Nghiên cứu chiết xuất diosgenin từ nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn

ĐẶT VẤN ĐỀDiosgenin là nguyên liệu để tổng hợp các dẫn xuất steroid 23, 25. Tuy chất này có mặt trong nhiều họ thực vật, song chỉ có họ Dioscoreaceae (chi Dioscorea) thì mới có giá trị thực tế trong việc khai thác chiết xuất diosgenin 14.Tại Việt Nam, Nần vàng (Dioscorea collettii Hoof.f.) được đánh giá có triển vọng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin 10. Việc chiết xuất diosgenin từthân rễ Nần vàng trong các nghiên cứu trước đây được thực hiện bằng cách chiết với dung môi hữu cơ chloroform. Nhưng trong công nghiệp vấn đề phát sinh với kỹ thuậtnày là phải loại bỏ dung môi hữu cơ từ các sản phẩm cuối cùng, xử lý chất thải, độc tính của chloroform còn lẫn trong sản phẩm…. Do đó, phương pháp chiết diosgeninmột cách nhanh chóng, rẻ tiền và ít độc tính là một yêu cầu cấp thiết. Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn (Supercritical fluild extraction) có nhiều lợi thế hơn các phương pháp tách chiết dung môi lỏng truyền thống như: tính chọn lọc được cải thiện và thân thiện với môi trường. Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là một sự thay thế cần thiết cho việc sử dụng các dung môi hữu cơ thông thường.Đề tài “Nghiên cứu chiết xuất diosgenin từ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn” được thực hiện với những mục tiêu sau:1. Xây đựng được phương pháp định lượng diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng.2. Chiết xuất được diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạnvà khảo sát được ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT DIOSGENIN TỪ NẦN VÀNG BẰNG DUNG MÔI SIÊU TỚI HẠN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

VƯƠNG MINH VIỆT

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG MINH VIỆT

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT DIOSGENIN TỪ NẦN VÀNG BẰNG DUNG MÔI SIÊU TỚI HẠN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Văn Hân

2 DS Nguyễn Thị Minh Hạnh

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Công Nghiệp Dược

2 Viện Công Nghệ Dược Phẩm

HÀ NỘI - 2015

LỜI CÁM ƠN

Khóa luận được thực hiện tại Bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc gia – Trường Đại học Dược Hà Nội Trong thời gian nỗ lực nghiên cứu hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, ủng hộ, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè và gia đình

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy:

TS Nguyễn Văn Hân – giảng viên Bộ môn Công Nghiêp Dược – Trường Đại

Học Dược Hà Nội đã hết lòng tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp tôi từng bước nâng cao nhận thức và phương pháp luận; động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

TS Nguyễn Hoàng Tuấn – giảng viên bộ môn Dược Liệu – Trường Đại Học

Dược Hà Nội đã chia sẻ, giải đáp những vướng mắc trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành khóa luận

Hà Nội, ngày 7 tháng 4 năm 2015

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ .1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .2

1.1 Đại cương về phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Thiết bị và nguyên tắc hoạt động 5

1.1.3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn 7

1.1.4 Ứng dụng 7

1.2 Tổng quan về diosgenin 8

1.2.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa 8

1.2.2 Công dụng của diosgenin 9

1.3 Tổng quan về cây Nần vàng 9

1.3.1 Vị trí phân loại 9

1.3.2 Đặc điểm thực vật 9

1.3.3 Bộ phận dùng và phân bố 10

1.3.4 Thành phần hóa học 10

1.3.5 Tác dụng sinh học 13

1.3.6 Công dụng 15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Hóa chất 16

2.1.3 Máy móc, thiết bị 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp chiết xuất diosgenin 17

2.2.2 Phương pháp định lượng diosgenin 18

2.2.3 Phương pháp tinh chế 20

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng 20

2.3.2 Xác định hàm lượng diosgenin trong thân rễ Nần vàng 21

2.3.3 Đánh giá ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất 21

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .24

3.1 Thẩm định phương pháp định lượng diosgenin bằng TLC 24

3.1.1 Độ thích hợp hệ thống 24

3.1.2 Khoảng tuyến tính 25

3.1.3 Độ đúng của phương pháp 27

3.1.4 Độ chính xác của phương pháp 31

3.2 Xác định hàm lượng diosgenin trong thân rễ Nần vàng 31

3.3 Đánh giá ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất 32

3.3.1 Đồng dung môi 32

3.3.2 Áp suất chiết xuất 34

3.3.3 Nhiệt độ chiết xuất 36

3.3.4 Thời gian chiết xuất 38

3.4 Tinh chế dịch chiết 39

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .41

4.1 Về khảo sát ảnh hưởng các thông số tới quá trình chiết xuất 41

4.2 Về quy trình tinh chế dịch chiết 42

KẾT LUẬN .43

KIẾN NGHỊ .44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

HDL Lipoprotein tỷ trọng cao ( High Density Lipoproteins )

LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp ( Low Density Lipoproteins )

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang Bảng 1.1 Điểm tới hạn của một số dung môi 4 Bảng 1.2 So sánh các đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu

khác nhau

33

Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng của áp suất chiết lên hiệu suất 32 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất 34 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian lên hiệu suất chiết 35 Bảng 3.10 Khối lượng diosgenin thu được và hiệu suất của quá trình

tinh chế dịch chiết

40

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Tên hình ảnh Trang Hình 1.1 Giản đồ pha của cacbon dioxyd 2 Hình 1.2 Mặt phân chia giữa thể lỏng và thể khí của CO2 biến mất khi

đạt đến điểm tới hạn

3

Hình 1.3 Sơ đồ thiết bị chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn 5 Hình 1.4 Hệ thống máy chiết xuất siêu tới hạn SEPAREX (Pháp) 6 Hình 3.1 SKLM 6 vết diosgenin chuẩn bước sóng 366nm 25 Hình 3.2 Đường chuẩn thể hiện mối liên quan tuyến tính giữa diện tích

Peak và lượng chất trên vết

26

Hình 3.3 Peak sắc ký ứng với vết diosgenin chuẩn 29 Hình 3.4 Peak sắc ký ứng với vết diosgenin trong dung dịch thử 29 Hình 3.5 Peak diosgenin chuẩn 30 Hình 3.6 Peak diosgenin trong dung dịch pha từ cắn chiết 30

Hình 3.7 Triển khái sắc ký định lượng các mẫu chiết với đồng dung môi

khác nhau

33 Hình 3.8 Biểu đồ hiệu suất chiết xuất diosgenin theo đồng dung môi 34

Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của áp suất tới hiệu suất chiết

xuất

35 Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất chiết 37 Hình 3.11

Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất chiết xuất

39

Hình 3.12 Diosgenin kết tinh trong aceton 40 Hình 3.13 Diosgenin kết tinh trong methanol 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Diosgenin là nguyên liệu để tổng hợp các dẫn xuất steroid [23], [25] Tuy chất

này có mặt trong nhiều họ thực vật, song chỉ có họ Dioscoreaceae (chi Dioscorea) thì

mới có giá trị thực tế trong việc khai thác chiết xuất diosgenin [14]

Tại Việt Nam, Nần vàng (Dioscorea collettii Hoof.f.) được đánh giá có triển

vọng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin [10] Việc chiết xuất diosgenin từ thân rễ Nần vàng trong các nghiên cứu trước đây được thực hiện bằng cách chiết với dung môi hữu cơ chloroform Nhưng trong công nghiệp vấn đề phát sinh với kỹ thuật này là phải loại bỏ dung môi hữu cơ từ các sản phẩm cuối cùng, xử lý chất thải, độc tính của chloroform còn lẫn trong sản phẩm… Do đó, phương pháp chiết diosgenin một cách nhanh chóng, rẻ tiền và ít độc tính là một yêu cầu cấp thiết Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn (Supercritical fluild extraction) có nhiều lợi thế hơn các phương pháp tách chiết dung môi lỏng truyền thống như: tính chọn lọc được cải thiện và thân thiện với môi trường Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là một sự thay thế cần thiết cho việc sử dụng các dung môi hữu cơ thông thường

Đề tài “Nghiên cứu chiết xuất diosgenin từ Nần vàng bằng dung môi siêu

tới hạn” được thực hiện với những mục tiêu sau:

1 Xây đựng được phương pháp định lượng diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng

2 Chiết xuất được diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn

và khảo sát được ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn

không, cho phép dung môi siêu tới hạn thấm vào dược liệu sâu hơn và nhanh hơn so

với dung môi lỏng Hơn nữa việc loại dung môi khí ra khỏi chất chiết cũng đơn giản hơn so với dung môi lỏng

Giản đồ pha của một chất

Hình 1.1 là giản đồ pha của 1 chất tinh khiết theo áp suất (P) và nhiệt độ (T) ở dạng tổng quát Trong đó các pha rắn, lỏng và khí được phân cách nhau bởi đường thăng hoa, đường áp suất nóng chảy và đường áp suất hơi Cả 3 cùng cắt nhau tại

“điểm ba” (Tt) Tại đó ba pha cùng tồn tại, nghĩa là cũng tồn tại ba thể tích mol khác nhau

Hình 1.1 Giản đồ pha của cacbon dioxyd

Đường áp suất hơi bắt đầu từ điểm ba và kết thúc tại điểm giới hạn Kc Khi đường áp suất hơi dịch chuyển về phía Kc, tỉ trọng pha lỏng giảm dần, tỉ trọng pha khí tăng dần và đạt tới cùng một giá trị tại điểm tới hạn, tức là chỉ còn lại 1 pha duy nhất, gọi là pha siêu tới hạn Vùng siêu tới hạn bắt đầu từ điểm tới hạn Kc, tiếp giáp bởi pha lỏng và pha khí, và ở áp suất rất cao, nó tiếp giáp với pha rắn [1]

Hình 1.2: Mặt phân chia giữa thể lỏng và thể khí của CO2 biến mất khi đạt đến điểm

tới hạn

Trong đó giai đoạn:

1 Ranh giới giữa 2 pha lỏng - khí dễ dàng quan sát

2 Khi gia tăng nhiệt độ ranh giới giữa hai pha bắt đầu mờ đi nhưng vẫn dễ dàng quan sát được

3 Khi đạt được áp suất tới hạn, nhiệt độ tới hạn thì không còn sự phân cách giữa hai pha, ranh giới giữa hai pha cũng không tồn tại Hình thành một pha đồng nhất gọi là pha siêu tới hạn

Tính chất của dung môi siêu tới hạn

Ở trạng thái siêu tới hạn: Tỉ trọng của dung môi thay đổi theo áp suất và nhiệt độ

 Tỉ trọng càng nhỏ nó càng giống với một chất khí, tỉ trọng càng tăng nó càng giống với một chất lỏng

 Ở nhiệt độ hằng định, tỉ trọng dung môi tăng mạnh theo áp suất, các phần tử dung môi bị nén lại gần nhau hơn và khả năng hòa tan tăng lên

 Các tính chất khác ví dụ độ nhớt, hằng số điện môi cũng thay đổi theo áp suất

và nhiệt độ

Bảng 1.1 Điểm tới hạn của một số dung môi [1]

Dung môi Phân tử lượng

(g/mol)

Nhiệt độ tới hạn ( o C)

Áp suất tới hạn (bar)

Tỉ trọng (g/cm 3 )

Những đặc tính này thay đổi trong một giới hạn rộng khi thay đổi áp suất, nhất

là xung quanh điểm tới hạn, làm cho dung môi siêu tới hạn có tính linh hoạt cao Như vậy dung môi siêu tới hạn vừa có khả năng hòa tan tốt (giống chất lỏng), vừa có tốc độ khuếch tán cao (giống chất khí)

Bình chứa CO2

Bình tách Bình

chiết

Làm lạnh Bơm

Làm nóng

Điều chỉnh

P, t0C Bình ngưng tụ

(CO2 lỏng)

1.1.2 Thiết bị và nguyên tắc hoạt động

Quá trình chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn được thực hiện trong điều kiện thay đổi áp suất và nhiệt độ Thiết bị chiết xuất phải được trang bị bộ phận điều chỉnh

áp suất và nhiệt độ ở cả bình chiết và bình tách

Hình 1.3: Sơ đồ thiết bị chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn

- Bình chiết cũng được làm nóng để duy trì trạng thái siêu tới hạn của dung môi

- Dung môi chảy qua khối dược liệu cố định và hòa tan chất tan

- Sau đó dung môi qua khỏi bình chiết từ phía trên, qua một van tiết lưu vào bình tách

- Khi áp suất giảm khả năng hòa tan của dung môi giảm và chất chiết được tách

ra Để thu được hoàn toàn chất chiết, dung môi được làm nóng đến nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bão hòa để đạt tới trạng thái khí (vì khả năng hòa tan của chất khí

là không đáng kể)

- Chất chiết được rút qua van ở đáy bình tách

- Dung môi dạng khí được tách ra rồi quay trở lại máy nén để lặp lại chu kì chiết tiếp theo

- Hệ thống có thể chứa nhiều bình chiết, nhiều bình tách với các áp suất tách khác nhau

Một số lưu ý:

 Xử lí mẫu chiết: Trong vài trường hợp đặc biệt, mẫu cần chiết có thể được điều

chỉnh pH, hoặc thêm dung môi hoặc làm thấm ướt Nếu hợp chất có tính phân cực, một lượng nhỏ nước được thêm vào để làm thấm ướt mẫu cần chiết giúp việc chiết xuất thêm dễ dàng Nếu hợp chất chiết có tính không phân cực, một lượng dầu nhỏ hoặc chất béo trộn thêm vào mẫu chiết

 Chất cho thêm: CO2 chỉ phù hợp để chiết xuất các hợp chất có độ phân cực kém cho đến trung bình Nếu muốn chiết xuất các chất có tính phân cực cao, cần bổ sung thêm methanol, ethanol hoặc methylen clorid

Hình 1.4: Hệ thống máy chiết xuất siêu tới hạn SEPAREX (Pháp)

1.1.3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn

Ưu điểm

- Độ nhớt thấp, khả năng khuếch tán tốt, khả năng hòa tan cao; áp suất hơi cao, điểm siêu tới hạn của CO2 dễ đạt CO2 là dung môi chiết rẻ tiền, không độc hại

và không ô nhiễm

- Chất chiết ít bị tác động bởi nhiệt, quá trình chiết nhanh

- Khả năng hoà tan và tính chọn lọc của dung môi có thể điều chỉnh được bằng cách thay đổi áp suất và nhiệt độ

- Dễ dàng tách hoàn toàn dung môi ra khỏi các chất chiết Không cần giai đoạn cất loại dung môi

Nhược điểm

- Làm việc ở điều kiện áp suất cao, không thích hợp với mẫu chiết dạng lỏng

- Thiết bị chuyên dụng, đắt tiền

- Chiết xuất mẫu mới: cần có nhiều nghiên cứu tìm các thông số tối ưu để chiết xuất thành công [1]

1.1.4 Ứng dụng

Hiện nay, dung môi sCO2 đang được nghiên cứu, sử dụng trong nhiều lĩnh vực như: tổng hợp hoá học, phân tích, bào chế, đặc biệt trong chiết xuất các hợp chất tự nhiên ứng dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm

 Tách chiết các hoạt chất sử dụng trong dược phẩm:

Người ta dùng dung môi sCO2 để chiết xuất vinblastin - hoạt chất chống ung thư từ cây dừa cạn [1], chiết xuất taxol từ vỏ cây thuỷ tùng, chiết xuất maytansin từ cây

Maytenus senegalensis, chiết xuất các hoạt chất từ cây Bạch quả (Gingko biloba) có tác

dụng chống oxy hoá, chống thiểu năng tuần hoàn não, cải thiện trí nhớ…

 Tách loại bỏ cafein trong chè xanh và cà phê:

Hiện nay, cà phê (Coffea sp.), chè (Camellia sinensis) là những đồ uống được sử

dụng phổ biến Nhưng do hàm lượng cafein cao, gây kích thích thần kinh trung ương, mất ngủ, lo âu, bồn chồn, nhịp tim nhanh… Để khắc phục tác dụng không mong muốn

trên, người ta sử dụng công nghệ chiết xuất bằng sCO2 để loại bỏ, hạ thấp hàm lượng cafein xuống < 0,1% mà vẫn giữ nguyên hương vị tự nhiên ban đầu [1]

 Chiết xuất các dầu thực vật:

Công nghệ chiết xuất siêu tới hạn sử dụng sCO2 đã khắc phục được những nhược điểm về nhiệt độ cao của phương pháp truyền thống Sang Yo Byun đã chiết được dầu

hạt vừng đen (Sesamum indicum L.) công suất 15.000 tấn/năm Sản phẩm thu được có

hàm lượng alpha tocopherol cao hơn hẳn so với sử dụng công nghệ chiết xuất truyền thống [29]

 Chiết xuất tinh dầu, chất thơm trong dược liệu:

Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là hiệu suất chiết cao và chất lượng sản phẩm tốt hơn so với phương pháp cất kéo hơi nước hoặc dùng dung môi hữu cơ

1.2 Tổng quan về diosgenin

1.2.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa

Công thức cấu tạo

 Diosgenin là một sapogenin steroid Được sản xuất thông qua thủy phân saponin bằng acid, base mạnh hoặc các enzyme

Khối lượng phân tử 414.62058 g/mol

Tên IUPAC (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol

 Acid sulfuric đậm đặc hòa tan các saponin và cho thấy màu thay đổi từ vàng, đỏ, lơ-xanh lá hay lơ-tím (Phản ứng Salkowski)

 Sapogenin hòa tan vào 1ml anhydrid acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4

đậm đặc cho màu xanh lá (Phản ứng Liebermann – Burchardt)

1.2.2 Công dụng của diosgenin

Diosgenin được sử dụng như là nguyên liệu để tổng hợp progesteron, pregnenolon, prednisolon, estrogen, testosteron, hydrocortison, dexamethason, betamethason

Diosgenin là một trong những nguyên liệu chính để tổng hợp thuốc chống viêm corticosteroid giúp kháng viêm, lành sẹo các bệnh như phát ban, zona… Diosgenin còn chống oxy hóa ở cơ thể người, giảm mức lipid huyết thanh, ức chế sự phát triền

và ngừng chu kỳ hoạt động của các tế bào u xương ác tính, ung thư biểu mô tế bào gan [28], [27]

Theo một số nghiên cứu diosgenin làm giảm cholesterol trong gan chuột, tăng bằng biết cholesterol thành acid mật và tăng bài tiết của các sterol trung tính [16], [17],[22]

Dioscorea collettii Hook.f

 Tên khoa học của vị thuốc: Dioscorea collettii Hook.f [4]

 Tên khác: Nần vàng, nần vàng, râu hùm [4], [7]

1.3.2 Đặc điểm thực vật

Địa thực vật, thân vặn, quấn trái, không có lông, đôi khi có lông màu vàng dày

và ngắn [28] Thân rễ mọc ngang, phân nhiều nhánh ngắn hình dạng giống gừng, chiều dài đa dạng, dày khoảng 2cm, lõi màu vàng, rễ mảnh dạng sợi [28]

Lá mọc đơn, so le [3], [4], [28] cuống lá dài từ 4-7cm, phiến lá khô hơi đen, kích thước 5-19 (-22) x 3-13 (-16)cm, thường có màng, mặt dưới đôi lúc có lông, nhất là dọc theo các gân, có 7 gân trong đó có 3 gân gốc vươn tới chóp lá mặt lá hình tim, mép lá nguyên hay hơi lượn sóng, đôi khi trong suốt, đỉnh nhọn Các cụm hoa đực đơn độc hoặc 2 hay 3 cụm mọc cạnh nhau Hoa đực: Mọc đơn hay thành cụm hoa xim gồm 2 hay 3 bông, không cuống; lá bắc hình oval dẹt, lá bắc con hình trứng, bao hoa màu vàng, lúc khô thường màu đen, hình đĩa, nhị 3, gắn trong ống bao hoa, chỉ nhị ngắn, bao phấn hình trứng, thon dài khi hoa nở, hình chữ chi; các nhị lép có dạng sợi mảnh Cụm hoa cái dạng bông đơn độc, dài tới 5cm Hoa cái: có nhị lép, bầu hoa hình trụ thon Quả nang quặt lại, nâu bóng, hình trứng ngược hay hình bầu dục, thường hơi góc cạnh, dài 1,6 – 2,1cm, đỉnh cụt, cánh rộng 0,8 – 1,1

cm Hạt nằm ở gần giữa quả, có cánh bao xung quanh

Loài D Collettii Hook.f gồm hai thứ:

 D Collettii var collettii: Mép lá không trong suốt; bao phấn rộng bằng

hoặc gấp đôi khi hoa nở; quả nang hình trứng ngược, đỉnh cụt hay tròn

 D Collettii var hypoglauca: Mép lá trong suốt; bao phấn hẹp lại khoảng

một nửa khi hoa nở; quả nang hình bầu dục, đỉnh tròn

1.3.4 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra trong Nần vàng (D Collettii) có rất nhiều saponin, trong đó có 2 sapogenin chính là diosgenin và yamogenin Hàm lượng diosgenin lên tới 3,8 – 4,2% [13]

Bảng 1.3: Các sapogenin trong thân rễ Nần vàng [24]

STT Tên chất Công thức cấu tạo

Bảng 1.4: Các hợp chất saponin thu được từ dịch chiết ethanol của Nần vàng [21] STT Tên chất Công thức cấu tạo

1 Prosapogenin A của

dioscin

1: R 1 =α-L-Rha, R 2 =R 3 =H 2: R 1 =R 3 =α-L-Rha, R 2 =H 3: R 1 =α-L-Rha, R 2 =β-D-Glc, R 3 =H

Chế phẩm Diosgin từ Nần vàng có tác dụng hạ huyết áp trên hầu hết bệnh nhân có huyết áp cao [6]

b Tác dụng hạ Cholesterol

Cao Nần vàng có tác dụng hạ Cholesterol khá rõ rệt trên mô hình gây tăng cholesterol thực nghiệm Tất cả các chỉ số lipid máu đều trở về trị số bình thường Điều đáng lưu ý là Nần vàng hạ cholesterol, đặc biệt hạ rất mạnh LDL, trong đó lại

có xu hướng tăng HDL (40 ± 2,1 đến 36 ± 2,5 với p< 0,05), do đó hạ được chỉ số cholesterol/HDL (4,3 đến 3,2) [9]

Thử nghiệm Diosgin cho khoảng 200 người bệnh, kết quả xét nghiệm sinh hóa trên 5 chỉ tiêu về lipoprotein trong máu (triglycerid, cholesterol toàn phần, LDL, HDL và Cholesterol toàn phần / HDL) cho thấy Diosgin cho tác dụng tốt, trong quá trình điều trị không thấy có tai biến, tác dụng phụ nào [6]

c Tác dụng chống viêm

Cao Nần vàng với liều 300mg/kg cho chuột bị gây viêm bằng dextran uống 3 lần (24 giờ, 3 giờ, 30 phút trước khi gây viêm) có tác dụng giảm viêm rõ rệt, tác dụng này tương đương với prednisolon liều 70mg/kg uống 1 lần 30 phút trước khi gây viêm [9]

Nần vàng cũng được sử dụng để chống viêm trong đau do viêm khớp, được khuyến cáo như 1 biện pháp khắc phục để chống viêm khớp, tăng lưu thông máu, giãn cơ, rất hữu dụng trong đau do thấp khớp và tê chân tay Ngoài ra nó còn được

sử dụng như 1 chất chống viêm cho các tổn thương ngoài da, bao gồm cả eczema [15]

d Tác dụng gây giãn cơ trơn

Cao Nần vàng gây giãn cơ trơn của mạch và ruột [8]

 Trên ruột thỏ cô lập:

Liều 0,1; 0,2; 0,3ml dung dịch cao Nần vàng 5% nhỏ vào 50ml dịch nuôi ruột gây giãn rõ rệt Tác dụng hết sau 10-15 phút Liều 0,5ml trở lên gây giãn không hồi phục

 Trên mạch tai thỏ cô lập:

Liều 0,1-0,2ml dung dịch cao Nần vàng 5% (được truyền lẫn vào dòng chảy của dung dịch nuôi tai) gây tăng rõ rệt số giọt chảy (gấp 3-4 lần) Tác dụng hết sau 10-15 phút Liều 0,5 ml trở lên gây giãn mạch, nhiều trường hợp giãn không hồi phục [8]

e Ảnh hưởng đến hoạt động của tim tại chỗ

Thí nghiệm trên tim ếch, thuốc được tiêm vào túi bạch huyết với thể tích không quá 0,5ml Cho kết quả:

 Trên tim bình thường:

Liều 20-30-40mg/kg cân nặng, hoạt động của tim hầu như không thay đổi Liều 100mg/kg cân nặng gây rối loạn nhịp tim ở đa số ếch thử, tim đập chậm lại, biên độ co tăng gấp 2-3 lần so với bình thường [8]

 Trên suy tim:

70% số ếch thử có tim được hồi phục, nhịp tim đều trở lại, biên độ tăng cao, thậm chí có trường hợp đập mạnh hơn lúc bình thường, ở mức liều 30-40mg/kg cân nặng [8]

f Tác dụng chống ung thư

Tám hợp chất: Protoneodioscin, protodioscin, protoneogracillin, protogracillin

và methyl protoneodioscin, methyl protodioscin, methyl protoneogracillin, và

methyl protogracillin được chiết từ thân rễ của Dioscorea collettii cho thấy các tác

dụng gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư K562 trong ống nghiệm [19] Các nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư của saponin steroid từ thân rễ của Nần vàng đã cho thấy methyl protoneogracillin và gracillin có khả năng gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư ở người bị bệnh bạch cầu, ung thư tuyến tiền liệt [17] Gần đây, một nghiên cứu hệ thống cho biết methyl protogracillin đã được

sử dụng ở Viện ung thư quốc gia Mỹ làm thuốc chống ung thư [20]

g Tác dụng chống nấm

14 saponin steroid được phân lập từ thân rễ của Nần vàng: cho thấy hoạt tính kháng nấm gây biến dạng hình thái của sợi nấm và bào tử của Pyricularia oryzue (một loại nấm phytopathogenic gây bệnh đạo ôn) trong đó có 3 saponin sporostanol, 9 - saponin furostanol, và 2 - glycosid pregnan [18], [19], [20]

1.3.6 Công dụng

Trong đông y, Nần vàng có vị khổ, tính bình, tác dụng giải độc, tiêu thũng, tán ứ chỉ thống, khu phong trừ thấp Cây được dùng trị đau khớp xương do phong thấp, đau lưng gối, cảm nhiễm đường tiết niệu, bạch đới, rắn độc cắn [4]

Cao của thân rễ có tác dụng chống viêm và làm giảm cholesterol trong máu [3]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG,

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Thân rễ Nần vàng được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 60oC

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.1 Tên và nguồn gốc của các hóa chất dùng trong thí nghiệm

STT Tên hóa chất Nguồn gốc

2.1.3 Máy móc, thiết bị

Máy móc

 Hệ thống chiết xuất siêu tới hạn Separex (Pháp)

 Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ)

 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Đức)

 Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức)

 Tủ sấy MEMMERT (Đức)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết xuất diosgenin

a) Chuẩn bị dược liệu

Thân rễ Nần vàng sau khi thu hoạch, rửa bằng nước cho sạch, loại bỏ rễ con, thái thành lát mỏng, sấy tới khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 60oC (chú ý: Tránh sấy ở nhiệt độ trên 70oC vì sẽ khiến hàm lượng diosgenin bị giảm mạnh [12]) Xay nhỏ dược liệu khô ta thu được bột dược liệu Nần vàng

Thủy phân bột dược liệu Nần vàng:

Cân 1kg bột dược liệu Nần vàng vừa thu được, cho vào bình cầu cỡ lớn, có gắn ống sinh hàn, thêm vừa đủ dung dịch acid H2SO4 10% qua ống sinh hàn cho ngập dược liệu, đun hồi lưu trong 4 giờ Để nguội bình phản ứng, lấy bột dược liệu sau thủy phân rửa qua bằng nước để loại bớt acid H2SO4, kiềm hóa bột dược liệu bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới trung tính, thử bằng giấy quì tím Sấy khô bột dược liệu vừa thu được, ta thu được bột dược liệu đã xử lý, là nguyên liệu để chiết xuất diosgenin

b) Chiết xuất bằng Soxhlet

Cân 1 lượng dược liệu đã xử lý, gói lại bằng giấy lọc Chuyển gói dược liệu vào trong Soxhlet, tiến hành chiết xuất diosgenin Sử dụng dung môi n-hexan để chiết xuất

c) Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn

Cân 1 lượng dược liệu đã xử lý, ngâm trương nở dược liệu trong 1 lượng đồng dung môi (tùy theo điều kiện khảo sát) trong khoảng 30 phút – 1 giờ

Tiến hành chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn trong các điều kiện khảo sát cụ thể về đồng dung môi, áp suất, nhiệt độ, thời gian … Dịch chiết thu vào bình nón có nút Cất quay loại dung môi ta thu được cắn chiết

2.2.2 Phương pháp định lượng diosgenin

a) Định lượng diosgenin trong bột Nần vàng

Định lượng diosgenin trong thân rễ Nần vàng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), cách tiến hành như sau:

 Bản mỏng: silica gel 60 F254

 Hệ pha động: chloroform – aceton – n-hexan (90:5:5)

 Dung dịch thử: Cân chính xác 10g bột dược liệu đã xử lý, chiết với n-hexan

trong bình Soxhlet dung tích 50ml trên cách thủy trong 6 giờ, cất thu hồi dung môi lấy cắn Cân chính xác khoảng 0,05g cắn thu được vào bình định mức 10ml, thêm khoảng 6ml ethanol 96%, hòa tan cắn bằng cách siêu âm 30 phút, thêm ethanol 96% tới vạch định mức Dùng dung dịch thu được để chấm sắc ký

 Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 20mg diosgenin chuẩn, hòa tan trong bình định

mức 10ml bằng dung dịch ethanol 96% sau đó pha loãng 2 lần, ta thu được dung dịch diosgenin chuẩn với nồng độ 0,01g/10mL (dung dịch chuẩn dùng trong ngày)

 Bản silica gel 60 F 254 (10cm×5cm) đã được hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút được chia vạch thành 2 băng, chấm lần lượt mỗi băng 10 µL dung dịch thử (băng 2) và dung dịch chuẩn (băng 1) chấm thành vạch rộng 1cm, cao 0,3cm

 Thuốc thử hiện màu: Dùng thuốc thử ceri sulfat (pha theo DĐVN IV)

Hòa tan 10g ceri sulfat (TT) trong 850 ml dung dịch acid sulfuric 10% (TT) bằng cách đung nóng nhẹ Để nguội, thêm dung dịch acid sulfuric 10% (TT) cho vừa đủ 1000 ml

Tiến hành sắc ký: Triển khai sắc ký đến khi dung môi chạy được 9cm, lấy bản mỏng ra, sấy ở nhiệt độ 50oC để bay dung môi Phun thuốc thử hiện màu đều cả bản mỏng, sấy bản mỏng trong tủ sấy ở nhiệt độ 90oC, sau khoảng 20 phút, các vết diosgenin sẽ hiện màu Đưa bản mỏng đã hiện vết vào máy soi vết, dùng đèn bước sóng 366nm ta thu được các sắc ký đồ của vết chuẩn và vết thử So sánh diện tích peak sắc ký của peak diosgenin chuẩn với peak diosgenin trong dung dịch thử ta tính toán được lượng hàm lượng diosgenin trong bột dược liệu theo công thức sau:

Trong đó: St: Diện tích peak diosgenin của mẫu thử

Sc: Diện tích peak diosgenin của mẫu chuẩn

mc: Khối lượng diosgenin chuẩn

mt: Khối lượng cắn chiết pha mẫu thử

mcắn: Tổng khối lượng cắn chiết thu được

mDL: Khối lượng bột dược liệu ban đầu

B: Hàm ẩm dược liệu

Mỗi mẫu ta thực hiện 3 lần lấy giá trị trung bình