oleanolicvà acid ursolic đều có tác dụng bảo vệ gan, chống lại các tổn thương gan gây ra bởi các chất hóa học như CCl4, acetaminophen, bromobenzen… Cơ chế bảo vệ gan của hai hợp chất này là ức chế hoạt tính của các chất độc hại cho gan và tăng cường hàng rào bảo vệ cơ thể bằng cách ức chế cytocrom P450 và tăng cường hệ thống glutathione ở gan [19]
1.3.2.6 Chống oxy hóa
Dịch chiết EtOH của vỏ quả, thịt quả, hạt và dịch chiết nước của vỏ quả Sơn trà Nhật Bản có tác dụng mạnh làm sạch gốc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Còn dịch chiết EtOH của hạt ức chế 2,2’-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile) (MeO-AMVN) gây oxy hóa LDL [17].Acid oleanolic và acid ursolic có tác dụng chống oxy hóa do làm giảm hoạt tính của enzym glutathion peroxidase tương ứng 12% và 10%, tăng hoạt tính của superoxide dismutase tương ứng 12% và 22% [22]
Như vậy, tác dụng của lá Sơn trà Nhật Bản đã được nghiên cứu, chứng minh và áp dụng trong điều trị ở nhiều nước trên thế giới Một số thành phần trong lá có tác dụng dược lý có thể ứng dụng tốt trong điều trị bệnh Nghiên cứu thành phần hóa học của lá Sơn trà Nhật Bản sẽ góp phần nâng cao hiệu
Trang 15
quả trong việc sử dụng lá Sơn trà Nhật Bản trong y dược học Các hoạt chất
có tác dụng sinh học đã được chứng minh chủ yếu là nhóm triterpenoid - một nhóm chất ít phân cực Chính vì vậy, trước tiên chúng tôi quan tâm nghiên cứu thành phần hóa học ở phân đoạn chloroform
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1 Nguyên liệu
Trang 16
Mẫu nghiên cứu là lá của cây Sơn trà Nhật Bản được thu hái vào tháng
11 ở Trung tâm cây thuốc Hà Nội – Văn Điển – Hà Nội Cây này đã được Th.S Ngô Đức Phương và Th.S Nguyễn Quỳnh Nga khoa Tài nguyên – Viện
dược liệu lấy mẫu kiểm định và kết luận tên khoa học là Eriobotrya japonica
Lindl Lá được sấy khô ở 400C, xay nhỏ làm mẫu nghiên cứu
2.1.2 Thiết bị, hóa chất
* Thiết bị
- Tủ sấy dược liệu MEMMERT
- Máy xác định độ ẩm PRECISA
- Cân phân tích PRECISA
- Máy đo điểm chảy STUART
- Máy cất quay lớn BUCHI
- Máy cất quay nhỏ BUCHI
- Bản mỏng silicagel GF254 ( MERCK) pha thuận và pha đảo hoạt hóa trong tủ sấy ở nhiệt độ 105-1100C trong 60 phút
- Cột sắc ký, bình chiết quả lê, bình nón, bình cầu, cốc có mỏ, ống nghiệm, pipet pasteur, phễu lọc Buchner
- Máy đo phổ hồng ngoại IMPAC 410-NICOLET FT-IR
- Máy đo phổ khối HEWLETT PACKARD HP 5890, Serie II
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUCKER AVANCE-500 MHz
* Hóa chất
- Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết thích hợp: Silicagel 60 (0,04-0,063 mm), MeOH, EtOH, n-Hexan, Aceton, Chloroform, EtOAc, n-Buthanol, Petroleum ether và các thuốc thử
Trang 17
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá Sơn trà Nhật Bản bằng phản ứng hóa học
- Định lượng tổng các chất chiết được trong các phân đoạn bằng phương pháp cân
- Khảo sát các cắn phân đoạn bằng SKLM
- Phân lập và biện luận cấu trúc một số chất tách được từ lá Sơn trà Nhật Bản
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
* Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá Sơn trà Nhật Bản: Sử
dụng các phản ứng tạo màu, phản ứng đặc trưng trong ống nghiệm với các thuốc thử chung của từng nhóm chất để phát hiện sự có mặt của các nhóm chất trong dược liệu
* Định lượng tổng các chất chiết được trong các phân đoạn bằng phương pháp cân
Lá Sơn trà Nhật Bản khô được chiết với Ethanol 800 3 lần, mỗi lần 3 giờ
ở 600C, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn khô Hòa tan cắn khô với lượng nước nóng tối thiểu, sau đó chiết kiệt lần lượt với n-Hexan, Chloroform, EtOAc, n-Buthanol, kiểm tra bằng SKLM Thu các phần dịch chiết đem cất thu hồi dung môi tới cắn khô sau đó dùng phương pháp cân để định lượng
* Khảo sát các cắn phân đoạn bằng SKLM
Trang 18
Dùng bản mỏng tráng sẵn silicagel để định tính số lượng chất có trong mỗi phân đoạn Tùy từng phần chiết mà ta khảo sát với các hệ dung môi khác nhau.
* Phân lập và biện luận cấu trúc một số chất tách được từ lá Sơn trà Nhật Bản
Phân lập các chất tinh khiết từ cắn các phân đoạn bằng phương pháp sắc
ký cột silicagel và kết tinh Việc lựa chọn hệ dung môi chạy cột dựa vào độ phân tách của các chất trên SKLM Độ tinh khiết của các chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM nhận biết bằng soi UV, phun dung dịch H2SO4
10% - hơ nóng, đo điểm chảy…Sau đó sử dụng các phương pháp phân tích phổ thích hợp, kết hợp với tham khảo cơ sở dữ liệu phổ đã có để biện giải cấu trúc các chất phân lập được
Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trang 19
3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
Mục đích : Xác định sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong lá Sơn trà Nhật Bản, từ đó có hướng chiết xuất và phân lập các nhóm chất
Lá Sơn trà Nhật Bản được chiết bằng các dung môi thích hợp để thu được các nhóm chất, sau đó tiến hành loại tạp và làm giàu nhóm chất bằng các phương pháp khác nhau, dùng các thuốc thử, phán ứng hóa học đặc trưng
để xác định sự có mặt của các nhóm chất
Định tính Alcaloid: Sử dụng phản ứng với thuốc thử chung: TT Mayer,
TT Dragendorff, TT Bouchardat của alcaloid
Định tính flavonoid: Phản ứng Cyanidin, phản ứng với kiềm, phản ứng với dd FeCl3 5%
Định tính Saponin: Hiện tượng tạo bọt, phản ứng phân biệt saponin triterpen và saponin steroid
Định tính glycosid tim: Phản ứng Liebermann, phản ứng Baljet
Trang 20Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá Sơn trà Nhật
Phản ứng với hơi NH3 Phản ứng với kiềm loãng +++
-Phản ứng với dd FeCl3 5% +++
Phân biệt 2 Saponin
-5 Coumarin Phản ứng mở đóng vòng lacton + Có
Phản ứng với chì acetat 10% ++
Ghi chú : (-) âm tính, (+) dương tính (++) dương tính rõ, (+++) dương
tính rất rõ
Nhận xét: Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học ta thấy lá Sơn trà
Nhật Bản có chứa flavonoid, saponin triterpenic, coumarin, tanin, acid hữu
cơ, đường khử, hợp chất steroid, và không chứa alcaloid, anthranoid, chất béo, glycosid tim
3.1.2 Định lượng tổng các chất chiết được trong các phân đoạn
Trang 21
Mục đích: Xác định tổng khối lượng các chất chiết được bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần, từ đó nhận định sơ bộ về lượng chất không phân cực, ít phân cực và phân cực có trong lá Sơn trà Nhật Bản.
Mẫu nguyên liệu : 800g lá Sơn trà Nhật Bản khô, nghiền nhỏ
Độ ẩm: 9,82%
Quá trình chiết lá được thực hiện như sau: Lá Sơn trà Nhật Bản được chiết nóng 3 lần với 8 lít EtOH 800, mỗi lần 3 giờ, ở 600C Tiến hành lọc, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn, thu được 273,43 g cắn Hòa tan cắn vào 300ml nước nóng sau đó chiết kiệt lần lượt với n-Hexan, Chloroform, EtOAc, n-Buthanol (tỷ lệ 1:1), kiểm tra bằng SKLM Ta thu được dịch chiết các phân đoạn, làm khan bằng Na2SO4 khan, lọc rồi cất thu hồi dung môi các dịch chiết đó tới khô
Qui trình chiết được trình bày ở hình 3.1
Hàm lượng tổng các chất chiết được trong từng phân đoạn so với khối lượng dược liệu khô tính theo công thức :
(%) 100
(1 )
m A
− Trong đó A : Hàm lượng (%) cắn phân đoạn
m : Khối lượng cắn phân đoạn (g)
b : Hàm ẩm dược liệu (%), b = 9,82 % M: Khối lượng dược liệu (g), M = 800g
Bảng 3.2: Kết quả hàm lượng các phân đoạn so với khối lượng dược liệu
