1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải

76 804 1

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 76
Dung lượng 11,07 MB

Nội dung

Gossypol là một hợp chất polyphenol được tìm thấy trong hạt của các loài thuộc chi bông Gossypium, họ Malvaceae. Gossypol đã được biết điến với rất nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như tác dụng chống ôxy hoá, tránh thai nam, chống ký sinh trùng, chống HIV và chống ung thư. Gần đây, gossypol đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học với vai trò là một chất “mimetic BH3” (bắt chước BH3) trong tự nhiên, có khả năng ức chế các protein antiapoptosis thuộc họ Bcl2. Các protein này thường được biểu hiện quá mức ở một số loại tế bào ung thư, làm cho các tế bào ung thư không chết theo chương trình (apoptosis), trở nên kháng thuốc hoặc kém nhạy cảm với các thuốc hoá trị liệu. Gossypol (cũng như một số thuốc đang được thử nghiệm trên lâm sàng khác như ABT263, obatoclax (GX15070) có tác dụng ức chế các protein antiapoptosis từ đó giúp cho các tế bào ung thư có thể chết theo chương trình, giảm sự kháng thuốc hoặc giúp cho các tế bào ung thư trở lên nhạy cảm hơn với các thuốc hoá trị liệu. Gossypol có 2 đồng phân quang học là ()gossypol và (+)gossypol, trong đó ()gossypol được xem là có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn (+)gossypol như tác dụng chống ung thư, tránh thai nam, chống HIV. Hiện nay, ()gossypol là thuốc đầu tiên được sử dụng theo đường uống tác dụng đến đích Bcl2 đang được thử nghiệm trên lâm sàng pha II tại Mỹ.

Trang 1

Mở đầu

Ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay ở Việt Nam Theothống kê của Hội Ung thư TP Hồ Chí Minh, hàng năm Việt Nam có khoảng200.000 bệnh nhân ung thư mắc mới với khoảng 150.000 bênh nhân tử vong vìcăn bệnh này, trong đó thường gặp nhất là ung thư phổi, ung thư gan, ung thư dạdày ở nam giới ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư phổi ở nữ giới Phầnlớn bệnh nhân được phát hiện đã ở giai đoạn muộn, tỷ lệ chữa khỏi bệnh thấp, chiphí điều trị bệnh cao và kéo dài Các thuốc ung thư thế hệ mới thường có giáthành cao nên ít bệnh nhân có điều kiện tiếp cận trong khi các thuốc hoá trị liệu

cổ điển mặc dù có giá thành hạ nhưng nhiều tác dụng phụ

Gossypol là một hợp chất polyphenol được tìm thấy trong hạt của các loài

thuộc chi bông Gossypium, họ Malvaceae Gossypol đã được biết điến với rất

nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như tác dụng chống ôxy hoá, tránh thai nam,chống ký sinh trùng, chống HIV và chống ung thư Gần đây, gossypol đã thu hút

sự chú ý của các nhà khoa học với vai trò là một chất “mimetic BH3” (bắt chướcBH3) trong tự nhiên, có khả năng ức chế các protein anti-apoptosis thuộc họ Bcl-

2 Các protein này thường được biểu hiện quá mức ở một số loại tế bào ung thư,làm cho các tế bào ung thư không chết theo chương trình (apoptosis), trở nênkháng thuốc hoặc kém nhạy cảm với các thuốc hoá trị liệu Gossypol (cũng nhưmột số thuốc đang được thử nghiệm trên lâm sàng khác như ABT-263, obatoclax(GX15-070) có tác dụng ức chế các protein anti-apoptosis từ đó giúp cho các tếbào ung thư có thể chết theo chương trình, giảm sự kháng thuốc hoặc giúp chocác tế bào ung thư trở lên nhạy cảm hơn với các thuốc hoá trị liệu Gossypol có 2đồng phân quang học là (-)-gossypol và (+)-gossypol, trong đó (-)-gossypol đượcxem là có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn (+)-gossypol như tác dụng chốngung thư, tránh thai nam, chống HIV Hiện nay, (-)-gossypol là thuốc đầu tiên

Trang 2

được sử dụng theo đường uống tác dụng đến đích Bcl-2 đang được thử nghiệmtrên lâm sàng pha II tại Mỹ.

Ở nước ta, bông vải là loại cây công nghiệp được trồng phổ biến, chủ yếu

để cung cấp xơ bông phục vụ cho ngành công nghiệp dệt may Hiện nay, diệntích bông vải được trồng tại Việt Nam ước đạt 8.500 ha, dự kiến đến năm 2020diện tích bông vải tại Việt Nam lên đến 76.000 ha Mặc dù nguồn nguyên liệudồi dào và có nhiều tác dụng sinh dược học có giá trị nhưng gossypol từ hạt bông

vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu ở nước ta đặc biệt là từ loài Gossypium barbadense L, thường được biết đến là loài có hàm lượng gossypol cao và có

chứa nhiều (-)-gossypol, dạng đồng phân có hoạt tính sinh học mạnh hơn Xuấtphát từ thực tế nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài:

“NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA

GOSSYPOL TỪ HẠT BÔNG (GOSSYPIUM BARBADENSE L.) TRÊN

MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ”

Đề tài được thực hiện với những mục tiêu như sau:

- Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và tinh chế gossypol từ hạt bông

Gossypium barbadense L.

- Nghiên cứu phương pháp tách đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol từhỗn hợp gossypol racemic

- Nghiên cứu độc tính tế bào của các sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol

và (+)-gossypol đã phân lập được trên 3 dòng tế bào ung thư người

Trang 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Chi Gossypium

1.1.1 Vài nét về cây bông hải đảo (Gossypium barbadense L.) và chi Gossypium

Bông hải đảo (Gossypium barbadense L.) thuộc chi bông Gossypium, là loại

cây ưa sáng, thích hợp với điều kiện khô hạn Cây bụi cao 2-3 m Thân cành cólông, màu tím, điểm chấm đen Lá mọc so le hình tim rộng, 3-5 thuỳ hình trứnghoặc bầu dục, thuỳ giữa dài, thuỳ bên to Hoa màu vàng nhạt, cuống hoa có màuđen, tiểu đài có 3 lá bắc hoặc nhiều hơn, hình trứng rộng, đài hình chén, có tuyến,tràng dài hơn tiểu đài Quả nang hình bầu dục, hạt hình trứng nhọn, màu vàngnhạt, sợi trắng rất dễ rụng Mùa hoa quả từ tháng 6 đến tháng 10 [4]

Hình 1.1 Bông hải đảo (Gossypium barbadense L.)

Chi Bông, Gossypium thuộc họ Malvaceae, bao gồm 39-40 loài khác nhau,

trong đó các loài có giá trị thương phẩm được trồng phổ biến trên thế giới bao

gồm: G hirsutum, G barbadense, G arboreum và G herbaceum Ở Việt Nam,

có 5 loài thuộc chi bông là G hirsutum, G barbadense, G arboreum và G herbaceum và G acuminatum [1]

Trang 4

Cây bông là loại cây duy nhất trong tự nhiên được sử dụng vừa làm thựcphẩm, vừa để cung cấp sợi Cây bông được trồng ở vùng nhiệt đới hay á nhiệt đới

ở khắp nơi trên thế giới Trong liên vụ 2003-2004, sản lượng sợi bông trên toànthế giới ước đạt 88 triệu kiện, trong đó đứng đầu là Trung Quốc, tiếp theo là Mỹ,

Ấn Độ và Pakistan chiếm xấp xỉ 3/4 sản lượng bông của toàn thể giới [71] Hạt bông là một trong các loại hạt có hàm lượng dinh dưỡng cao, chứa từ16-24% protein và từ 13-24% dầu trong tổng khối lượng nhân hạt Cùng với sợibông thì dầu và các protein từ hạt bông là hai sản phẩm chủ yếu từ cây bông Dầu

ép từ hạt bông sau khi loại bỏ gossypol được dùng làm dầu ăn, dùng trong côngnghiệp đồ hộp hoặc làm xà phòng Dầu hạt bông gồm các acid béo không no(acid oleic 40-50%, linoleic 25-30%), các acid béo no (acid palmatic, stearic 20-25%) Hiện nay, trong nhóm các sản phẩm dầu từ hạt trên thế giới, dầu hạt bôngđứng vị trí thứ 3 (50 triệu tấn) sau dầu đậu nành (242 triệu tấn) và dầu hạt cải (52triệu tấn) [72] Khô dầu hạt bông có hàm lượng protein cao (40-42%) được sửdụng làm thức ăn gia súc hay làm phân bón Trong hạt bông còn có các flavonoid

là các glucoside của quercetol và kaempferol và chất màu gossypol [4]

Ở Việt Nam, cây bông là cây công nghiệp quan trọng đã được nhà nước đưavào chương trình phát triển chiến lược để hướng tới phục vụ cho ngành côngnghiệp dệt may Hiện nay, diện tích trồng bông tại Việt Nam tập trung chủ yếu ởTây Nguyên (42%), vùng duyên hải miền Trung (33%), miền Bắc (20%) vàĐông Nam bộ (5%) Diện tích trồng cây bông vải của nước ta liên vụ 2009-2010ước đạt 8.500 ha, sản lượng hạt bông thu được ước đạt 10.000 tấn và sản lượng

xơ bông ước đạt 3.500-3.700 tấn Tuy nhiên, với sản lượng xơ bông nêu trên chỉđáp ứng được khoảng 2% nhu cầu của ngành công nghiệp diệt may Hiện nay,diện tích trồng cây bông vải nước ta vẫn đang được tiếp tục mở rộng, ước tínhđến năm 2020 diện tích trồng bông tại Việt Nam sẽ tăng lên 76.000 ha [72]

Trang 5

1.1.2 Sự tồn tại của gossypol trong chi Gossypium

Gossypol là một hợp chất polyphenol đã được chứng minh có nhiều hoạttính sinh dược học có giá trị như tác dụng tránh thai, chống ung thư, chốngvirus , Trong hạt bông, gossypol tồn tại chủ yếu trong các tuyến chất mầu bêntrong nhân Hình 1.2 là lát cắt ngang của hạt bông cho thấy các tuyến chất mầunày phân bố dày đặc bên trong nhân hạt, kích thước của các tuyến này trongkhoảng 50-100 µm Gossypol chiếm 90% lượng sắc tố trong các tuyến, chiếnkhoảng 39-50% tổng khối lượng của tuyến và thông thường chiếm khoảng 0,4-1,7% khối lượng của nhân hạt [23].

Hình 1.2 Lát cắt ngang của hạt bông với các tuyến chất mầu

Ngoài hạt bông, gossypol còn được tìm thấy bên trong một số bộ phận kháccủa cây bông như vỏ rễ của cây, lá, vỏ hạt và hoa Mặt khác, hàm lượng gossypolcũng dao động lớn, phụ thuộc vào từng loài, giống bông, điều kiện khí hậu, đất

đai của từng vùng, lượng nước và phân bón sử dụng G barbadense được biết

đến là loài có hàm lượng gossypol cao, hàm lượng gossypol tổng số trong hạt củaloài này trong khoảng 0,3-3,4% [42]

Trang 6

Do có hoạt tính sinh dược học khác biệt nên tỷ lệ hai đồng phân quang học(+)- và (-)-gossypol trong hạt của các loài bông khác nhau đã được nghiên cứunhiều Tỷ lệ (+)-gossypol : (-)-gossypol đã được báo cáo là rất khác nhau trongcác giống và loài bông thương phẩm, dao động từ 95 : 5 đến 31 : 69, nhưng

thông thường tỷ lệ này là 3 : 2 trong G hirsutum trong khi ở G barbadense là 2 :

3 Tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong G arboreum (77 : 23), G barbadense (44 : 56) và G herbaceum (68 : 32) [25] Cass và cộng sự đã báo cáo tỷ lệ (+)- và (-)- gossypol trong G mustelinum (57 : 43 và 65 : 35), G herbaceum (63 : 37) và

giống lai giữa G herbaceum và G hirsutum (48 : 52) [11] Tỷ lệ (+)- và

(-)-gossypol trong một giống bông nhất định gần như không thay đổi dưới tác động

của môi trường Nghiên cứu trên một số lượng lớn các giống G hirsutum và G barbadense thương mại cho thấy rằng với một giống cây trồng nhất định, môi

trường có tác động đến lượng gossypol tổng số trong hạt nhưng không ảnhhưởng đến tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol [52] Hơn nữa, tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol vẫnkhông đổi trong một cây nhất định bất chấp hạt đó được lấy từ quả thu hái từ đầuhay cuối vụ hoặc hạt từ quả đó ở gốc hay đỉnh của cây

1.2 Đặc tính của gossypol

1.2.1 Đặc tính lý hoá học của gossypol

Gossypol

(1,1’6,6’,7,7’-hexahydroxy-5,5’-di-isopropyl-3,3’-dimethyl-(2,2’-binaphthalene)-8,8’-dicarboxaldehyde) là một hợp chất polyphenol mầu

vàng, được tìm thấy chủ yếu trong các loài thuộc chi bông Gossypium họ

Malvaceae Ngoài ra, gossypol còn được tìm thấy trong vỏ và hoa của cây nhiệt

đới Thespesia populinea, một loại cây phổ biến ở Châu Phi, Châu Á và các đảo ở

Thái Bình Dương Gossypol có cấu tạo gồm 2 khung naphtalene đối xứng, mỗi

khung chứa 3 nhóm -OH và 1 nhóm -CHO (Hình 1.3).

Trang 7

OH CHO HO

OH OH

Gossypol

1 2 3 4 5 6

Hình 1.3 Cấu tạo của gossypol

Do có chứa các nhóm phân cực (6 nhóm hydroxyl và 2 nhóm aldehyde) nêngossypol tan trong nhiều dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, isopropanol,dioxane, diethyl ether, acetone, ethyl acetate, chloroform, carbon tetrachloride,phenol, pyridine, naphthalene nóng chảy, và dầu thực vật nóng Nó ít tan trongglycerine, cyclohexane, benzene, gasoline và ete dầu Tuy nhiên do sự có mặtcủa 2 nhóm dialkylnaphthalene làm cho nó không tan trong nước Điểm chảy củatinh thể gossypol tinh sạch phụ thuộc vào dung môi dùng để kết tinh nó.Gossypol kết tinh trong diethyl ether có điểm chảy là 184ºC, trong chloroform cóđiểm chảy là 199ºC, trong ligroin có điểm chảy là 214ºC [27]

Gossypol tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học là R hay (-)-gossypol và

S hay (+)-gossypol do sự giới hạn khả năng quay của cầu liên kết 2, 2’-binaphthyl

(Hình 1.4) Cả hai dạng đồng phân này đều có nhiều trong hạt bông tuy nhiên tỷ

lệ của chúng là khác nhau tùy theo từng giống và loài Ví dụ trong các giống

bông Gossypium barbadense, (-)-gossypol thường chiến ưu thế, trong khi đó đồng phân (+)-gossypol lại chiếm ưu thế hơn trong Gossypium hirsutum

Hình 1.4 Các dạng đồng phân quang học của gossypol

Trang 8

Hoạt tính sinh dược học của (-)-gossypol và (+)-gossypol khác nhau nên độbền của các đồng phân quang học này rất được quan tâm nghiên cứu Jaroszewski

đã tiến hành thí nghiệm racemic hoá (+)-gossypol bằng nhiệt độ, sử dụng hệ dungmôi nước : dioxane (1 : 3) Kết quả cho thấy không có quá trình racemic hoá xảy

ra sau khi gia nhiệt kéo dài (15 giờ) ở 90ºC [25] Do (-)-gossypol không thể trực

tiếp phân lập từ nguồn nguyên liệu thực vật nên các phương pháp phân lập gossypol tinh khiết quang học được phát triển dựa trên phương pháp kết tinh [49]hay sắc ký các hỗn hợp racemic của gossypol sau khi đã tạo dẫn xuất

(-)-diastereoisomer của gossypol, đặc biệt là dẫn xuất bazơ Schiff [26]

Gossypol tồn tại ở 3 dạng tautomeric khác nhau là: aldehyde, ketone và

hemiacetal trong các dung môi khác nhau (Hình 1.5) Trong các hệ dung môi

thông dụng, gossypol tồn tại chủ yếu ở dạng ketone, nhưng trong các loại dungmôi trơ như chloroform, acetone, dioxane hay trong điều kiện acid, gossypol tồntại chủ yếu ở dạng aldehyde Trong các dung môi phân cực như dimethyl sulfoxide(DMSO) trong môi trường kiềm, gossypol tồn tại ở trạng thái cân bằng giữa cácdạng hemiacetal, dạng aldehyde và dạng ketone Vì vậy, gossypol thường đượchòa tan trong DMSO khi nghiên cứu hoạt tính sinh học, khi đó các dạngtautomeric của gossypol có thể cùng đóng góp vào hoạt tính sinh học của nó

OH CHO HO

OH OH

d¹ng aldehyde

O HO

OH OH HO

H

OH H

d¹ng hemiacetal

OH O

OH O

HO H

OH H

d¹ng ketone Hình 1.5 Các dạng đồng phân tautomer của gossypol

Trang 9

Marchlewski, người đầu tiên phân lập gossypol acetic acid (G-AA) chothấy gossypol dễ bị ôxy hoá trong dung dịch kiềm, có mầu đỏ sáng với dung dịch

H2SO4 đậm đặc, mầu xanh đậm trong FeCl3 Tính chất hoá học của gossypol chủyếu là do các nhóm carbonyl, hydroxyl cũng như là cấu trúc cồng kềnh củakhung binaphthlene quyết định Gossypol có thể phản ứng với các hợp chất khác

để tạo thành gossypol liên kết (bound gossypol) Một số nghiên cứu đã chỉ rarằng, phần lớn gossypol tồn tại ở dạng basơ Schiff bởi phản ứng giữa nhómaldehyde của gossypol với nhóm amino của các protein trong quá trình chế biến

hạt bông Bên cạnh đó, gossypol có thể tạo phức càng cua với sắt trong các sản

phẩm từ hạt bông để tạo thành phức kim loại không tan, nó cũng có thể bị ôxyhóa hoặc tạo thành dạng gossypol polymer Các nhóm –OH phenol của gossypol

có thể phản ứng với các acid carboxylic và các phenol khác trong hạt bông để tạothành các este hoặc ether tương ứng [27]

1.2.2 Đặc tính sinh dược học của gossypol

1.2.2.1 Tác dụng tránh thai cho nam

Gossypol đã được nghiên cứu sâu với vai trò là một thuốc tránh thai trên các

mô hình in vivo bao gồm chuột cống, chuột nhắt, khỉ, chuột đồng, thỏ, bò và cả

trên người Khi cho uống G-AA với liều 5-10 mg/kg thể trọng trong vòng 12tuần thì gây vô sinh trên chuột đực Trên thỏ đực, với liều từ 1,25-10 mg/kg thểtrọng/ngày trong vòng 5-14 tuần làm giảm khả năng di động của tinh trùngnhưng không làm giảm số lượng tinh trùng Khi cho khỉ đực trưởng thành uốngG-AA với liều 5 hay 10 mg/kg thể trọng trong vòng 6 tháng cho thấy nồng độ vàkhả năng di động của tinh trùng giảm, mặc dù không có sự khác biệt về nồng độ

testosterone trong máu [49]

Nghiên cứu cho thấy (-)-gossypol có hoạt tính tránh thai manh hơn gossypol Sử dụng (+)-gossypol với liều 30 mg/kg theo đường uống trong vòng

(+)-14 ngày không những không có hoạt tính tránh thai mà còn gây độc trên chuột

Trang 10

cống đực Trong khi đó, (-)-gossypol với liều 30 mg/kg thể trọng theo đườnguống trong vòng 7 ngày thể hiện rõ hoạt tính tránh thai trên chuột cống đực [61].Thử nghiệm lâm sàng trên 10.000 người đàn ông tình nguyện Trung Quốcvào năm 1978, liều 20 mg/ngày, trong 75 ngày, sau đó với liều duy trì 50 mg/tuầncho thấy chỉ có một số ít trường hợp (0,75%) bị tăng kali huyết, và 10% số đànông dùng gossypol trên 1 năm không phục hồi được quá trình tạo tinh trùng Mộtthử nghiệm quốc tế khác trên 151 đàn ông Brazil, Nigeria, Kenya và Trung Quốccho thấy, khi dùng 15 mg gossypol/ngày trong 12 đến 16 tuần, sau đó dùng liều7,5-10 mg/ngày trong vòng 40 tuần không gây triệu chứng tăng kali huyết và quátrình tạo tinh trùng được phục hồi sau khi dừng sử dụng gossypol [14].

1.2.2.2 Hoạt tính chống virus, vi sinh vật và động vật nguyên sinh

Lin và cộng sự (1989) đã báo cáo gossypol ức chế quá trình tái bản củavirus HIV loại 1 (HIV-1) và ông nhận thấy rằng (-)-gossypol (IC50 = 5,2 µM) ứcchế mạnh hơn (+)-gossypol (IC50 = 50,7 µM) [33] Bên cạnh đó, gossypol cũngcho thấy khả năng chống lại các loại virus khác bao gồm virus herpes simplexloại 2 (HSV-2), virus cúm, và á cúm [57]

Đặc tính chống vi sinh vật của gossypol cũng đã được nghiên cứu Gossypol

có hoạt tính kháng nấm với giá trị LD50 khoảng từ 20-100 ppm và có tác dụng ứcchế mạnh các vi sinh vật bao gồm bào tử trong không khí, lactobacilli và một sốnấm Vadehra và cộng sự (1985) đã nghiên cứu tác động của gossypol lên sự sinh

trưởng của một số loại vi khuẩn, sự hình thành và nảy mầm của bào tử Bacillus cereus Các tác giả đã nhận thấy rằng gossypol có tác dụng kháng các vi khuẩn gram dương (ví dụ: Streptococus spp, Bacillus spp, Staphylococus aureus) mạnh hơn so với các vi khuẩn gram âm như Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Shigela spp và Escherichia coli Nhóm nghiên cứu cũng nhận thấy các loại nấm như Saccharomyces cereviseae, S uvarum, S diasticu cũng nhạy cảm với

gossypol, sự sinh trưởng của chúng bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ 50 ppmgossypol [55]

Trang 11

Bệnh sốt rét ở người thường được gây ra bởi sự lây nhiễm của các ký sinh

trùng như Plasmodium falciparum, P malariae, P ovale và P vivax Hàng năm

có khoảng 350-500 triệu trường hợp lây nhiễm với hơn 1 triệu người chết vì bệnh

sốt rét Gossypol cho thấy khả năng kháng ký sinh trùng sốt rét P falciparum với

giá trị IC50 trong khoảng 7 đến 28 µM Một số dẫn xuất của nó cũng cho thấy khảnăng kháng ký sinh trùng sốt rét (IC50 trong khoảng 12 đến 83 µM), trong đó tácdụng mạnh nhất là dẫn xuất 1,1’ nitrile gossylic của nó với IC50 là 13 µM trên P.

falciparum [44] Hoạt tính chống sốt rét của gossypol và dẫn xuất thông qua sự

ức chế LDH, một enzyme quan trọng nhất trong chu trình sống kỵ khí của P falciparum Nghiên cứu trên Entamobea histolytica cũng cho thấy gossypol có

khả năng ức chế alcohol dehydrogenase và các malic enzyme, (-)-gossypol cóhoạt tính mạnh hơn gossypol racemic và (+)-gossypol (-)-Gossypol có hoạt tính

ức chế malic enzyme mạnh hơn 3,6 và 13 lần so với gossypol racemic và gossypol Tác dụng ức chế alcohol dehydrogenase của (-)-gossypol mạnh gấp 1,9

(+)-và 2,9 lần so với gossypol racemic (+)-và (+)-gossypol [45] Gossypol cũng đã được

báo cáo là có khả năng ức chế Trypanosome, một ký sinh trùng gây bệnh mãn

tính được gọi là ốm ngủ (sleeping sickness) với IC50 khoảng 7,8 ppm sau 24 h xử

lý với gossypol Trên T crizi gossypol ức chế các oxidoreductase như

alpha-hydroxyacid và malate dehydrogenase, các enzyme liên kết với NAD vàglutamate dehydrogenase, malic enzyme, glucose-6-phosphate dehydrogenase,các enzyme phụ thuộc vào NADP [16] Theo đó, cơ chế chống ký sinh trùng củagossypol có thể là sự ức chế chọn lọc các enzyme thiết yếu của ký sinh trùng

1.2.2.3 Hoạt tính chống ôxy hoá

Giống như nhiều hợp chất phenolic khác như coumaric acid, gallic acid,quercetin, myricetin, catechin, gallocatechin, gossypol cũng là một chất chốngôxy hoá tự nhiên hiệu quả Ví dụ, gossypol có khả năng bảo vệ caroten chống lại

các peroxide béo in vitro Các sản phẩm từ hạt bông chứa gossypol có khả năng

ức chế quá trình phân huỷ và ôi của carotene in vitro Gossypol cũng có thể đóng vai trò là chất chống ôxy hoá bảo vệ caroten in vivo Gossypol có khả năng ức

Trang 12

chế quá trình peroxy hoá các vi thể gan chuột khi ủ với ferric/ascorbate (IC50 <0,1 µM) [28] Gossypol còn có tác dụng làm bền dầu biodiesel hạt bông Vớinồng độ 0,1% gossypol, chỉ số bền với quá trình ôxy hoá (oxidation stabilityindices) của dầu biodiesel hạt bông tăng từ 4,15 h lên đến 17,2 h ở 110ºC [18].Hoạt tính chống ôxy hoá của các dẫn xuất bazơ Schiff của gossypol nhưgossypol-urê, gossypol-benzene-thiol và gossypol glycineindicate cũng có hoạttính chống ôxy hoá tương đương với gossypol Ngược lại, khi thay đổi các nhóm–OH phenol của gossypol lại làm giảm hoạt tính chống ôxy hoá, khả năng thudọn gốc tự do, lực khử và khả năng ngăn cản sự phá huỷ ADN của gossypol.[64, 65] Điều này đã chứng tỏ rằng các nhóm hydroxyl đóng vai trò quyết địnhhoạt tính chống ôxy hoá của gossypol Ví dụ, 6-methoxy gossypol có hoạt tínhthu dọn gốc tự do tương tự như 6, 6’-dimethoxy gossypol, trong khi đó gossypol

có hoạt tính thu dọn gốc tự do mạnh hơn các dẫn xuất methyl hoá của nó Tácdụng của gossypol và các dẫn xuất methyl hoá của nó chống lại sự phá huỷ ADNgây bởi tia cực tím và hydrogen peroxyde cũng phù hợp với tác dụng chống ôxyhoá của chúng Điều này đã chỉ ra rằng tác dụng bảo vệ ADN của gossypol mộtphần nào đó là do quá trình dập tắt các gốc tự do, từ đó làm giảm bớt stress ôxyhoá Trong một nghiên cứu trước đây cũng chứng minh gossypol có tác dụng phụthuộc theo liều, bảo vệ ADN plasmid siêu xoắn khỏi bị phá huỷ dưới tác độngcủa Fe3+/ascorbate [30].

1.2.2.4 Tác dụng chống ung thư

Tác dụng chống ung thư của gossypol lần đầu tiên được Tuszinsky vàCossu phát hiện vào năm 1984 Họ đã tiến hành nghiên cứu tác động củagossypol lên sự sinh trưởng của một số dòng tế bào ung thư của người nhưmelanoma (WM9, WM56, WM164), ung thư biểu mô ruột kết (SW407,SW1084, SW1116), dòng erythroleukemia (K562), adenocarcioma (HT3) và trêndòng nguyên bào sợi bình thường của phổi phôi thai (WI38) Kết quả cho thấycác dòng tế bào melanoma và ung thư biểu mô ruột kết của người nhạy cảm với

Trang 13

gossypol nhất, với giá trị IC50 vào khoảng 5 µM Trong khi đó các dòng tế bàoung thư khác và dòng nguyên bào sợi bình thường chỉ nhạy cảm với gossypol ởnồng độ trên 20 µM Mặc dù gossypol có độc tính tế bào cao trên môi trườngnuôi cấy nhưng liều gây chết của nó lại khá cao (LD50 = 2400 mg/kg) trên chuột

cống, điều này đã chỉ ra rằng gossypol có độc tính thấp in vivo trên các mô bình thường Với độc tính thấp của gossypol trên in vivo cùng với tác dụng đặc hiệu

của nó trên một số dòng tế bào ung thư làm cho gossypol rất có tiềm năng làmthuốc điều trị ung thư [53]

Kể từ đó đã có rất nhiều báo cáo về tác dụng chống ung thư in vitro của

gossypol trên các tế bào ung thư khác nhau như ung thư buồng trứng (IC50 từ 3,8 µM) [66], ung thư tiền liệt tuyến (IC50 = 10 µM) [68], ung thư vú ( MCF-7,

1,5-IC50 = 3,4-24 µM) [7, 24, 64], ung thư dạ con (IC50 = 2,9-14 µM) [29], ung thưtuyến thượng thận (IC50 = 1,3-2,9 µM) [29], ung thư phần tuỷ tuyến giáp (IC50 =18,9 µM) [29], ung thư phổi (IC50 = 0,5 µM trên A549 và 30 µM trên H69) [13,51], ung thư ruột (IC50 =17 µM) [64], ung thư máu (IC50 = 8,3-15 µM) [51, 38],ung thư tụy (IC50 = 3 µM) [7], ung thư da tế bào hình vảy (IC50 = 2,5-10 µM)[40] và melanoma (IC50 = 2,4-5 µM) [24]

Ở Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Đăng Quân và cộng sự cho thấy hỗn

hợp gossypol racemic phân lập từ hạt bông Gossypium hirsutum trrồng tại Việt

Nam có tác dụng ức chế phân bào trên hai dòng tế bào ung thư người là dòng tếbào ung thư cơ RD (Rhabdomyosarcoma) và dòng tế bào ung thư biểu bì HEp2(Epidermoid carcinoma) Tuy nhiên các tác giả không đưa ra giá trị IC50 của hỗnhợp gossypol racemic trên 2 dòng tế bào được khảo sát [3]

Một số nghiên cứu đã chứng minh (-)-gossypol có độc tính tế bào mạnh hơn

so với (±)-gossypol và (+)-gossypol Nghiên cứu cho thấy (-)-gossypol có độctính tế bào mạnh hơn 2-14 lần so với (+)-gossypol trên các dòng tế bào người [7].Đặc biệt hoạt tính chống ung thư của (-)-gossypol cũng đã được so sánh với cácthuốc thường dùng để điều trị cho bênh nhân melanoma, ung thư phổi và ung thư

Trang 14

máu (-)-Gossypol có hoạt tính cao hơn cisplatine, melphalan, dacarbazine trên 2dòng melanoma, cisplatine và daunorubicin trên dòng ung thư phổi, (-)-gossypolcũng có hoạt tính mạnh hơn hydroxyure và busulphan trên một số dòng ung thưmáu [50] Gossypol cũng có tác dụng chống lại các dòng tế bào ung thư khángvới các thuốc chống ung thư đã được sử dụng trên lâm sàng như adriamycin,vinblastine, cisplatine [24] Điều đáng lưu ý là (-)-gossypol thể hiện độc tính tếbào một cách chọn lọc được thể hiện bằng liều gây độc của nó trên các dòng tếbào thường cao hơn so với các dòng tế bào ung thư (-)-Gossypol có hoạt tínhchống tăng sinh gấp 5-10 lần trên các dòng tế bào ung thư khi so sánh với các tếbào gan bình thường trên môi trường nuôi cấy [6] Trong nghiên cứu của Oliver

và cộng sự, (-)-gossypol ức chế sự sinh trưởng của 10 dòng tế bào ung thư biểu

mô hình vảy ở đầu và cổ với IC50 trong khoảng 2.5-10 µM, trong khi đó giá trịnày trên nguyên bào sợi bình thường cao gấp 2-10 lần và trên keratinocyte caogấp 2-3 lần [41]

Cơ chế gây độc tế bào của gossypol cũng đã được nghiên cứu Gossypol

đã được biết đến từ những năm 1990 với vai trò là một chất ức chế các enzymetrong tế bào chất và ty thể có liên quan đến quá trình tạo năng lượng của tế bào[58], ức chế các enzyme liên quan đến quá trình tái bản và sửa chữa ADN baogồm ADN-polymerase α, topoisomerase II và làm cản trở quá trình tổng hợpADN Với nồng độ 10 µM, gossypol đã được báo cáo là đã có tác dụng ức chếquá trình tổng hợp ADN bằng cách cản trở checkpoint G1/S trên MCF-7 sau 24 h[32] Gossypol có thể điều hoà chu trình tế bào bằng cách điều biến protein điềukhiển chu trình tế bào Rb và cyclin D1 và quá trình phosphoryl hoá Rb Xử lý tếbào Ramos với gossypol không chỉ gây dừng chu trình tế bào ở pha G0/G1 màcòn làm tăng quá trình apoptosis và ức chế sinh trưởng của tế bào gây ra bởietoposide (VP-16), doxorubicin hydrocloride (ADM), vincristine (VCR), vàpaclitaxel (Taxol) [31]

Gossypol cũng đã được chứng minh là gây ra apoptosis trên nhiều dòng tếbào ung thư như các tế bào ung thư ruột kết [67], ung thư máu [17], ung thư tiền

Trang 15

liệt tuyến [67], ung thư bàng quang [34] Trong các nghiên cứu này, tác dụng gâyapoptosis của gossypol đã được chứng minh thông qua sự điều hoà biểu hiện cácthành viên trong họ protein Bcl-2, một họ protein ở màng ngoài ty thể, có vai tròquan trọng trong quá trình hoạt hoá các caspase Trên dòng tế bào ung thư bàngquang là UM-UC2 (dòng nhạy cảm với thuốc) và UM-UC9 (dòng kháng thuốc),(-)-gossypol làm giảm biểu hiện của các protein anti-apoptosis trong họ Bcl-2 làBcl-2, Bcl-xL và Mcl-1, thường được biểu hiện cao trong các dòng tế bào ung thưkháng thuốc và làm tăng biểu hiện của các protein pro-apoptosis trong họ nàynhư Bim, Puma Do đó (-)-gossypol làm cho các dòng tế bào ung thư bàng quang

đã kháng với các thuốc hoá trị liệu như carboplatin, gemcitabine và paclitaxel trởnên nhạy cảm trở lại [34] (-)-Gosssypol cũng đã được chứng minh là đã đánh bạiđược sự kháng apoptosis do sự biểu hiện quá mức của Bcl-2 và Bcl-xL trên tế bàoung thư máu Jurkat T Apoptosis gây bởi (-)-gossypol có liên quan đến sự hoạt

hoá Bak và giải phóng cytochrome c từ ty thể, điều này cho thấy rằng cơ chế

apoptosis này liên thông qua con đường ty thể Hơn nữa việc xử lý (-)-gossypoltrên ty thể tinh sạch từ các tế bào có biểu hiện quá mức Bcl-2 thì kết quả cũng

cho thấy có sự giải phóng cytochrome c, chứng tỏ có sự tác động trực tiếp lên

Bcl-2 có mặt trên màng ngoài của ty thể [41] Nghiên cứu gần đây đã chứngminh (-)-gossypol hoạt động như một chất bắt chước domain BH3 (mimeticBH3), liên kết với các domain BH3 của các thành viên anti-apototic trong họBcl-2 như Bcl-2, Bcl-xL, từ đó gây ra apoptosis [59]

Một nghiên cứu trên in vivo đã cho thấy (-)-gossypol làm tăng cường hoạt

tính chống ung thư khi chiếu xạ tia X, tác dụng này theo cơ chế ức chế cả haiprotein anti-aposis Bcl-2/Bcl-xL [63] Sử dụng kết hợp docetaxel và (-)-gossypol

làm tăng cường hoạt tính chống ung thư tiền liệt tuyến PC-3 của docetaxel cả in vitro và in vivo (mô hình xenograft trên chuột nhắt).Tác dụng chống ung thư của(-)-gossypol thông qua sự ức chế protein anti-apoptosis Bcl-xL cùng với sự tăngcường biểu hiện các protein pro-apoptosis là Noxa và Puma [37]

Trang 16

Đặc biệt, đã có nhiều thử nghiệm lâm sàng về tác dụng chống ung thư củagossypol trong những năm gần đây Một trong những thử nghiệm lâm sàng đầutiên vào năm 1993 sử dụng gossypol theo đường uống với liều 30-70 mg trên 21bệnh nhân ung thư thượng thận di căn, 30% trong số bệnh nhân này có phản ứngtốt với liệu pháp, trong đó có 3 bệnh nhân giảm trên 50% kích thước khối u sau 6tuần điều trị [19] Một thử nghiệm lâm sàng khác, pha I/II, trên 20 phụ nữ bị mắcung thư vú di căn với liều 30-50 mg gossypol/ngày theo đường uống cho thấy có

1 bệnh nhân ít đáp ứng với thuốc, 2 bệnh nhân giảm trên 50% các marker ungthư trong huyết thanh Các tác dụng phụ bao gồm buồn nôn, mệt mỏi, thay đổi vịgiác, tiêu chảy Độc tính trên da đã giới hạn liều sử dụng gossypol, liều dung nạptối đa là 40 mg/ngày [56]

AT-101 là đồng phân (-)-gossypol đã được công ty dược AscenteTherapeutics thử nghiệm lâm sàng pha I trên bệnh nhân ung thư để xác định liềudung nạp tối đa và phác đồ điều trị của thuốc này khi sử dụng đơn lẻ [46] Thửnghiệm lâm sàng pha I để đánh giá thuốc khi sử dụng phối hợp với cisplatine vàetoposite trên bệnh nhân ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC) cũng đang được tiếnhành [69] Một thử nghiệm lâm sàng khác ở pha I/II cũng đang được tiến hành tại

Mỹ trên bênh nhân ung thư tiền liệt tuyến Hai mươi ba bệnh nhân nam bị mắcung thư tiền liệt tuyến mới sử dụng hoá trị liệu nhưng có PSA (Prostate-Specific-Antigen) tăng được uống 30 mg (-)-gossypol trong 21 ngày trong chu trình điềutrị 28 ngày, sau 20-24 tuần điều trị cho thấy giảm chỉ số PSA trong một số trườnghợp 5 trong số 23 bệnh nhân không thể tiếp tục sử dụng thuốc do tác dụng phụtrên đường ruột Gần đây nhất, ngày 28 tháng 10 năm 2009, (-)-gossypol đượcthử nghiệm lâm sàng pha I/II dùng phối hợp với Lenalidomide trong điều trịbệnh bạch cầu lympho bào mãn tính (CLL) trên 45 bệnh nhân [69]

Tóm lại, gossypol là một hợp chất polyphenol trong tự nhiên có rất nhiềuhoạt tính sinh dược học giá trị như tác dụng tránh thai cho nam, chống virus,chống vi sinh vật và động vật nguyên sinh, chống oxi hóa và chống ung thư.Trong đó, (-)-gossypol đã cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn hẳn

Trang 17

(+)-gossypol như hoạt tính tránh thai, chống HIV và chống ung thư Với tác dụnggây apoptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư, đặc biệt là tác dụng trên cả cácdòng tế bào đã kháng với các thuốc hóa trị liệu hay xạ trị, (-)-gossypol cũng đãchứng tỏ tác dụng tốt trên lâm sàng nên hứa hẹn sẽ trở thành một thuốc mới gópphần điều trị bệnh ung thư.

1.3 Bệnh ung thư

1.3.1 Ung thư là gì?

Ung thư là quá trình sinh trưởng bất bình thường của các tế bào gây ra bởinhững biến đổi phức tạp trong biểu hiện gene dẫn đến làm mất cân bằng giữa quátrình tăng sinh và quá trình chết của tế bào và cuối cùng phát triển thành mộtquần thể tế bào có thể xâm chiếm các mô và di căn đến các vị trí khác, gây bệnh

và nếu không điều trị thì sẽ làm chết vật chủ

Trên quan điểm của lâm sàng, ung thư là một nhóm lớn các bệnh, có lẽkhoảng hai trăm bệnh, đa dạng theo độ tuổi mắc bệnh, tốc độ phát triển, trạngthái biệt hoá của tế bào, triệu trứng, khả năng xâm lấn, di căn, phản ứng với cáchđiều trị và chẩn đoán Trên quan điểm của sinh học phân tử và tế bào, ung thư cóthể là một số lượng nhỏ các căn bệnh gây bởi những khiếm khuyết trong chứcnăng của tế bào ở mức độ phân tử do những biến đổi thông thường trong cácgene của tế bào Cuối cùng, ung thư là một bệnh với những bất thường trong biểuhiện gene Có một số cơ chế làm biến đổi biểu hiện gene Các cơ chế này có thểxảy ra theo con đường tác động trực tiếp đến ADN như đột biến gene, hoán vịgen, khuyếch đại gen, mất gene hay theo cơ chế bất thường trong phiên mã vàdịch mã Toàn bộ kết quả này làm mất cân bằng giữa quá trình tái bản của tế bào

và quá trình chết của tế bào trong quần thể tế bào ung thư dẫn đến sự phát triểncủa mô khối u [46]

Trang 18

1.3.2 Tình hình phát triển bệnh ung thư trong nước và trên thế giới

Ung thư là một trong những nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nướcphương Tây Ở Mỹ và một số nước Châu Âu, ung thư là nguyên nhân gây chếtthứ 2 đứng sau bệnh tim mạch Riêng ở Mỹ, kể từ năm 1999, số người chết ở độtuổi dưới 85 vì bệnh ung thư đã vượt qua bệnh tim Ở Mỹ, hàng năm có hơn 1,3triệu ca ung thư mắc mới, trong đó không kể có trên 1 triệu ca hàng năm Mức độnguy hiểm cao nhất trong các bệnh ung thư là ung thư phổi, ung thư ruột kết, ungthư trực tràng, ung thư vú và ung thư tiền liệt tuyến Hàng năm có hơn 570 nghìnngười chết bởi ung thư tại Mỹ [46]

Tại Việt Nam, ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu Theo thống kê,hàng năm Việt Nam có khoảng 200.000 người mắc bệnh ung thư và 150.000bênh nhân tử vong vì căn bệnh này Chỉ tính riêng tại TPHCM, mỗi năm cókhoảng 5.500-6.000 ca ung thư mới, trong đó thường gặp nhất là ung thư phổi,gan, dạ dày ở nam giới; ung thư vú, cổ tử cung, phổi ở nữ giới [73]

1.3.3 Sơ lược về các thuốc điều trị ung thư

Cùng với phương pháp điều trị tại chỗ như phẫu thuật và xạ trị phương phápđiều trị toàn thân bằng hoá trị liệu đã góp phần quan trọng vào điều trị và chămsóc bệnh nhân ung thư Các thuốc chống ung thư đang được sử dụng trong hoá trịliệu hiện nay có thể chia thành các nhóm như sau:

- Nhóm chống chuyển hoá: Các thuốc thuộc nhóm này tác động vào quá trình

chuyển hoá các chất có nhân pyrimidine và purine Ví dụ, 5-fluorouracil ức chếsinh tổng hợp vòng purine, ức chế methyl hoá acid deoxyurydylic thành acidthymidylic Methotrexate ức chế men khử dihydrofolate reductase cần thiết choviệc tạo các folate khử vốn là các gốc methyl trong tổng hợp thymidine…

- Nhóm alkyl hoá, mutard nitơ: Các nhóm alkyl hóa có trong cấu trúc phân tử sẽ

gắn vào nhóm ái điện tử trong ADN tạo ra các liên kết chéo giữa 2 chuỗi ADN

và các liên kết ngang giữa các bazơ nitơ gần nhau làm ức chế hoạt động củaADN Trong nhóm thuốc này có thể kể đến cisplatine, cyclophosphamide…

Trang 19

- Nhóm các thuốc tác động đến tubulin: Trong nhóm này có thể kể đến như docetaxel, paclitaxel (từ cây thông đỏ Taxus wallichiana Zucc.) và vinblastine, vincristine (từ dừa cạn Catharanthus roseus);

- Nhóm các thuốc có tác động ức chế enzyme topoisomerase: Topoisomerase là

enzyme cần thiết cho việc tháo xoắn của ADN cần thiêt cho quá trình phân chiacủa tế bao Trong nhóm này có thể kể đến etoposide (dẫn xuất của

podophyllotoxin từ Podophyllum peltatu) có tác dụng ức chế enzyme

topoisomerase II

- Điều trị ung thư theo hướng đích (Targeted cancer therapy): Liệu pháp này sử

dụng các loại thuốc ngăn sự phát triển và lan rộng của tế bào ung thư bằng cáchcản trở các phân tử đặc hiệu liên quan đến quá trình sinh ung thư và phát triểnkhối u Các liệu pháp điều trị ung thư theo hướng đích là phương pháp hiệu quảhơn các thuốc điều trị truyền thống và ít gây độc trên các tế bào thường hơn.Trong liệu pháp này có thể kể đến như sử dụng các kháng thể đơn dòng và cácđộc tố miễn dịch đặc hiệu, các chất chống tạo mạch máu mới nuôi khối u, cácchất chống proteasome như bortezomide, các thuốc ức chế Bcl-2 gây apoptosisnhư genasene, Hầu hết các thuốc điều trị ung thư hướng đích hiện nay mới đangđược thử nghiệm tiền lâm sàng, một số đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng vàmột số khác đã được FDA đồng ý đưa vào điều trị Điều trị ung thư hướng đích có thể

sử dụng đơn lẻ, kết hợp với nhau hoặc kết hợp với các thuốc hóa trị liệu khác [2, 46]

1.3.4 Chất ức chế protein anti-apoptosis họ Bcl-2 và tiềm năng trong liệu pháp điều trị ung thư

- Họ protein Bcl-2 và con đường apoptosis:

Apoptosis là một cơ chế “chết theo chương trình của tế bào” làm cho cácsinh vật đa bào có thể điểu khiển được số lượng tế bào trong các mô và loại bỏcác tế bào không cần thiết hay đã bị lão hoá trong quá trình phát triển của cơquan Apoptosis được xảy ra bởi quá trình hoạt hoá liên tiếp các cysteineprotease trong họ caspase theo cả hai con đường Con đường bên ngoài là hoạt

Trang 20

hoá caspase-8 (caspase 10 trên người) xảy ra khi quá trình trimer hoá thụ thể cáichết (death receptor) trên màng tế bào Con đường bên trong (còn được gọi làcon đường ty thể hay con đướng stress) hoạt hoá caspase-9 bởi protein Apaf-1

khi cytochrome c được giải phóng ra khỏi ty thể phản ứng với các stress khác

nhau như mất các cytokine và sai hỏng trong ADN Các caspase khởi đầu(initiator caspase) này có thể phân cắt và hoạt hóa các caspase thi hành (effectorcaspase) (caspase-3, caspase-6 và caspase-7), gián tiếp làm phá huỷ tế bào bằng

cách phân cắt hàng loạt các protein thiết yếu của tế bào [58] Hình 1.6 mô tả quá

trình apoptosis thông qua con đường ty thể gây ra bởi hóa trị liệu hoặc tia xạ

Hình 1.6 Apoptosis thông qua con đường ty thể [35]

Trang 21

Con đường bên trong được kiểm soát bởi họ protein Bcl-2, thông qua sựđiều khiển tính nguyên vẹn của màng ngoài ty thể Các protein thuộc họ Bcl-2(B-cell lymphoma 2) có thể phân làm 3 nhóm:

- Các protein anti-apoptotic (pro-survival): chúng có trình tự tương đồng tạicác domain BH1, BH2, BH3 và BH4 (BH = Bcl-2 homology), ví dụ như các Bcl-

oligomer trên màng ngoài ty thể, giải phóng cytochrome c và hoạt hoá caspase,

trong khi đó các protein anti-apoptosis lại ngăn cản quá trình giải phóng này bằngcách cản trở sự hoạt hóa Bax và Bak Các protein BH3-only đóng vai trò khởiđộng cái chết của tế bào, hoạt tính của chúng đựơc kiểm soát chặt chẽ bởi các cơchế phiên mã và sau phiên mã Khi được hoạt hoá bởi tín hiệu stress, các proteinBH3-only liên kết đặc hiệu vào bên trong rãnh kỵ nước của các protein anti-

apoptosis họ Bcl-2 Chính sự kết cặp này dẫn đến làm hoạt hoá Bax/ Bak [58].

- Tiềm năng của một số chất ức chế protein anti-apoptosis họ Bcl-2 làm thuốc điều trị ung thư

Những sai sót trong quá trình apoptosis thường xảy ra trong nhiều loại khối u

ác tính trong đó thường do có sự biểu biện quá mức của họ protein Bcl-2, chủ yếu

là Bcl-2 và Bcl-xL Sự biểu hiện quá mức của các protein này ngăn cản apoptosisthông qua con đường ty thể, góp phần vào quá trình kháng với liệu pháp hoá học

và xạ trị của tế bào ung thư Do đó, các chất bắt chước domain BH3, có khả năng

liên kết với 1 hay nhiều protein anti-apoptosis trong họ Bcl-2, phát động quá trìnhapoptosis, rất có tiềm năng trở thành thuốc chống ung thư đặc biệt là để chống lạitính kháng với liệu pháp hoá học và xạ trị của các tế bào ung thư

Trang 22

Một nghiên cứu dựa trên cấu trúc của các protein họ Bcl-2 đã thiết kế raphân tử ABT-737, có khả năng liên kết mạnh với domain liên kết với BH3 (ái lực

cỡ nM) của Bcl-2 Bcl-xL và Bcl-w nhưng không liên kết với Mcl-1, A1

ABT-737 đã được chứng minh là có tác dụng trên nhiều loại tế bào ung thư lympho B,ung thư máu lympho bào mãn tính (CLL) cũng như là dòng tế bào ung thư phổi

tế bào nhỏ Đặc biệt, nó có tác dụng ức chế hiệu quả các tế bào ung thư phổi trênchuột (mô hình xenografts) với ít tác dụng phụ Nó cũng gây chết tế bào ung thư

bạch cầu cấp tính (AML) nhưng lại không làm chết tế bào máu bình thường in vitro và ức chế ung thư máu trên mô hình xenografts mà không gây tác dụng phụ.

ABT-737 và A-385358-chất ức chế Bcl-xL đặc hiệu đã được chứng minh là làmcho tế bào ung thư trở lên nhạy hơn với các thuốc hoá trị liệu khác nhưdexamethasone, vincristine, và L-asparagine [5]

Obatoclax (GX15-070), đây là một dẫn xuất indol bipyrrol của prodigininetrong vi khuẩn được phát triển bởi hãng dược phẩm Gemin X Biotechnology(Canada), có đặc tính bắt chước BH3 Khác với ABT-737, obatoclax có khả năng

ức chế không những Bcl-2 mà còn có khả năng ức chế cả Mcl-1 Obatoclax gâyapoptosis trên các dòng tế bào ung thư máu, ung thứ vú và thậm trí trên cả cácdòng tế bào đã kháng với các thuốc khác như melphalan, ABT-737 hoặcbortezomib Đã có nghiên cứu cho thấy rằng obatoclax liên kết với Bcl-w, Bcl-xL

và Mcl-1 tái tổ hợp và làm phá vỡ mối tương tác Mcl-1/Bak trong tế bào [35]

Hinh 1.7 Mô hình liên kết giữa Bcl-2 với (-)-gossypol và Bim

Trang 23

Nhờ vào quá trình sàng lọc dựa trên cơ sở dữ liệu cấu trúc phân tử để xácđịnh các phân tử liên kết với rãnh liên kết với BH3 của Bcl-2 và Bcl-xL,Shaomeng Wang đã phát hiện (-)-gossypol có ái lực khá cao với Bcl-2 và Bcl-xL.(-)-Gossypol có giá trị Ki lần lượt là 320 nM và 480 nM với Bcl-2 và Bcl-xL (-)-Gossypol cũng liên kết với Mcl-1, là một protein anti-apoptosis khác trong họnày với giá trị Ki là 180 nM Để hiểu rõ về cơ sở cấu trúc của (-)-gossypol liênkết với Bcl-2, dựa vào việc mô hình hoá trên máy tính họ đã tiến hành gắn (-)-gossypol vào rãnh liên kết với BH3 trong Bcl-2 Dựa trên sự mô hình hoá này đãxác định (-)-gossypol tạo nên mạng lưới liên kết hydro với Arg 146 và Asn 143trong Bcl-2 thông qua nhóm aldehyde và nhóm hydroxyl lân cận trên vòngnaphthalene bên phải Nó bắt chước mạng lưới liên kết hydro tạo bởi Asp 99 vàAsn 102 trong Bim và Arg 146 và Asn 143 trong Bcl-2 Nhóm isopropyl trongcùng vòng naphthalene này gắn vào hốc kỵ nước trong Bcl-2, phần nào bắtchước Phe 101 trong Bim Phần bên phải của (-)-gossypol tương tác chủ yếu với

Bcl-2 thông qua tương tác kỵ nước, bắt chước Ile 97 trong Bim (Hình 1.7)[59]

Trang 24

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu thực vật và các dòng tế bào ung thư

Hạt của của các giống khác nhau thuộc hai loài bông G barbadense và G hirsutum đã được cán loại xơ do Thạc sĩ Trần Văn Tâm, Phòng di truyền và chọn

giống, Viện Nghiên cứu và phát triển cây bông, Nha Hố, Ninh Thuận cung cấp

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: Hep-G2

(Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; LU-1 (Human lung carcinoma) – ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

- Các hóa chất và dung môi dùng cho tổng hợp, tinh chế, đo các loại phổ và

thử độc tính tế bào (MTT assay) được mua của hãng Merck hoặc Sigma.Vincristine được cung cấp bởi Tiến sỹ Trần Bạch Dương-Viện Hóa Công nghiệp.Các dung môi dùng cho chiết xuất là dung môi tinh khiết của Trung Quốc

- Các thiết bị nghiên cứu chính được sử dụng gồm:

• Xác định độ ẩm trên máy Precisa HA60 - Viện Dược liệu

• Máy quang phổ tử ngoại Cary 1E (Varian) - Viện Dược liệu

• Máy đo điểm nóng chảy: SMP3 (Stuart) - Viện Dược liệu

Máy quang phổ hồng ngoại Impact 410 Nicolet - Viện Hoá học

• Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) được đo trên máy ShimadzuLC-MS 2010 EV - Khoa Hóa học - Đại học Quốc Gia Hà Nội

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic ResonanceSpectroscopy, NMR) được đo trên máy Bruker AM500-FT-NMR -Viện Hóa học

Trang 25

• Máy phân cực kế Electronic Polarimeter-P3001 - Viện Dược liệu.

• Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của hãng Agilent 1200 (Mỹ) Trường Đại học Dược Hà Nội

-• Các thiết bị để nuôi cấy và phân tích độc tính tế bào gồm có: Tủ ấm

CO2 (INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II, máy li tâm(Universal 320R), kính hiển vi ngược (Zeizz), tủ lạnh sâu -250C đến-800C Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ), máy quang phổ (GeniosTecan) - Viện Hóa học

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết xuất

Quy trình chiết gossypol từ hạt bông được tiến hành dựa theo phương phápcủa Carruth được cải tiến [8]

Hạt bông G barbadense (giống HD139) sau khi đã cán loại xơ bông được

phơi khô, nghiền nhỏ và phân tách nhân ra khỏi lớp vỏ bên ngoài Bột nhân thuđược sau đó được xác định độ ẩm trên máy Precisa HA60 Phần nhân hạt thuđược dưới dạng bột được bảo quản ở nhiệt độ -180C cho tới khi được sử dụng đểnghiên cứu tách gossypol

Bột nhân hạt bông được chiết qua ete dầu (nhiệt độ sôi 30-600C) để loại cáctạp chất kém phân cực và sau đó tiếp tục được chiết bằng diethyl ether Các quátrình này đều được tiến hành trên máy chiết soxhlet Phần dịch chiết ete dầu vàdiethyl ether (DEE) được bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiếttương ứng

2.2.2 Phương pháp định tính gossypol

Phần chiết ete dầu và cao chiết diethyl ether (cao chiết DEE) được định tínhgossypol bằng 2 phương pháp: Phương pháp quang phổ tử ngoại và phương phápsắc ký lớp mỏng

Trang 26

2.2.2.1 Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV-Vis)

Gossypol trong cloroform có phổ tử ngoại với 4 đỉnh hấp thụ là: 243, 278,

289 và 365 nm Trong đó đỉnh 365 nm là đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhómaldehyde tự do Phần chiết ete dầu và DEE được hoà trong chloroform ở nồng độthích hợp và đo phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng từ 200-500 nm trên máy UV-Visible Spectrophotometer Cary 1E (Varian)

2.2.2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Dịch chiết được tiến hành sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck),khai triển bằng hệ dung môi: n-hexan/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4 Bảnmỏng sau khi sấy khô cho bay hết dung môi được nhuộm bằng thuốc thử H2SO4

20% trong EtOH hơ nóng trên bếp điện để hiện mầu Tiến hành tương tự vớithuốc thử FeCl3 5% Gossypol phản ứng với thuốc thử H2SO4 cho mầu đỏ vàphản ứng với thuốc thử FeCl3 cho mầu xanh đậm trên bản mỏng quan sát dướiánh sáng thường

2.2.3 Phương pháp tinh chế gossypol

2.2.3.1 Phương pháp tinh chế gossypol bằng sắc ký cột

Cao chiết DEE được tiến hành phân lập trên cột sắc ký với chất hấp phụ làsilica gel pha thuận cỡ hạt 0,04-0,063 mm (Merck) với khối lượng gấp 30 lầnkhối lượng mẫu cần phân tách Hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp n-hexane-

/EtOAc/acetic acid với độ phân cực tăng dần (100/0/1 – 80/20/1) Tốc độ dòngđược điều chỉnh ở 5 ml/phút

Quá trình chạy cột được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và được thực hiện

trên bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck) với hệ dung môi khai triển là hexane/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4, hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 20%trong EtOH Các phân đoạn có các chất cùng Rf được gộp lại với nhau rồi bốc hơidung môi dưới áp suất giảm trong điều kiện tránh ánh sáng Sản phẩm thu đượcsau đó được kết tinh lại dưới dạng G-AA trong dung môi DEE và acetic acid băng

Trang 27

n-2.2.3.2 Kết tinh gossypol từ cao chiết diethyl ether của hạt bông

Gossypol được kết tinh dưới dạng gossypol acetic acid (G-AA) trong dungmôi DEE và acetic acid băng Quá trình kết tinh được tiến hành trong bình cầudung tích 100 ml Phương pháp chung là cao chiết DEE từ 100 g hạt bông (chuẩn

bị theo phương pháp đã được mô tả ở mục 2.2.1) được hoà tan trong một thể tích

DEE xác định (khoảng 6 ml cho 100 g hạt), dung dịch thu được sau đó đượcthêm acetic acid băng Ngay sau đó bình cầu được đậy kín và đặt trong điều kiệntránh ánh sáng để ngăn cản quá trình ôxy hoá Sau 24 h, lọc dung dịch bằng phễulọc hút chân không, rửa tinh thể G-AA bằng ete dầu (300C -600C) cho đến khidịch rửa không còn mầu Sấy sản phẩm trong 24 h ở nhiệt độ phòng trong tủ sấychân không rồi cân bằng cân phân tích Các sản phẩm sau đó được xác định độtinh sạch bằng phương pháp quang phổ tử ngoại ở bước sóng 365 nm

Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát một số yếu tố có thể ảnh hưởngđến quá trình kết tinh G-AA như: nhiệt độ kết tinh (nhiệt độ phòng và 4ºC), tỷ lệDEE/acetic acid và nồng độ của cao chiết DEE (thể tích DEE được dùng để kếttinh) Mỗi điều kiện kết tinh đều được lặp lại 3 lần để lấy kết quả là giá trị trungbình và sai số tương ứng Phân tích số liệu sử dụng tiêu chuẩn t-test của Student.Giá trị P<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê

2.2.3.3 Xác định độ tinh khiết của gossypol acetic acid

Sản phẩm G-AA trong quá trình nghiên cứu tinh chế gossypol bằng phươngpháp kết tinh được được xác định độ tinh khiết bằng quang phổ tử ngoại dựa theophương pháp được xây dựng bởi Guangfeng Jia và cộng sự [21]

- Xây dựng đường chuẩn: 50 mg G-AA đối chiếu được đưa vào bình định

mức 100 ml và định mức đến 100 ml bằng chloroform để thu được dung dịch gốcvới nồng độ 0,5 mg/ml (m/v) Tiếp theo, lấy 50, 100, 150, 200, 250 µl dung dịchgốc ở trên bằng micropipette đưa vào bình định mức 5 ml và định mức lần lượtthành các dung dịch có nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 µg/ml bằng chloroform Cácdung dịch chuẩn thu được sau đó được đo cường độ hấp thụ ở bước sóng 365 nm

Trang 28

trên máy quang phổ UV-Visible Spectrophotometer Cary 1E (Varian), đo lặp lại

3 lần Qua đó, chúng tôi xây dựng được đường chuẩn có phương trình là: y =0,0403x + 0,0395 (R2=0,0085) với x là nồng độ G-AA (µg/ml), y là cường độhấp thụ ở bước sóng 365 nm

- Đánh giá độ tinh khiết của mẫu: Độ khiết của sản phẩm G-AA thu được

trong quá trình kết tinh từ cao DEE được xác định bằng phương pháp UV dựatheo phương trình đường chuẩn được xây dựng ở trên Dung dịch mẫu thử đượcchuẩn bị ở nồng độ vào khoảng 15 µg/ml G-AA trong CHCl3 Đo độ hấp thụ ởbước sóng 365 nm Độ tinh sạch của sản phẩm G-AA được tính là tỷ lệ giữanồng độ của G-AA tinh khiết khi được xác định theo đường chuẩn và nồng độcủa mẫu thử

Hình 2.1 Đường chuẩn G-AA bằng phương pháp UV

2.2.3.4 Tinh sạch sản phẩm G-AA

Sản phẩm G-AA thô kết tinh từ cao DEE được tinh chế lại để làm tăng độtinh khiết G-AA thô được hoà trong DEE (tỷ lệ 1 : 7, w/v), lọc qua phễu lọc hútchân không và sau đó acetic acid băng (1/3 thể tích DEE) được thêm vào Dungdịch này sau đó được đậy kín, tránh ánh sáng ở điều kiện nhiệt độ phòng Sau 6

h, sản phẩm G-AA thu được bằng cách lọc qua phễu lọc hút chân không, rửabằng ete dầu (30-60ºC) cho đến khi dịch ete dầu không mầu Sản phẩm được sấytrong máy sấy chân không 24 h ở nhiệt độ phòng

Trang 29

Quá trình kết tinh này được lặp lại 3 lần Trong các lần kết tinh thứ 2 và thứ

3, công đoạn lọc đầu tiên có thể được bỏ qua.Sản phẩm cuối cùng được xác địnhđiểm chảy, phổ tử ngoại, MS và kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC

2.2.4 Xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào cácphương pháp phổ kết hợp Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng hợp chất màngười ta sử dụng những phương pháp cụ thể Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầuphối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác địnhchính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta còn phải dựa vào cácphương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với các phươngpháp sắc ký so sánh Ở đây, gossypol và các đồng phân hoặc dẫn xuất của nó đều

đã biết nên có thể dễ dàng so sánh với các dữ liệu đã công bố Cấu trúc hoá họccủa gossypol và các đồng phân hoặc dẫn xuất của nó được xác định bằng cácphương pháp phân tích hiện đại như: Máy đo điểm chảy, máy đo phổ tử ngoại,máy đo phổ hồng ngoại, máy đo phổ khối lượng, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân

1H, và 13C, máy đo độ quay cực, máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và so sánh với

dữ liệu đã công bố

2.2.5 Tách đồng phân quang học từ hỗn hợp racemic

Tách hai đồng phân này bằng phương pháp tạo dẫn xuất với amine bất đốiL-phenylalaninol dựa theo phương pháp đã được mô tả bởi Sampatk D S [53]

2.2.5.1 Điều chế bazơ Schiff gossypol-L-phenylalaninol dienamine

(±)-G-AA (0,406 g; 0,70 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml.Thêm vào đó lần lượt 6 ml acetonitrile và L-phenylalaninol (0,233 g, 1,54mmol) Hỗn hợp này được khuấy ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tránh ánhsáng và trong môi trường khí nitơ Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc kýlớp mỏng với hệ dung môi khai triển n-hexane/EtOAc = 7/3 Sau khi phản ứngkết thúc (gossypol phản ứng hết), hỗn hợp này được chuyển vào bình chiết quả lê

và thêm vào đó 50 ml nước cất và chiết bằng 50 ml DCM Quá trình chiết này

Trang 30

được lặp lại 3 lần Gộp các dịch chiết DCM rồi làm khan bằng Na2SO4 khan Lọc

bỏ Na2SO4 qua giấy lọc, phần dịch chiết DCM sau đó được cất loại dung môibằng máy cất quay dưới áp suất giảm thu được sản phẩm là hỗn hợp hai đồng

phân diastereomer bazơ Schiff của gossypol.

2.2.5.2 Phân tách (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và phenylalaninol dienamine

(+)-gossypol-L-Hỗn hợp đồng phân diastereomer (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine

và (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được phân tách trên cột sắc ký sửdụng chất hấp phụ silica gel pha thường cỡ hạt 0,04-0,063 mm Hệ dung môi rửagiải là hỗn hợp n-hexan/EtOAc có độ phân cực tăng dần (100/0 – 40/60)

Quá trình được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn

GF254 (Merck) với hệ dung môi khai triển là n-hexane/ethyl acetate = 5/5, soi bảnmỏng trên máy soi UV (CAMAG) tại bước sóng 254 nm Các phân đoạn có cácvết có Rf giống nhau được gộp lại và thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Cácphân đoạn chứa chất tinh sạch (1 vết trên SKLM) được đem kiểm tra sơ bộ cấutrúc bằng phương pháp phổ khối lượng và đo độ quay cực

2.2.5.3 Điều chế (-)-gossypol và (+)-gossypol

(-)-Gossypol-L-phenylalaninol dienamine (0,315 g; 0,40 mmol) được đưavào bình cầu dung tích 25 ml Thêm vào đó lần lượt 15 ml DEE, 3 ml acetic acid

và 0,5 ml HCl đặc (37%) Hỗn hợp này được đun hồi lưu trong điều kiện tránhánh sáng và trong môi trường khí nitơ Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc

ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển là n-hexan/EtOAc = 5/5 Sau khi phảnứng kết thúc (chất đầu phản ứng hết), hỗn hợp này được làm nguội về nhiệt độphòng, chuyển vào bình chiết quả lê và chiết loại tạp chất bằng nước cất Quátrình chiết này được lặp lại 3 lần (cho đến khi pH = 7) Pha nước sau đó đượcgộp và chiết lại bằng DEE Các phân đoạn DEE được gộp lại và làm khan bằng

Na2SO4 khan, cất loại dung môi bằng máy cất quay dưới áp suất giảm Sản phẩmthô chứa (-)-gossypol được tinh chế bằng sắc ký cột

Trang 31

Sử dụng sắc ký cột để tinh chế (-)-gossypol, chất hấp phụ là silica gel phathường (cỡ hạt 0,04-0,063 mm) với khối lượng silica gel sử dụng gấp 30 lần khốilượng mẫu cần tinh chế Sử dụng hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp n-hexan/EtOAc/acetic acid có độ phân cực tăng dần (100/0/1 – 80/20/1).

Quá trình chạy cột được theo dõi bằng SKLM với bản mỏng tráng sẵn GF254

(Merck), khai triển bằng hệ dung môi: n-hexan/EtOAc/acetic acid = 9/1/0,4, hiệnmàu bằng dung dịch H2SO4 20% trong EtOH sau đó đốt trên bếp điện

Các phân đoạn chứa (-)-gossypol sạch (1 vết trên SKLM) được gộp lại, thuhồi dung môi dưới áp suất giảm và có thể kết tinh lại dưới dạng G-AA trong hỗnhợp DEE/acetic acid băng Sản phẩm (-)-gossypol hoặc sản phẩm (-)-G-AA saukhi kết tinh được sấy trong tủ sấy chân không 24 h và bảo quản ở nhiệt độ -18ºC Quá trình điều chế (+)-gossypol từ (+)-gossypol-L-phenylalaninoldienamine được tiến hành tương tự như với (-)-gossypol

Sản phẩm (+)-gossypol, (-)-gossypol đã qua tinh chế được khẳng định cấutrúc bằng phương pháp phổ tử ngoại, MNR, phổ khối, xác định góc quay cực,điểm chảy, xác định độ tinh sạch bằng HPLC

2.2.6 Phương pháp HPLC đánh giá độ tinh sạch của sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol

Các mẫu (±)-gossypol, (-)-gossypol, (+)-gossypol được hòa tan trong dungmôi acetonitrile, lọc qua màng lọc 0,45µM, hòa loàng đến nồng độ thích hợp sau

đó được chuyển vào trong máy phân tích HPLC

Điều kiện phân tích HPLC như sau: Máy sắc ký lỏng cao áp của hãngAgilent 1200 (Mỹ), cột sắc ký Inertsil ODS-3 (C18), cỡ hạt 5 µm (Nhật), kíchthước cột 4,6 x 250 mm Quá trình dò được thực hiện bằng detector UV khoảngbước sóng 220-500 nm Pha động là hỗn hợp 85/15 của acetonitrile và đệmphosphate pH = 3 (10 mM KH2PO4, sau đó chỉnh về pH = 3 bằng H3PO4 đậm

Trang 32

đặc) Tốc độ dòng được điều chỉnh ở 1 ml/phút Thời gian chạy là 12 phút Quátrình sắc ký được theo dõi bằng phổ tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm.

2.2.7 Xác định tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong hạt bông

Tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong hạt bông được xác định dựa theo phươngpháp của Stipanovic và cộng sự [52]

Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo bazơ Schiff là dẫn xuất củagossypol trong hạt bông với amin bậc 1 bất đối là (R)-(-)-2-amino-1-propanol(D-alaninol) Sản phẩm phản ứng là các bazơ Schiff, là các đồng phân

diastereomer có thể phân tách trên HPLC, trong khi các đồng phân quang học là

(-)-gossypol và (+)-gossypol không thể tách ra khỏi nhau trên HPLC trong cùng

điều kiện Dựa theo tỷ lệ diện tích pic của 2 đồng phân diastereomer là

(-)-gossypol–(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol trênHPLC có thể xác định được tỷ lệ của (+)-gossypol và (-)-gossypol tương ứng

- Chuẩn bị hỗn hợp thuốc thử (R)-(-)-2-amino-1-propanol

Dùng pipet lấy chính xác 2 ml (R)-(-)-2-amino-1-propanol (Sigma-Aldrich,tinh khiết 98%, d = 0,963 g/ml) vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml aceticacid băng, dùng acetonitrile định mức đến 100 ml Thuốc thử được bảo quảntrong bình tối mầu ở 4ºC và được đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

- Chuẩn bị mẫu (-)-gossypol-(R)-(-)-2-amino-1-propanol và (R)-(-)-2-amino-1-propanol đối chiếu:

(+)-gossypol-(-)-Gossypol và (+)-gossypol đã tinh sạch bằng phương pháp trên được sửdụng làm chất đối chiếu Cân khoảng 1 mg (-)-gossypol vào ống nghiệm loại 10

ml Thêm vào đó 5 ml hỗn hợp thuốc thử (R)-2-amino-1-propanol đã được chuẩn

bị ở trên vào ống nghiệm chứa (-)-gossypol Các ống nghiệm này sau đó được bịtkín bằng nút nhựa, lắc đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 70ºC trong 30 phút Sau khilàm nguội về nhiệt độ phòng, hỗn hợp này được lọc qua màng lọc 0,45 µM, phaloãng đến nồng độ khoảng 10-15 µg/ml trước khi phân tích bằng HPLC Tiến

Trang 33

hành tương tự với (+)-gossypol để tạo dẫn xuất propanol Căn cứ vào thời gian lưu và phổ tử ngoại của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol để xác định vị trí pictương ứng của chúng trong mẫu hạt trên HPLC.

(+)-gossypol-(R)-2-amino-1-Chuẩn bị tương tự đối với mẫu đối chiếu là hỗn hợp (±)-gossypol ([α]D ≈

00) để xác định tỷ lệ diện tích pic của các đồng phân diastereomer (-)-gossypol–

(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol trên HPLC

- Chuẩn bị mẫu hạt bông để phân tích HPLC: Hạt bông của các giống

nghiên cứu được tách loại vỏ, phần nhân được nghiền thành bột đồng nhất bằngchày và cối sứ Cân khoảng 2-3 mg bột nhân hạt bông vào ống nghiệm 5 ml,thêm vào đó 2 ml hỗn hợp thuốc thử (R)-2-amino-1-propanol Các ống nghiệmnày sau đó được bịt kín bằng nút nhựa và ủ trong bể ổn nhiệt trong vòng 30 phút

ở 70ºC Hỗn hợp sau đó được vortex và ly tâm Phần dịch trong được lọc quamàng lọc 0,45 µm, hòa loãng đến nồng độ thích hợp bằng acetonitrile và được

chuyển sang phân tích trên máy HPLC với điều kiện chạy theo mục 2.2.6.

2.2.8 Độc tính tế bào của gossypol

2.2.8.1 Nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7 được nuôi cấy trong trong môi trườngRothwell Park Memorial Institue 1640 (RPMI 1640) có bổ xung thêm 10% huyếtthanh phôi bò (Foetal Bovine serum, FBS) và 2 mM L-glutamine Dòng tế bàoLU-1 được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s (DMEM) có

bổ xung thêm 10% FBS 2 mM L-glutamine Các dòng tế bào này được nuôi cấy

ở 37ºC, 5% CO2, độ ẩm 98% trong điều kiện vô trùng tuyệt đối Tế bào phát triển

ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính

2.2.8.2 Phương pháp MTT

Độc tính tế bào của gossypol và các đồng phân quang học của nó trên cácdòng tế bào ung thư được xác định bằng phương pháp MTT (MTT assay)

Trang 34

Phương pháp MTT được tiến hành dựa trên phản ứng khử của MTT Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, một tetrazole) có mầuvàng thành formazan có mầu tím trong ty thể của tế bào sống Phản ứng khử nàychỉ xảy ra chỉ khi các enzyme reductase trong ty thể hoạt động và do đó sự thayđổi này liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống Khi so sánh lượng formazanmầu tím được tạo thành từ các tế bào đã được xử lý với một chất thử với lượngformazan tạo thành từ các tế bào đối chứng không được xử lý thì có thể suy ra tácđộng gây chết tế bào của chất thử thông qua việc xây dựng một đường cong phụthuộc theo liều dùng [48].

(3-(4,5-Cấy 200 µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗigiếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 với dòng Hep-G2 và MCF-7,môi trường DMEM với các mẫu thử trên dòng LU-1 Các tế bào được nuôi ổnđịnh sau 24 h ở 370C, 5% CO2 Các mẫu thử: gossypol racemic, (+)-gossypol, (-)-gossypol và mẫu đối chứng dương là vincristine được pha trong DMSO Pha loãngcác mẫu thử tạo thành dãy các nồng độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy tươngứng Các dung dịch mẫu thử sau đó được thêm dung dịch tế bào sao cho nồng độpha loãng cuối cùng đạt 0,5; 1; 5; 10; 20; 30 µM với (±)-gossypol và (-)-gossypol;nồng độ đạt 0,5; 1; 5; 10; 20; 30; 40; 60 µM với (+)-gossypol và nồng độ đạt 0,5;5; 50; 500 nM với vincristine Mẫu đối chứng không được bổ xung thuốc thử Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Các tế bào được ủ ở 370C, 5% CO2. Sau 72 h,môi trường nuôi cấy tế bào được loại bỏ và thêm vào mỗi giếng 50 µl MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) Sau khi ủ ở 370C trong 4giờ, dung dịch MTT được loại bỏ và thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO Lắc đều,đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào được tính theo công thức:

% ức chế = (OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm ức chế sự pháttriển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

Trang 35

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập gossypol từ hạt bông

3.1.1 Chiết xuất gossypol từ hạt bông

Hạt bông Gossypium barbadense L., giống HD139, được nghiền bằng máy

xay và rây ở các cỡ lần lượt 1 mm và 0,2 mm để tách phần nhân hạt ra khỏi phần

vỏ và xơ bông Sau quá trình này chúng tôi thu được nhân hạt bông dưới dạngbột mầu trắng xám (độ ẩm 7,9%) với các tuyến chất mầu có thể quan sát đượcbằng mắt thường Khối lượng nhân thu được bằng 62,6% tổng khối lượng hạt

100 g nhân hạt bông HD139 được chiết trong 300 ml ete dầu (nhiệt độ sôi

300C-600C) ở nhiệt độ 60ºC trên bếp cách thủy bằng máy soxhlet cho đến khidịch chiết ete dầu trở nên không mầu Điều này đạt được sau khoảng 24 h chiết.Cuối giai đoạn này, bột hạt bông được lấy ra, làm khô trong tủ sấy chân không ởnhiệt độ phòng Dịch chiết ete dầu được thu hồi để lấy dung môi trên máy cấtquay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40ºC đến tối đa, thu được 23,5 g dầu mầu nâu.Bột nhân hạt bông sau khi đã được chiết loại dầu được tiếp tục chiết bằng 300 mlDEE ở nhiệt độ 40ºC trong 24 h trên máy soxhlet Dịch chiết DEE được lọc, thuhồi dung môi trên máy cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ phòng, thu được2,07 g cao chiết DEE mầu nâu

Cao chiết DEE được định tính sự có mặt của gossypol bằng phương phápphổ tử ngoại và SKLM Kết quả cho thấy, phổ tử ngoại của phần cao chiết DEE

có hình dạng và cực đại hấp thụ tại 368 nm, phù hợp với hình dạng và cực đạihấp thụ của gossypol đã được công bố trước đó (365 nm) [17] Mặt khác, kết quảSKLM cao chiết DEE hệ dung môi: n-hexan/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4cho 4 vết chính trong đó chỉ 1 vết (Rf=0,67) có mầu đỏ với thuốc thử H2SO4 20%trong EtOH và mầu xanh đậm với thuốc thử là FeCl3 Từ kết quả trên chúng tôibước đầu khẳng định rằng trong dịch chiết DEE có chứa gossypol với Rf = 0,67

Trang 36

Ete dầu (300C-600C) là một dung mụi kộm phõn cực, do đú được dựng đểloại cỏc tạp chất kộm phõn cực trong nhõn hạt bụng trong đú chủ yếu là dầu bộo

đó được xỏc định là chiếm khoảng từ 13-24% trong nhõn hạt bụng Để chứngminh gossypol khụng bị mất đi trong quỏ trỡnh loại tạp bằng ete dầu, chỳng tụitiến hành định tớnh gossypol trong phần dịch chiết ete dầu bằng phổ tử ngoại (đotrong CHCl3) Phổ tử ngoại của dịch chiết ete dầu khụng thấy đỉnh hấp thụ cựcđại ở bước súng 365 nm hay ở cỏc bước súng lõn cận (đỉnh đặc trưng cho nhúm-CHO của gossypol) Điều này đó khẳng định tớnh đỳng đắn khi lựa chọn ete dầu

để loại tạp chất

Cao DEE sau đú được tỏch lấy gossypol bằng sắc ký cột hoặc bằng kết tinh

Sơ đồ quy trỡnh chiết xuất và tinh chế gossypol được trỡnh bày trong hỡnh 3.1

Hạt bông Gossypium barbadense

Nghiền nhỏ Rây 1 mm rồi 0,2 mm Bột nội nhũ hạt bông

Bảo quản ở nhiệt độ thấp -18°C Loại dầu bằng chiết soxhlet dùng dung môi ete dầu Bột nội nhũ hạt bông đã loại dầu

Dầu hạt bông

Chiết bằng diethyl ether (soxhlet) Cất loại dung môi d ới áp suất giảm Cao chiết diethyl ether

+ Et2O + Acetic acid glacial Lọc, rửa bằng ete dầu

Gossypol acetic acid

Trang 37

3.1.2 Tinh chế gossypol bằng sắc ký cột silica gel

Từ kết quả định tính gossypol trong cao chiết DEE bằng sắc ký bản mỏng

(mục 3.1.1) cho thấy gossypol cho một vết đậm ở Rf = 0,67 và có sự phân táchvới vết lân cận Rf = 0,72 do đó chúng tôi nhận thấy có thể tinh chế gossypol bằngsắc ký cột silica gel để bước đầu xác định cấu trúc và dùng làm chất đối chiếucho các thử nghiệm về sau

Hình 3.2 Sắc ký đồ cao DEE (a) và gossypol tinh sạch R f = 0,67 (b) phân lập từ hạt

bông G barbadense L HD139 Bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck), hệ dung môi : hexan/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4, hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 20%

n-Do gossypol có các nhóm –OH phenol có khả năng tạo thành các liên kếthydro với các nhóm –OH trên chất hấp phụ silica gel gây ra hiện tượng gossypolkéo dài trên cột trong quá trình rửa giải Để tránh hiện tượng này, dung môi rửagiải đã được thêm vào một lượng nhỏ acetic acid (1%), vừa có tác dụng tránh sựkéo dài của gossypol trên cột, vừa có thể có tác dụng làm bền gossypol

Từ 2,07 g cao chiết DEE của hạt bông HD139 khi tiến hành sắc ký qua cộtsillica gel (60 g silica gel), hệ dung môi rửa giải được sử dụng là n-hexan/ethylacetate/acetic acid với độ phân cực tăng dần: 100/0/1-80/20/1, cuối cùng chúng

Trang 38

AA bằng cách hoà tan lại trong 5 ml DEE sau đó thêm 1,7 ml acetic acid băng.Sau 24 h, sản phẩm kết tinh được lọc bằng phễu lọc hút chân không, rửa bằng 3 x

5 ml ete dầu, sấy khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 250C trong 24 h thuđược 0,45 g chất rắn mầu vàng là G-AA Các số liệu về điểm chảy, phổ UV, IR

và phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm thu được trùng với các dữ liệu đãcông bố của G-AA [21]

Hình 3.3 Phổ tử ngoại của G-AA từ hạt bông G barbadense L.

G-AA có 3 đỉnh hấp thụ cực đại ở 242, 288 và 364 nm (đo trong CHCl3)

ppm (Phụ lục 2)

13C NMR: δ = 199,4 (-CHO); 175,2; 156,2; 150,4; 143,6; 134,1; 133,7; 129,8;

Ngày đăng: 05/08/2014, 22:47

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo Loại Chi tiết
1. Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam
Tác giả: Võ Văn Chi
Nhà XB: Nhà xuất bản giáodục
Năm: 2007
2. Nguyễn Bá Đức (2003), Hóa chất điều trị bệnh ung thư. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Hóa chất điều trị bệnh ung thư
Tác giả: Nguyễn Bá Đức
Nhà XB: Nhà xuất bản Yhọc
Năm: 2003
3. Nguyễn Đăng Quân, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2002),“Khảo sát hoạt tính kháng phân bào của hoạt chất gossypol và plumbagin trên dòng tế bào ung thư bằng một số phương pháp thử nghiệm”, Tạp Chí Sinh Học, 24 (4), tr. 43-47 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Khảo sát hoạt tính kháng phân bào của hoạt chất gossypol và plumbagintrên dòng tế bào ung thư bằng một số phương pháp thử nghiệm”, "Tạp ChíSinh Học
Tác giả: Nguyễn Đăng Quân, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương
Năm: 2002
4. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1. Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.TIẾNG ANH Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật
Tác giả: Viện Dược liệu
Nhà XB: Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật"
Năm: 2006
5. Adams M. J., Cory S. (2007), “Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential”, Curr. Opin. Immunol., 19, pp. 448-496 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism andtherapeutic potential”, "Curr. Opin. Immunol
Tác giả: Adams M. J., Cory S
Năm: 2007
7. Benz C.C, Keniry M.A., Ford J. M, Townsend A. J., Cox S. W, Palayoor S., Matlin S. A., Hait W.N (1990), “Biochemical corrlerates of anti tumor and antimitochrondrial properties of gossypol enantiomer”, Mol.Pharmacol., 37, pp. 840- 847 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Biochemical corrlerates of anti tumorand antimitochrondrial properties of gossypol enantiomer”, "Mol."Pharmacol
Tác giả: Benz C.C, Keniry M.A., Ford J. M, Townsend A. J., Cox S. W, Palayoor S., Matlin S. A., Hait W.N
Năm: 1990
8. Brycki B., Brzezinski B., Marciniak B., and Paszyc S. (1991), “1H and 13C NMR Studies of Tetrabutylammonium Salts of Gossypol in Chloroform Solution”, Spectrosc. Lett., 24, pp. 509–518 (1991) Sách, tạp chí
Tiêu đề: 1H and13C NMR Studies of Tetrabutylammonium Salts of Gossypol inChloroform Solution”, "Spectrosc. Lett., 24
Tác giả: Brycki B., Brzezinski B., Marciniak B., and Paszyc S
Năm: 1991
9. Carruth, F. E. (1918), “Contribution to the Chemistry of Gossypol, the Toxic Principle of Cottonseed”, JAOCS, 40, pp. 647-663 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Contribution to the Chemistry of Gossypol, theToxic Principle of Cottonseed”, "JAOCS
Tác giả: Carruth, F. E
Năm: 1918
10. Cass B. Q., Bassi L. A., Matlin A. S. (1999), “First direct resolution of gossypol enantiomers on a chiral high-performance liquid chromatography phase”, Chirality, 11, pp. 46-49 Sách, tạp chí
Tiêu đề: First direct resolution ofgossypol enantiomers on a chiral high-performance liquidchromatography phase”, "Chirality
Tác giả: Cass B. Q., Bassi L. A., Matlin A. S
Năm: 1999
11. Cass B. Q., Tiritan E., Matlin A. S. Preire C. E. (1991), “Gossypol enantiomer Ratios in cotton seeds", Phytochem., 30 (8), pp. 2655-2657 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Gossypolenantiomer Ratios in cotton seeds
Tác giả: Cass B. Q., Tiritan E., Matlin A. S. Preire C. E
Năm: 1991
12. Cass B. Q, Oliveira V. R., De Pietro C. A. (2004), “Determination of gossypol enantiomer ratio in cotton plants by chiral highperformance liquid chromatography”, J. Agric. Food Chem., 52, pp. 5822-5827 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Determination ofgossypol enantiomer ratio in cotton plants by chiral highperformanceliquid chromatography”, "J. Agric. Food Chem
Tác giả: Cass B. Q, Oliveira V. R., De Pietro C. A
Năm: 2004
13. Chang J. S., Hsu Y. L., Kuo P. L., Chiang L. C., and Lin C. C. (2004).“Upregulation of Fas/Fas ligand-mediated apoptosis by gossypol in an immortalized human alveolar lung cancer cell line”, Clin. Exp.Pharmacol. Physiol., 31, 716–722 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Upregulation of Fas/Fas ligand-mediated apoptosis by gossypol in animmortalized human alveolar lung cancer cell line”, "Clin. Exp."Pharmacol. Physiol
Tác giả: Chang J. S., Hsu Y. L., Kuo P. L., Chiang L. C., and Lin C. C
Năm: 2004
14. Coutinho E. M. (2002), “Gossypol: A contraceptive for men”, Contraception, 65, pp. 259-263 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Gossypol: A contraceptive for men”,"Contraception
Tác giả: Coutinho E. M
Năm: 2002
15. Dowd K. M. (2003), “Preparation of Enantiomeric Gossypol by Crystallization”, Chirality, 15, pp. 486-493 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Preparation of Enantiomeric Gossypol byCrystallization”, "Chirality
Tác giả: Dowd K. M
Năm: 2003
16. Dowd K. M., Pelitire M. S. (2001), “Recovery of G-AA from cottonseed soapstock”, Ind. Crops Prod., 14, pp. 113–123 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Recovery of G-AA from cottonseedsoapstock”, "Ind. Crops Prod
Tác giả: Dowd K. M., Pelitire M. S
Năm: 2001
17. Ergun A. M., Konac E., Erbas D., Ekmekci A. (2004), “Apoptosis and nitric oxide release induced by thalidomide, gossypol and dexamethasone in cultured human chronic myelogenous leukemic K-562 cells”, Cell Biol.Internat., 28, pp. 237-242 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Apoptosis andnitric oxide release induced by thalidomide, gossypol and dexamethasonein cultured human chronic myelogenous leukemic K-562 cells”, "Cell Biol."Internat
Tác giả: Ergun A. M., Konac E., Erbas D., Ekmekci A
Năm: 2004
18. Fan X. H., Wang X., Chen F., Galler D. P., Wan P. J. (2008), “Engine performance test of cottonseed oil biodiesel”, Open Energy Fuels J. , 1, pp. 40-45 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Engineperformance test of cottonseed oil biodiesel”, "Open Energy Fuels J
Tác giả: Fan X. H., Wang X., Chen F., Galler D. P., Wan P. J
Năm: 2008
19. Flack M. R. , Pyle R. G. , Mullen N. M. , Lorenzo B., Wu Y. W. , Knazek R. A., Nisula B. C. , Reidenberg M. M.(1993), “Oral gossypol in the treatment of metastatic adrenal cancer”. J. Clin. Endocrinol. Metab.,, 76(4), pp. 1019-1024 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Oral gossypol in thetreatment of metastatic adrenal cancer”. "J. Clin. Endocrinol. Metab
Tác giả: Flack M. R. , Pyle R. G. , Mullen N. M. , Lorenzo B., Wu Y. W. , Knazek R. A., Nisula B. C. , Reidenberg M. M
Năm: 1993
20. Gerez de Burgos N. M., Burgos C., Montamat E. E., Rovai L. E., and Blanco, A. (1984), “Inhibition by gossypol of oxidoreductases from Trypanosoma cruzi”. Biochem. Pharmacol., 33, pp. 955–959 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Inhibition by gossypol of oxidoreductases from"Trypanosoma cruzi"”. "Biochem. Pharmacol
Tác giả: Gerez de Burgos N. M., Burgos C., Montamat E. E., Rovai L. E., and Blanco, A
Năm: 1984
21. Guangfeng Jia Yonghua Zhan , Daocheng Wu, Yang Meng, Liang Xu (2009), “An Improved Ultrasound-Assisted Extraction Process of G-AA From Cottonseed Soapstock”, AIChE Journal, 55 (3), pp. 797-806 Sách, tạp chí
Tiêu đề: An Improved Ultrasound-Assisted Extraction Process of G-AAFrom Cottonseed Soapstock”, "AIChE Journal
Tác giả: Guangfeng Jia Yonghua Zhan , Daocheng Wu, Yang Meng, Liang Xu
Năm: 2009

HÌNH ẢNH LIÊN QUAN

Hỡnh 1.1. Bụng hải đảo (Gossypium barbadense L.) - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 1.1. Bụng hải đảo (Gossypium barbadense L.) (Trang 3)
Hỡnh 1.2. Lỏt cắt ngang của hạt bụng với cỏc tuyến chất mầu - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 1.2. Lỏt cắt ngang của hạt bụng với cỏc tuyến chất mầu (Trang 5)
Hỡnh 1.4. Cỏc dạng đồng phừn quang học của gossypol - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 1.4. Cỏc dạng đồng phừn quang học của gossypol (Trang 7)
Hỡnh 1.3. Cấu tạo của gossypol - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 1.3. Cấu tạo của gossypol (Trang 7)
Hỡnh 1.5. Cỏc dạng đồng phừn tautomer của gossypol - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 1.5. Cỏc dạng đồng phừn tautomer của gossypol (Trang 8)
Hỡnh 1.6. Apoptosis thụng qua con đường ty thể [35] - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 1.6. Apoptosis thụng qua con đường ty thể [35] (Trang 20)
Hỡnh 2.1. Đường chuẩn G-AA bằng phương phỏp UV - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 2.1. Đường chuẩn G-AA bằng phương phỏp UV (Trang 28)
Sơ đồ quy trỡnh chiết xuất và tinh chế gossypol được trỡnh bày trong hỡnh 3.1. - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
Sơ đồ quy trỡnh chiết xuất và tinh chế gossypol được trỡnh bày trong hỡnh 3.1 (Trang 36)
Hỡnh 3.2. Sắc ký đồ cao DEE (a) và gossypol tinh sạch R f  = 0,67 (b) phừn lập từ hạt bụng G - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.2. Sắc ký đồ cao DEE (a) và gossypol tinh sạch R f = 0,67 (b) phừn lập từ hạt bụng G (Trang 37)
Hỡnh 3.3. Phổ tử ngoại của G-AA từ hạt bụng G. barbadense L. - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.3. Phổ tử ngoại của G-AA từ hạt bụng G. barbadense L (Trang 38)
Hỡnh 3.4. Sắc ký đồ HPLC của G-AA tinh chế bằng sắc ký cột và kết tinh lại trong DEE/acetic acid băng - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.4. Sắc ký đồ HPLC của G-AA tinh chế bằng sắc ký cột và kết tinh lại trong DEE/acetic acid băng (Trang 39)
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quỏ trỡnh kết tinh G-AA Thụng số 6 ml DEE/2 ml acetic acid băng - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quỏ trỡnh kết tinh G-AA Thụng số 6 ml DEE/2 ml acetic acid băng (Trang 41)
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thể tớch DEE và tỷ lệ acetic acid băng/DEE đến quỏ trỡnh kết tinh G-AA - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thể tớch DEE và tỷ lệ acetic acid băng/DEE đến quỏ trỡnh kết tinh G-AA (Trang 42)
Hỡnh 3.5. Sơ đồ tỏch đồng phừn quang học (+)- và (-)-gossypol từ (±)-gossypol - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.5. Sơ đồ tỏch đồng phừn quang học (+)- và (-)-gossypol từ (±)-gossypol (Trang 45)
Hỡnh 3.6. Phản ứng tổng hợp (±)-gossypol-L-phenylananinol dienamine - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.6. Phản ứng tổng hợp (±)-gossypol-L-phenylananinol dienamine (Trang 46)
Hỡnh 3.8. Sắc ký đồ HPLC của (-)-gossypol. (-)-Gossypol cú thời gian lưu - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.8. Sắc ký đồ HPLC của (-)-gossypol. (-)-Gossypol cú thời gian lưu (Trang 51)
Hỡnh 3.11. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.11. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol (Trang 53)
Hỡnh 3.12. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.12. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol (Trang 54)
Hỡnh 3.13. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (±)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.13. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (±)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol (Trang 57)
Bảng 3.3. Tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong một số giống bụng ở Việt Nam Loài Giống Tỷ lệ nhừn/hạt (%) (-)-Gossypol/(+)-Gossypol - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
Bảng 3.3. Tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong một số giống bụng ở Việt Nam Loài Giống Tỷ lệ nhừn/hạt (%) (-)-Gossypol/(+)-Gossypol (Trang 57)
Hỡnh 3.14. Sắc ký đồ HPLC xỏc định tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt bụng HD208 và VN01-2 - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.14. Sắc ký đồ HPLC xỏc định tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt bụng HD208 và VN01-2 (Trang 58)
Hỡnh 3.16. Tế bào MCF-7 khi khụng xử lý (đối chứng) và xử lý với (-)-gossypol ở cỏc nồng độ 10 àM, 20 àM, 30 àM sau 72 h - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.16. Tế bào MCF-7 khi khụng xử lý (đối chứng) và xử lý với (-)-gossypol ở cỏc nồng độ 10 àM, 20 àM, 30 àM sau 72 h (Trang 60)
Hỡnh 3.17. Tỏc dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trờn dũng tế bào LU-1 sau 72 h. - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.17. Tỏc dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trờn dũng tế bào LU-1 sau 72 h (Trang 61)
Hỡnh 3.19. Tỏc dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trờn dũng tế bào Hep-G2 sau 72 h. - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.19. Tỏc dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trờn dũng tế bào Hep-G2 sau 72 h (Trang 62)
Hỡnh 3.20. Sự phỏt triển của tế bào Hep-G2 khi khụng xử lý (đối chứng) và xử lý với (±)-gossypol, (-)-gossypol, (+)-gossypol tại nồng độ 10 àM sau 72 h - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
nh 3.20. Sự phỏt triển của tế bào Hep-G2 khi khụng xử lý (đối chứng) và xử lý với (±)-gossypol, (-)-gossypol, (+)-gossypol tại nồng độ 10 àM sau 72 h (Trang 63)
Bảng 3.4.  Giỏ trị IC 50  của (±)-, (+)- và (-)-gossypol trờn cỏc dũng tế bào ung thư người - NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH GOSSYPOL từ cây BÔNG vải
Bảng 3.4. Giỏ trị IC 50 của (±)-, (+)- và (-)-gossypol trờn cỏc dũng tế bào ung thư người (Trang 63)

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TRÍCH ĐOẠN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w