Với nguồn nguyên dược liệu sẵn có ở Việt Nam cùng với dung môi carbon dioxyd rẻ tiền, dễ kiếm, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Chiết xuất được artemisinin từ lá Thanh cao
Trang 1BÀI NGHIÊN CỨU *
Nghiên cứu chiết xuất artemisinin
từ lá Thanh cao hoa vàng
bằng carbon dioxyd siêu tứi hạn
Phạm Thị Hiển, Nguyễn Văn Hân
Trường Đại học Dược Hà Nội
SUMMARY
Artemisinin is the most commonly drug for treatment of malaria In this research, we have researched on extraction ofortemisinin from Artemisia annua L using supercritical fluid Artemisinin was successfully extracted by supercritical fluid composed of carbon dioxide and 50 ml n-hexơnein 2 hours with temperature and pressure fixed at 50°c and 200 bar, respectively.
Từ khóa: Artemisia annua, artemisinin, carbon dioxyd siêu tới hạn, Thanh cao hoa vàng.
Đặt vấn đề
Artemisinin là thuốc chống sốt rét có hiệu quả
cao, đặc biệt với ký sinh trùng sốt rét Plasmodium
falciparum đã kháng cloroquin Ngày nay, artemisinin
và các dẫn xuất vẫn đang là lựa chọn hàng đầu để
điểu trị bệnh sốt rét và mở ra nhiều triển vọng điểu
trị mới: kháng tế bào ung thư, chống oxỵ hóa Do
vậy nhu cẩu sử dụng artemisinin và dẫn chất ngày
càng cao.Trên thế giới, có rất nhiều tác giả nghiên cứu
sản xuất artemisinin Trong đó, chiết xuất artemisinin
từ lá của cây Thanh cao hoa vàng (Artemisiơ annuo L)
là phương pháp chủ yếu Việc dùng dung môi hữu
cơ để chiết xuất artemisinin ngày càng chứng tỏ có
nhiều nhược điểm: độc hại, dễ cháy nổ và ô nhiễm
môi trường Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn
(như carbon dioxyd siêu tới hạn) là một sự thay thế
cần thiết cho việc sửdụng các dung môi hữu cơ thông
thường [4]
Với nguồn nguyên dược liệu sẵn có ở Việt Nam
cùng với dung môi carbon dioxyd rẻ tiền, dễ kiếm,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Chiết
xuất được artemisinin từ lá Thanh cao hoa vàng bằng
dung môi carbon dioxyd siêu tới hạn và khảo sát ảnh
hưởng của một số yếu tố đến quá trình chiết xuất
Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liẹu
Lá cây Thanh cao hoa vàng (Artemisiơ onnua L.)
được thu mua ở Vĩnh Tường-Vĩnh Phúc
Aceton, cloroform, ethyl acetat n-hexan, natri
hydroxyd (tinh khiết hóa học-Trung Quốc); artemisinin
chuẩn 993% (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương),
ethanol 96%, carbon dioxyd 99,9% (Việt Nam)
Thiết bị
Hệ thong chiết xuất siêu tới hạn Separex (Pháp, dung tích bình chiết 1 lít); Máy cất quay chân không Bùchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ); Máy đo quang phổ UV-VIS Hitachi (Mỹ);Tủ sấy điện MEMMERT (Đức)
Phương pháp nghiên cứu
Xác định hàm lượng artemisinin trong lá Thanh cao hoa vàng bằng phương pháp đo quang kết hợp sắc ký lớp mỏng theo Dược điển Việt Nam IV [1], Chiết xuất artemisinin từ lá Thanh cao hoa vàng bằng carbon dioxyd siêu tới hạn, tham khảo phương pháp của các tác giả M Kohler (1997) [3] và Y L Lin (2006) [5] Các bước tiến hành như sau:
Chuẩn bị nguyên liệu: Lá Thanh cao hoa vàng được
sấy khô ở điểu kiện nhiệt độ 50-60°C trong 1 giờ, xay thành bột thô, rây qua cỡ rây 1 mm
Chiết xuất 100 gam bột nguyên liệu được làm ẩm
với 50 ml đổng dung môi, ủ trong 1 giờ Sau đó nạp nguyên liệu vào bình chiết.Tiến hành chiếtxuất và thu lấy sản phẩm Trường hợp không dùng đổng dung môi, cắn chiết được hòa vào 30 ml n-hexan nóng rồi
để kết tinh trong 48 giờ Nếu dùng đổng dung môi thì dịch chiết được cất loại hết đổng dung môi, hòa cắn thu đượcvào 30 ml n-hexan nóng rổi để kết tinh trong
48 giờ Lọc lấy tinh thể artemisinin, rửa tinh thể bằng xăng công nghiệp nóng thu được artemisinin thô
Tinh chế artemisinin: Artemisinin thô được hòa
tan trong 5 phần ethanol 96% trong cốc có mỏ, thêm than hoạt với lượng bằng 5% artemisinin thô Đun cách thủy và khuấy trong 10 phút Lọc nóng qua phễu Buchner để loại than hoạt, rửa bâ than bằng ethanol nóng và thu lấy dịch lọc Gộp dịch lọc và dịch rửa, để
Trang 2ầ
kết tinh ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, lọc lấy tinh thể trên phễu Buchner, rửa tinh thể 2 lẩn bằng ethanol, sấy khô ở nhiệt độ 60°c, thu được artemisinin tinh khiết
Kết quả nghiên cúu
Xác định hàm lượng artemisinin trong lá Thanh cao hoa vàng
Hàm lượng artemisinin trong lá Thanh cao hoa vàng xác định được là 0,48%
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết
Ảnh hưởng của đổng dung môi: Sử dụng 3 đổng dung môi là: ethanol 96%, n-hexan và aceton Kết quả được
trình bày trong bảng 1
Báng 1 Ảnh hưởng củũ đổng dung môi đễn hiệu suất chiết (n=3)
Đồng dung môi Khối lượng artemisinin chỉết được (mg) Hiệu suất chiết (%)
Kết quả cho thấy sử dụng đổng dung môi cho hiệu suất chiết tốt hơn khi chỉ sử dụng carbon dioxỵd siêu tới hạn Đổng dung môi n-hexan cho hiệu suất chiết tốt nhất (81,1%) Do vậy, n-hexan được sử dụng làm đổng dung môi chiết cho các thí nghiệm tiếp theo
Ảnh hưởng của áp suất chiết: Tiến hành chiết xuất ở các điểu kiện áp suất khác nhau: 100±10 bar; 150±10
bar; 200±10 bar; 250±10 bar; 300±10 bar Kết quả được trình bày trong bảng 2:
Báng 2 Ảnh hưởng cùa áp suất đễn hiệu suất chiểt (n=3)
Áp suất chiết (bar) Khối lượng artemisinin chỉết được (mg) Hiệu suất chiết
(%)
Kết quả bảng 2 cho thấy: Khi tăng dẩn áp suất chiết từ 100 bar đến 200 bar thì hiệu suất chiết tăng lên từ 62,4% đến 81,1%.Tuy nhiên, tiếp tục tăng áp suất đến 300 barthì hiệu suất chiết hầu như không thay đổi Áp suất 200 bar được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo
Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết Làm các thí nghiệm khảo sát với các nhiệt độ chiết khác
nhau: 40; 50; 60°c Kết quả được trình bày trong bảng 3
Bảng 3 Ảnh hưởng củo nhiệt độ chiắđến hiệu suất chiồ (n=3)
Nhiệt độ chiết r o Khối lượng artemisinin chiết được (mg) Hiệu suấtchỉết(%)
Kết quả bảng 3 cho thấy: Khi tăng nhiệt độ tại bình chiết từ40 lên 50°c, hiệu suất chiết tăng nhanh từ 69,4% đến 81,1%.Tăng tiếp nhiệt độ lên 60°c thì hiệu suất chiết có xu hướng giảm Vậy nhiệt độ 50°c được lựa chọn cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo
Ảnh hưởng của thời gian chiết: Làm các thí nghiệm khảo sát với các thời gian chiết khác nhau: 1,2,3,4,6 giờ
Kết quả được trình bày trong bảng 3
Trang 3BÀI NGHIÊN CỨU
Bảng 4 Ảnh hưởng củũ thời gian chiết đến hiệu suát chiết (n=3)
Thời gian (giờ) Khối lượng artemisinin chiết được (mg) Hiệu suất chiết (%)
Kết quả bảng 4 cho thấy: Tầng thời gian chiết thì
hiệu suất chiết tăng từ 56,7% đến 82,1% Sau 2 giờ,
hiệu suất chiết đạt 81,1% và hẩu như không tăng
thêm nữa Vậy thời gian phù hợp nhất là 2 giờ
Như vậy, từ kết quả khảo sát ở trên, các thông
số phù hợp cho quy trình chiết là: đổng dung môi
n-hexan, áp suất 200 bar, nhiệt độ 50°c, thời gian
2 giờ
Đánh giá chất lượng sản phẩm artemisinin
Sản phẩm artemisinin thu được có các đặc điểm
sau:
Tính chất: bột kết tinh, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 156-157°c
Hàm lượng: 99,44%
Nhận xét: Sản phẩm artemisinin thu được đạt yêu
cẩu về hình thức cảm quan, nhiệt độ nóng chảy và
hàm lượng artemisinin (> 98,5%) theo tiêu chuẩn của
Dược điển Việt Nam IV
Bàn luận
Chiết xuất artemisinin từ lá Thanh cao hoa vàng
theo phương pháp truyền thống bằng n-hexan hoặc
xăng công nghiệp, cẩn dùng lượng lớn dung môi (tỉ
lệ dung môi/dược liệu khoảng 15/1), nhưng hiệu suất
chiết thường chỉ đạt 60% [2], [4] Ngoài ra, các dung
môi này dễ cháy nổ và độc hại Phương pháp chiết
xuất artemisinin từ lá Thanh cao hoa vàng sử dụng
dung môi siêu tới hạn có các ưu điểm sau:
Dung môi carbón dioxyd rẻ tiển, không độc hại,
thân thiện với môi trường
Lượng đồng dung môi sử dụng ít (50 ml, tỉ lệ 1/2
so với dược liệu)
Hiệu suất chiết cao (đạt trên 80%)
Carbon dioxyd siêu tới hạn là dung môi ít phân cực và ít hòa tan artemisinin Phải dùng thêm đổng dung môi chiết để làm tăng hiệu suất chiết Qua khảo sát đâ chọn được đổng dung môi n-hexan cho hiệu suất chiết tốt nhất Mặc dù ethanol 96% và aceton có khả năng hòa tan artemisinin tốt hơn n-hexan, nhưng n-hexan lại tan tốt hơn trong carbon dioxyd siêu tới hạn Ngoài ra, thời gian, áp suất và nhiệt độ cũng ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết
Theo kết quả ở bảng 2, với áp suất chiết thấp, carbon dioxyd chưa hoàn toàn đạt tới trạng thái siêu tới hạn như mong muốn, nên hiệu suất chiết thấp Khi
áp suất chiết đạt trên 200 bar, hiệu suất chiết tăng và
ổn định
Theo kết quả ở bảng 4, hiệu suất chiết tăng theo thời gian Tuy nhiên, với dung môi carbon dioxyd siêu tới hạn thì sau 2 giờ gẩn như quá trình chiết đạt tới trạng thái bão hòa Do vậy, tăng tiếp thời gian thì hiệu suất chiết tăng lên không đáng kể Các kết quả thu được cũng tương tự với các nghiên cứu đã công bố trước đây [3], [5]
Kết luận
Artemisinin đă được chiết xuất thành công từ lá Thanh cao hoa vàng bằng carbon dioxyd siêu tới hạn Qua khảo sát đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình chiết là sử dụng đổng dung môi n-hexan (tỉ lệ 1/2 so với dược liệu), áp suất 200 bar, nhiệt độ 50°c và thời gian 2 giờ Artemisinin thu được
có hàm lượng đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (99,44%)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Y té (2009), Dược điền Việt Nam IV, tr 895-896.
2 Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Tập 1 ,tr 145-241.
3 Kohler M et al (1997), "Extraction of artemisinin and artemisinic acid from Artemisia annua L using supercritical carbon dioxide",
Journal of Chromatography A, 785, pp 353-360.
4 Lapkin A A et al (2006), "Comparative assessment of technologies for extraction of Artemisinin", Journal of Natural Products,
69(11), pp 1653-1664.
5 Lin Y L et al (2006), "Response surface methodology to supercritical fluids extraction of artemisinin and the effects on rat hepatic
stellate cell in vitro", Journal of Supercritical Fluids, 39, pp 48-53.