3.1.4.1. Phân lập một số chất từ phân đoạn TC
* Phân tích phân đoạn TC
Từ kết quả khảo sát ở phần trên chúng tôi nhận định sơ bộ: - Phần cắn TC gồm nhiều chất phức tạp.
- Có một số vết có độ đậm thích hợp để phân lập.
- Hệ n-Hexan : EtOAc được lựa chọn là hệ dung môi chạy sắc ký cột. * Phân lập các chất trong cắn TC bằng sắc ký cột
Mục đích: Chạy cột để tách được chất sạch trong phân đoạn, dựa vào sự hấp phụ các chất trên silicagel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp.
Chạy cột thô
Chuẩn bị mẫu: Hòa tan hoàn toàn 20g cắn TC với CHCl3 trong cốc có mỏ, cho 50ml silicagel vào khuấy đều để chất hấp phụ hết lên silicagel. Tiếp tục khuấy cho dung môi bay hơi tự nhiên đến khi khô tơi.
Chuẩn bị cột sắc ký: Chọn cột sắc ký chiều dài 25 cm, đường kính 5 cm, cố định lên giá đỡ. Đong 200ml silicagel 60 (0,04-0,063 mm) (gấp khoảng 10 lần khối hượng cắn) cho vào cốc có mỏ, thêm dung môi n-Hexan vào, khuấy đều cho hết bọt khí. Cho một lượng n-Hexan vào cột, mở khóa, đồng thời đưa
silicagel trong cốc vào cột. Dùng quả bóp cao su gõ nhẹ cho hết bọt khí, cho dung môi chạy qua cột vài lần để ổn định cột.
Đưa chất lên cột : Cho một lượng tối thiểu n-Hexan vừa đủ vào mẫu đã chuẩn bị ở trên, khuấy để tạo thành hỗn dịch đồng nhất. Sau đó dùng pipet pasteur đưa chất lên cột, cho 1 ít bông lên trên để tránh khuếch tán ngược. Giải hấp phụ gradien bằng hệ dung môi n-Hexan : EtOAc (với lượng n-Hexan giảm dần từ 100% đến 40%), hứng phân đoạn nhỏ 100ml, tốc độ 20 giọt/phút. Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi n-Hexan : EtOAc (7 : 3), gộp các phần có sắc ký đồ giống nhau thu được 7 phân đoạn ký hiệu là TBD-C1→ TBD-C7. Kết quả thu được ở bảng sau :
Bảng 3.7: Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cắn TC
STT Tên phân đoạn Dải phân đoạn Khối lượng (g)
1 TBD-C1 4 – 9 2,1 2 TBD-C2 10 – 12 1,75 3 TBD-C3 13 – 14 0,52 4 TBD-C4 15 – 18 2,64 5 TBD-C5 20 – 23 1,13 6 TBD-C6 25 – 28 0,5 7 TBD-C7 29 – 35 0,53
Trong giai đoạn chạy cột thô chọn hệ gradien n-Hexan : EtOAc =(100:0)→(40:60). Khi hệ dung môi đạt tỷ lệ n-Hexan: EtOAc = (40:60) kiểm tra bằng SKLM nhận thấy đã rửa giải hết các chất trong phân đoạn TC.
Khảo sát các phân đoạn thu được từ chạy cột thô chúng tôi thấy phân đoạn TBD-C4 có khối lượng lớn nhất và trên bản mỏng xuất hiện 2 vết đậm tách khá xa nhau nên phân đoạn TBD-C4 là phù hợp để tiến hành phân tách tiếp.
Phân lập chất
Từ phân đoạn TBD-C4 (m = 2,64 g) tiến hành khảo sát khả năng phân tách các chất bằng SKLM với các hệ dung môi sau :
Hệ 1. petroleum ether : EtOAc = (4 : 6) Hệ 2. CHCl3 : MeOH = ( 9 : 1)
Hệ 3. CHCl3 : Aceton = ( 4 : 1)
Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ ở hình 3.3.
Quan sát thấy hệ 3 tách tốt nhất. Các vết này không hiện huỳnh quang ở bước sóng 254 nm và 365 nm, khi phun dd. H2SO4 10% - hơ nóng cho 2 vết đậm có Rf là 0,31 (hồng đỏ) và 0,49 (tím hồng). Do vậy chọn hệ dung môi CHCl3 : Aceton làm pha động chạy cột phân tách chất.
hệ 1 hệ 2 hệ 3
Hình 3.3: Hình ảnh SKLM vết TBD-C4 khi phun dd. H2SO4 10% - hơ nóng
Chuẩn bị mẫu TBD-C4 : Hòa tan hoàn toàn cắn TBD-C4 trong CHCl3
vào cốc có mỏ, thêm 6ml silicagel, khuấy đều, để dung môi bay hơi tự nhiên đến khô tơi.
Chuẩn bị cột : Tiến hành tương tự như trên với cột dài 50 cm, đường
kính 4 cm và 300ml silicagel 60 (gấp khoảng 100 lần khối lượng cắn). Dung môi lên cột là CHCl3, đợi cho cột ổn định rồi đưa chất lên cột. Tiến hành giải hấp phụ gradien với hệ dung môi CHCl3 : Aceton (lượng CHCl3 giảm từ 100% đến 80%), hứng mỗi phân đoạn nhỏ 20ml, tốc độ 20 giọt/phút. Dùng SKLM với hệ dung môi CHCl3 : Aceton = (4 : 1) để kiểm tra. Gộp các phần có sắc ký đồ giống nhau thu được 3 phân đoạn ký hiệu là TBD-C4.1→ TBD-C4.3. Kết quả thu được ở bảng sau:
Bảng 3.8: Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cắn TBD-C4
STT Tên phân đoạn Dải phân đoạn Khối lượng (mg)
1 TBD-C4.1 45 – 52 181
2 TBD-C4.2 55 – 90 510
3 TBD-C4.3 90 – 113 198
Nhận thấy các phân đoạn TBD-C4.1 và TBD-C4.2 đều gồm 1 vết trên SKLM với hệ dung môi CHCl3 : Aceton = (4 : 1). Tiến hành tinh chế 2 phân đoạn này để thu được chất tinh khiết.
Tinh chế TBD-C4.1
Cắn TBD-C4.1 tan tốt trong CH2Cl2, ít tan trong MeOH. Rửa cắn bằng MeOH rồi tiến hành kết tinh trong hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (1/1, v/v). Hòa tan hoàn toàn cắn với lượng tối thiểu CH2Cl2 sau đó cho từ từ cùng lượng MeOH, để nhiệt độ phòng, sau đó cho vào tủ lạnh để kết tinh. Kết quả thu được tinh thể màu trắng. Dùng SKLM để kiểm tra với các hệ dung môi sau:
- Pha thuận với các hệ dung môi: Petroleum ether : EtOAc = (4 : 6) CHCl3 : MeOH = ( 9 : 1)
CHCl3 : Aceton = (4 : 1) - Pha đảo với hệ dung môi: MeOH : CHCl3 = (8 : 2)
Kết quả đều thu được 1 vết màu tím hồng (phun dd. H2SO4 10%-hơ nóng) trên sắc ký đồ.
Tinh chế TBD-C4.2
Qua khảo sát sơ bộ nhận thấy cắn TBD-C4.2 tan tốt trong CHCl3, MeOH nóng và EtOAc nóng nhưng ít tan trong MeOH, EtOAc lạnh. Vì vậy sau khi dùng MeOH rửa loại tạp, chúng tôi tiến hành kết tinh theo 2 phương pháp: thay đổi nhiệt độ với 1 dung môi và sử dụng hỗn hợp 2 dung môi.
Tiến hành kết tinh:
- Dùng 1 dung môi – kết tinh nóng trong EtOAc: Cho 300 mg cặn TBD- C4.2 vào bình cầu 25ml, thêm 10ml EtOAc, cho con khuấy từ, đặt lên bếp, khuấy và đun hồi lưu đến khi tan hoàn toàn, để ra nhiệt độ phòng cho kết tinh. Sau đó lọc tinh thể và rửa bằng MeOH lạnh. Tương tự như vậy,tiến hành kết tinh 3 lần ta thu được 200mg cặn TBD-C4.2.
- Dùng hỗn hợp 2 dung môi – sử dụng 2 dung môi là CHCl3 và MeOH: cho 200g cắn TBD-C4.2 vào bình cầu, thêm 0,7ml CHCl3, đun nóng nhẹ để tan hoàn toàn sau đó cho từ từ 5ml MeOH, để ở nhiệt độ phòng đến nguội, cho vào tủ lạnh để cho kết tinh. Sau 3 ngày thấy có vài tinh thể hình kim bám trên thành bình nhưng trong dung môi tinh thể không được hình thành.
• Nhận xét: trong 2 phương pháp kết tinh trên thì phương pháp dùng dung môi EtOAc cho hiệu quả tốt hơn.
Dùng SKLM pha thuận và pha đảo để kiểm tra độ tinh khiết của cắn TBD-C4.2 sau khi kết tinh trong EtOAc:
- Pha thuận với các hệ dung môi : Petroleum ether : EtOAc = (4 : 6) CHCl3 : MeOH = ( 9 : 1)
CHCl3 : Aceton = (4 : 1)
- Pha đảo với hệ dung môi : MeOH : CHCl3 = (8 : 2)
Kết quả cho thấy với các hệ dung môi khác nhau cắn TBD-C4.2 sau kết tinh chỉ là một vết mầu hồng đỏ (sau khi phun dd. H2SO4 10% - hơ nóng). Sắc ký đồ được thể hiện ở hình 3.4.
(e) (f)
Hình 3.4: Hình ảnh SKLM khi phun dd. H2SO4 10% - hơ nóng (e) pha thuận với hệ CHCl3 : Aceton = (4:1)
(f) pha đảo với hệ MeOH : CHCl3 = (8:2)
Nhận xét: Theo SKLM ta nhận định chất TBD-C4.2 đã tinh khiết.