Nghiên cứu chiết xuất diosgenin từ nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn

ĐẶT VẤN ĐỀDiosgenin là nguyên liệu để tổng hợp các dẫn xuất steroid 23, 25. Tuy chất này có mặt trong nhiều họ thực vật, song chỉ có họ Dioscoreaceae (chi Dioscorea) thì mới có giá trị thực tế trong việc khai thác chiết xuất diosgenin 14.Tại Việt Nam, Nần vàng (Dioscorea collettii Hoof.f.) được đánh giá có triển vọng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin 10. Việc chiết xuất diosgenin từthân rễ Nần vàng trong các nghiên cứu trước đây được thực hiện bằng cách chiết với dung môi hữu cơ chloroform. Nhưng trong công nghiệp vấn đề phát sinh với kỹ thuậtnày là phải loại bỏ dung môi hữu cơ từ các sản phẩm cuối cùng, xử lý chất thải, độc tính của chloroform còn lẫn trong sản phẩm…. Do đó, phương pháp chiết diosgeninmột cách nhanh chóng, rẻ tiền và ít độc tính là một yêu cầu cấp thiết. Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn (Supercritical fluild extraction) có nhiều lợi thế hơn các phương pháp tách chiết dung môi lỏng truyền thống như: tính chọn lọc được cải thiện và thân thiện với môi trường. Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là một sự thay thế cần thiết cho việc sử dụng các dung môi hữu cơ thông thường.Đề tài “Nghiên cứu chiết xuất diosgenin từ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn” được thực hiện với những mục tiêu sau:1. Xây đựng được phương pháp định lượng diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng.2. Chiết xuất được diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạnvà khảo sát được ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT DIOSGENIN TỪ NẦN VÀNG BẰNG DUNG MÔI SIÊU TỚI HẠN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ VƯƠNG MINH VIỆT HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VƯƠNG MINH VIỆT NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT DIOSGENIN TỪ NẦN VÀNG BẰNG DUNG MÔI SIÊU TỚI HẠN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Văn Hân 2. DS. Nguyễn Thị Minh Hạnh Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Công Nghiệp Dược 2. Viện Công Nghệ Dược Phẩm HÀ NỘI - 2015 LỜI CÁM ƠN Khóa luận được thực hiện tại Bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc gia – Trường Đại học Dược Hà Nội. Trong thời gian nỗ lực nghiên cứu hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, ủng hộ, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè và gia đình. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy: TS. Nguyễn Văn Hân – giảng viên Bộ môn Công Nghiêp Dược – Trường Đại Học Dược Hà Nội đã hết lòng tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp tôi từng bước nâng cao nhận thức và phương pháp luận; động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. TS. Nguyễn Hoàng Tuấn – giảng viên bộ môn Dược Liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội đã chia sẻ, giải đáp những vướng mắc trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành khóa luận. Hà Nội, ngày 7 tháng 4 năm 2015 Sinh viên Vương Minh Việt MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn 2 1.1.1. Khái niệm 2 1.1.2. Thiết bị và nguyên tắc hoạt động 5 1.1.3. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn 7 1.1.4. Ứng dụng 7 1.2. Tổng quan về diosgenin 8 1.2.1. Công thức hóa học, tính chất lý hóa 8 1.2.2. Công dụng của diosgenin 9 1.3. Tổng quan về cây Nần vàng 9 1.3.1. Vị trí phân loại 9 1.3.2. Đặc điểm thực vật 9 1.3.3. Bộ phận dùng và phân bố 10 1.3.4. Thành phần hóa học. 10 1.3.5. Tác dụng sinh học 13 1.3.6. Công dụng 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị 16 2.1.1. Nguyên liệu 16 2.1.2. Hóa chất 16 2.1.3. Máy móc, thiết bị 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1. Phương pháp chiết xuất diosgenin 17 2.2.2. Phương pháp định lượng diosgenin. 18 2.2.3. Phương pháp tinh chế 20 2.3. Nội dung nghiên cứu 20 2.3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng 20 2.3.2. Xác định hàm lượng diosgenin trong thân rễ Nần vàng 21 2.3.3. Đánh giá ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. Thẩm định phương pháp định lượng diosgenin bằng TLC 24 3.1.1. Độ thích hợp hệ thống 24 3.1.2. Khoảng tuyến tính 25 3.1.3. Độ đúng của phương pháp 27 3.1.4. Độ chính xác của phương pháp 31 3.2. Xác định hàm lượng diosgenin trong thân rễ Nần vàng. 31 3.3. Đánh giá ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất 32 3.3.1. Đồng dung môi 32 3.3.2. Áp suất chiết xuất 34 3.3.3. Nhiệt độ chiết xuất 36 3.3.4. Thời gian chiết xuất 38 3.4. Tinh chế dịch chiết 39 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 41 4.1. Về khảo sát ảnh hưởng các thông số tới quá trình chiết xuất 41 4.2. Về quy trình tinh chế dịch chiết. 42 KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức. K c Điểm tới hạn. T c Nhiệt dộ tới hạn. P c Áp suất tới hạn. sCO 2 CO 2 siêu tới hạn HDL Lipoprotein tỷ trọng cao ( High Density Lipoproteins ) LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp ( Low Density Lipoproteins ) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) SD Độ lệch chuẩn RSD Độ lệch chuẩn tương đối DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Điểm tới hạn của một số dung môi 4 Bảng 1.2 So sánh các đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu tới hạn 4 Bảng 1.3 Các sapogenin trong thân rễ Nần vàng 11 Bảng 1.4 Các hợp chất saponin thu được từ dịch chiết ethanol của Nần vàng 12 Bảng 2.1 Tên, tiêu chuẩn và nguồn gốc của các hóa chất dùng trong thí nghiệm 16 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống 24 Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ tuyến tính 25 Bảng 3.3 Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn 27 Bảng 3.4 Độ thu hồi của phương pháp 28 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 31 Bảng 3.6 Hiệu suất chiết xuất diosgenin trong với các đồng dung môi khác nhau 33 Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng của áp suất chiết lên hiệu suất 32 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất 34 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian lên hiệu suất chiết 35 Bảng 3.10 Khối lượng diosgenin thu được và hiệu suất của quá trình tinh chế dịch chiết 40 DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Tên hình ảnh Trang Hình 1.1 Giản đồ pha của cacbon dioxyd. 2 Hình 1.2 Mặt phân chia giữa thể lỏng và thể khí của CO2 biến mất khi đạt đến điểm tới hạn. 3 Hình 1.3 Sơ đồ thiết bị chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn. 5 Hình 1.4 Hệ thống máy chiết xuất siêu tới hạn SEPAREX (Pháp). 6 Hình 3.1 SKLM 6 vết diosgenin chuẩn bước sóng 366nm 25 Hình 3.2 Đường chuẩn thể hiện mối liên quan tuyến tính giữa diện tích Peak và lượng chất trên vết. 26 Hình 3.3 Peak sắc ký ứng với vết diosgenin chuẩn 29 Hình 3.4 Peak sắc ký ứng với vết diosgenin trong dung dịch thử 29 Hình 3.5 Peak diosgenin chuẩn. 30 Hình 3.6 Peak diosgenin trong dung dịch pha từ cắn chiết. 30 Hình 3.7 Triển khái sắc ký định lượng các mẫu chiết với đồng dung môi khác nhau 33 Hình 3.8 Biểu đồ hiệu suất chiết xuất diosgenin theo đồng dung môi 34 Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của áp suất tới hiệu suất chiết xuất 35 Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất chiết 37 Hình 3.11 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất chiết xuất. 39 Hình 3.12 Diosgenin kết tinh trong aceton. 40 Hình 3.13 Diosgenin kết tinh trong methanol. 40 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Diosgenin là nguyên liệu để tổng hợp các dẫn xuất steroid [23], [25]. Tuy chất này có mặt trong nhiều họ thực vật, song chỉ có họ Dioscoreaceae (chi Dioscorea) thì mới có giá trị thực tế trong việc khai thác chiết xuất diosgenin [14]. Tại Việt Nam, Nần vàng (Dioscorea collettii Hoof.f.) được đánh giá có triển vọng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin [10]. Việc chiết xuất diosgenin từ thân rễ Nần vàng trong các nghiên cứu trước đây được thực hiện bằng cách chiết với dung môi hữu cơ chloroform. Nhưng trong công nghiệp vấn đề phát sinh với kỹ thuật này là phải loại bỏ dung môi hữu cơ từ các sản phẩm cuối cùng, xử lý chất thải, độc tính của chloroform còn lẫn trong sản phẩm…. Do đó, phương pháp chiết diosgenin một cách nhanh chóng, rẻ tiền và ít độc tính là một yêu cầu cấp thiết. Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn (Supercritical fluild extraction) có nhiều lợi thế hơn các phương pháp tách chiết dung môi lỏng truyền thống như: tính chọn lọc được cải thiện và thân thiện với môi trường. Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là một sự thay thế cần thiết cho việc sử dụng các dung môi hữu cơ thông thường. Đề tài “Nghiên cứu chiết xuất diosgenin từ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn” được thực hiện với những mục tiêu sau: 1. Xây đựng được phương pháp định lượng diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng. 2. Chiết xuất được diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn và khảo sát được ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn 1.1.1. Khái niệm Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là quá trình chiết rắn – khí trong đó dung môi là chất khí ở điều kiện siêu tới hạn. Độ nhớt thấp và sức căng bề mặt gần như bằng không, cho phép dung môi siêu tới hạn thấm vào dược liệu sâu hơn và nhanh hơn so với dung môi lỏng. Hơn nữa việc loại dung môi khí ra khỏi chất chiết cũng đơn giản hơn so với dung môi lỏng. Giản đồ pha của một chất Hình 1.1 là giản đồ pha của 1 chất tinh khiết theo áp suất (P) và nhiệt độ (T) ở dạng tổng quát. Trong đó các pha rắn, lỏng và khí được phân cách nhau bởi đường thăng hoa, đường áp suất nóng chảy và đường áp suất hơi. Cả 3 cùng cắt nhau tại “điểm ba” (T t ). Tại đó ba pha cùng tồn tại, nghĩa là cũng tồn tại ba thể tích mol khác nhau. Hình 1.1 Giản đồ pha của cacbon dioxyd Đường áp suất hơi bắt đầu từ điểm ba và kết thúc tại điểm giới hạn K c . Khi đường áp suất hơi dịch chuyển về phía K c , tỉ trọng pha lỏng giảm dần, tỉ trọng pha khí tăng dần và đạt tới cùng một giá trị tại điểm tới hạn, tức là chỉ còn lại 1 pha duy nhất, gọi là pha siêu tới hạn. Vùng siêu tới hạn bắt đầu từ điểm tới hạn K c , tiếp giáp bởi pha lỏng và pha khí, và ở áp suất rất cao, nó tiếp giáp với pha rắn [1]. [...]... liệu đã xử lý, là nguyên liệu để chiết xuất diosgenin 18 b) Chiết xuất bằng Soxhlet Cân 1 lượng dược liệu đã xử lý, gói lại bằng giấy lọc Chuyển gói dược liệu vào trong Soxhlet, tiến hành chiết xuất diosgenin Sử dụng dung môi n-hexan để chiết xuất c) Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn Cân 1 lượng dược liệu đã xử lý, ngâm trương nở dược liệu trong 1 lượng đồng dung môi (tùy theo điều kiện khảo sát)... suất, nhất là xung quanh điểm tới hạn, làm cho dung môi siêu tới hạn có tính linh hoạt cao Như vậy dung môi siêu tới hạn vừa có khả năng hòa tan tốt (giống chất lỏng), vừa có tốc độ khuếch tán cao (giống chất khí) 5 1.1.2 Thiết bị và nguyên tắc hoạt động Quá trình chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn được thực hiện trong điều kiện thay đổi áp suất và nhiệt độ Thiết bị chiết xuất phải được trang bị bộ... trong khoảng 30 phút – 1 giờ Tiến hành chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn trong các điều kiện khảo sát cụ thể về đồng dung môi, áp suất, nhiệt độ, thời gian … Dịch chiết thu vào bình nón có nút Cất quay loại dung môi ta thu được cắn chiết 2.2.2 Phương pháp định lượng diosgenin a) Định lượng diosgenin trong bột Nần vàng Định lượng diosgenin trong thân rễ Nần vàng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC),... hành chiết xuất dược liệu bằng sCO2 kết hợp với các đồng dung môi trong 2 giờ, tiến hành với 3 mẫu : Mẫu 1 : Chỉ chiết bằng sCO2 Mẫu 2 : Chiết bằng sCO2 kết hợp với đồng dung môi aceton Mẫu 3 : Chiết bằng sCO2 kết hợp với đồng dung môi ethyl acetat Tiến hành xử lí dịch chiết và định lượng diosgenin theo mục 2.2.2a Xác định tính chọn lọc của các đồng dung môi: Tiến hành lấy dịch chiết của 2 đồng dung môi, ... diosgenin trong cắn chiết bằng dung môi siêu tới hạn Tiến hành tương tự với phương pháp định lượng diosgenin trong bột thân rễ Nần vàng Cách tiến hành chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác 50g bột dược liệu đã xử lý, làm ẩm và trương nở dược liệu bằng 50ml đồng dung môi, tiến hành chiết trong các điều kiện khảo sát cụ thể, thu được dịch chiết Cất quay loại bỏ dung môi Dùng cắn chiết thu được, pha dung. .. Hình 1.4: Hệ thống máy chiết xuất siêu tới hạn SEPAREX (Pháp) 7 1.1.3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn Ưu điểm - Độ nhớt thấp, khả năng khuếch tán tốt, khả năng hòa tan cao; áp suất hơi cao, điểm siêu tới hạn của CO2 dễ đạt CO2 là dung môi chiết rẻ tiền, không độc hại và không ô nhiễm - Chất chiết ít bị tác động bởi nhiệt, quá trình chiết nhanh - Khả năng... đi vào bình chiết chứa sẵn dược liệu - Bình chiết cũng được làm nóng để duy trì trạng thái siêu tới hạn của dung môi - Dung môi chảy qua khối dược liệu cố định và hòa tan chất tan - Sau đó dung môi qua khỏi bình chiết từ phía trên, qua một van tiết lưu vào bình tách 6 - Khi áp suất giảm khả năng hòa tan của dung môi giảm và chất chiết được tách ra Để thu được hoàn toàn chất chiết, dung môi được làm... hành xử lí dịch chiết và định lượng diosgenin theo mục 2.2.2a 2.3.3.4 Thời gian chiết xuất Tiến hành chiết xuất dược liệu bằng sCO2 với các điều kiện đã tối ưu (đồng dung môi, áp suất chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất) , thời gian chiết xuất thay đổi, ứng với mỗi thời gian thực hiện 1 mẫu, để đưa ra được những khảo sát cơ bản về sự ảnh hưởng của thời gian chiết xuất đến hiệu suất chiết xuất 23 Tiến hành... ở cả bình chiết và bình tách Điều chỉnh P, t0C Bình ngưng tụ (CO2 lỏng) Bình tách Bình chiết Bình chứa CO2 Làm lạnh Làm nóng Bơm Hình 1.3: Sơ đồ thiết bị chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn Nguyên tắc hoạt động: - CO2 đi từ bình chứa qua bộ phận làm lạnh đến dưới nhiệt độ ngưng tụ để loại bọt khí trước khi tới bơm - Dung môi nén được làm nóng đến nhiệt độ chiết xuất (cao hơn nhiệt độ tới hạn) trước... dung môi siêu tới hạn 2.3.3 Đánh giá ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất 2.3.3.1 Lựa chọn đồng dung môi chiết xuất Nhằm tìm ra đồng dung môi kết hợp với sCO2 cho hàm lượng diosgenin trong dịch chiết cao nhất, cũng như tính chọn lọc của đồng dung môi thông qua hàm lượng diosgenin trong cắn Tiến hành Cân 50g dược liệu đã xử lí cho vào cốc có mỏ 500ml, thêm 50ml đồng dung môi trộn sao . phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn 1.1.1. Khái niệm Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là quá trình chiết rắn – khí trong đó dung môi là chất khí ở điều kiện siêu tới hạn. Độ. với môi trường. Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là một sự thay thế cần thiết cho việc sử dụng các dung môi hữu cơ thông thường. Đề tài Nghiên cứu chiết xuất diosgenin từ Nần vàng bằng dung. thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn và khảo sát được ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn. 2 CHƯƠNG